蔣建文，任志剛，鄭樹森

腸道微生態(tài)與肝癌關(guān)系研究新進展

蔣建文，任志剛，鄭樹森

由于肝臟與腸道緊密的解剖與功能關(guān)系，腸道微生物通過肝-腸循環(huán)和微生態(tài)-肝臟軸與宿主相互作用，在肝臟炎癥、慢性纖維化及腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。腸道微生態(tài)失衡促進肝癌進展，這是國際上實驗動物肝癌發(fā)病機制的突破性進展。腸道微生物中關(guān)鍵功能菌可能成為肝癌診治的新型生物標(biāo)志物和治療靶點。隨著第二代高通量測序技術(shù)的發(fā)展，元基因組學(xué)研究從極大的深度和廣度為我們認(rèn)識腸道菌群與肝癌的關(guān)系開辟了新的途徑。

腸道微生態(tài)；肝臟腫瘤；元基因組學(xué)；炎-癌轉(zhuǎn)變；整合肝腸病學(xué)

肝癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居所有腫瘤的第7位，病死率為第3位［1］。我國HCC大多數(shù)與HBV感染相關(guān)，HCC發(fā)病隱匿，就診時多是中晚期，療效很差。目前國內(nèi)外HCC發(fā)生發(fā)展的機制研究主要集中在肝炎病毒、化學(xué)毒物及代謝物等致病因子引起的肝細(xì)胞基因突變、腫瘤干細(xì)胞及炎-癌轉(zhuǎn)變的分子機制等方面。近期研究證明腸道微生態(tài)變化對慢性肝臟病變進展有重要影響［2］，但腸道菌群是否參與HCC的發(fā)生發(fā)展尚不清楚，本文就該方向的研究綜述如下。

1 腸道微生態(tài)及其與慢性肝病的關(guān)系

人體腸道內(nèi)定植著數(shù)目龐大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的微生物群落。腸道菌群與機體存在共生關(guān)系，是人體最為重要的微生態(tài)系統(tǒng)，Eckburg［3］提出腸道菌群相當(dāng)于人體的一個重要代謝“器官”。腸道菌群和宿主共生并共進化過程中，從營養(yǎng)、代謝及免疫等諸多方面影響人體健康，腸道微生態(tài)失衡與人體多種疾病如感染性疾病、肥胖癥、糖尿病、肝病、冠心病以及腫瘤等存在密切關(guān)系［4-5］。

在人體內(nèi)，肝臟與腸道微生態(tài)相互協(xié)調(diào)，相互影響。腸道微生物通過肝-腸循環(huán)和微生態(tài)-肝臟軸，與宿主相互作用，在肝臟炎癥、慢性纖維化及肝硬化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［2］。Lin等［6］的研究證實在伴刀豆球蛋白A誘導(dǎo)的大鼠急性肝炎過程中，破壞腸道微生態(tài)可加強脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）與肝臟Kuffer細(xì)胞上的Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）結(jié)合，進而啟動后續(xù)炎癥信號通路，加重肝炎病變，而應(yīng)用抗生素抑制腸道菌群能減輕肝臟炎癥損傷。Chen等［7］發(fā)現(xiàn)肝硬化患者腸道菌群結(jié)構(gòu)與正常對照存在顯著差異，且腸道微生態(tài)失衡程度與肝硬化病情嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)，毛螺菌、雙歧桿菌等益生菌在肝硬化患者中明顯減少，而腸桿菌、鏈球菌等潛在致病菌則明顯增加。

2 動物實驗研究證實腸道微生態(tài)失衡參與HCC進展

王紅陽團隊、Dapito和Darnaud 等在動物實驗層面證實腸道微生態(tài)失衡促進HCC進展［8-11］，這是國際上實驗動物HCC發(fā)病機制的突破性進展。2010年王紅陽團隊的Yu等［8］第一次發(fā)表腸道內(nèi)毒素促進HCC發(fā)生的研究，他們發(fā)現(xiàn)二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine， DEN）誘導(dǎo)的HCC小鼠模型LPS水平上升，并明確骨髓來源的肝臟Kuffer細(xì)胞是LPS的作用靶點，Kuffer細(xì)胞產(chǎn)生促炎調(diào)節(jié)因子TNF-α與IL-6，通過LPS-TLR4信號通路產(chǎn)生了旁分泌活化的促腫瘤細(xì)胞因子，激活了癌前肝細(xì)胞增殖。證明在DEN誘導(dǎo)的早期肝損害過程中，通過移植TLR4-/-小鼠的骨髓，抑制了Kuffer細(xì)胞膜上的TLR4活化，進而明顯減輕DEN誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的肝臟病變；采用TLR4-/-小鼠進行實驗，炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生與隨后的腫瘤形成明顯減少。

2012年王紅陽團隊的Zhang等［9］發(fā)現(xiàn)使用益生菌可改善腸道微環(huán)境，減少腸道炎癥，同時減少肝臟腫瘤的生長與增殖。益生菌不僅可以抑制LPS等病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns， PAMPs）由腸道易位至肝臟，還可激活損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular patterns， DAMPs），如高遷移率族蛋白1（high mobility group box1， HMGB1），使促炎與抗炎細(xì)胞因子減少，繼而減緩了肝臟中的腫瘤相關(guān)性炎癥。他們發(fā)現(xiàn)破壞腸道穩(wěn)態(tài)會促進HCC的進展，通過益生菌改善腸道穩(wěn)態(tài)能夠減緩HCC的進展。

同年Dapito等［10］發(fā)現(xiàn)腸道菌群通過肝星狀細(xì)胞上的TLR4增加肝臟有絲分裂原免疫調(diào)節(jié)的表達和阻礙凋亡而促進了DEN誘導(dǎo)的HCC的進展，且通過實驗證實非骨髓來源的肝星狀細(xì)胞膜上的TLR4介導(dǎo)產(chǎn)生炎癥信號對慢性炎癥導(dǎo)致的HCC有促進作用。非骨髓來源的肝星狀細(xì)胞與肝細(xì)胞是LPS的主要作用靶點，肝星狀細(xì)胞的TLR4介導(dǎo)損傷后的再生反饋導(dǎo)致肝臟細(xì)胞代償性增殖，肝細(xì)胞的TLR4阻止了肝臟細(xì)胞與前惡性細(xì)胞的凋亡，而腸道的無菌狀態(tài)可有效抑制HCC的發(fā)展，明顯減小HCC體積。這表明腸道菌群可作為肝臟疾病向HCC進展的治療靶標(biāo)。隨后Darnaud等［11］提出了靶向腸道微生態(tài)治療可能阻止HCC的進展的科學(xué)設(shè)想。

2013年Yoshimoto等［12］報道在肥胖相關(guān)的HCC小鼠模型中，腸道菌群變化使脫氧膽酸（deoxycholic acid， DCA）水平增加，DCA是腸道菌群代謝膽汁酸的產(chǎn)物，已知DCA會造成肝細(xì)胞DNA損傷引發(fā)HCC的發(fā)生，同時腸道菌群變化引起肝星狀細(xì)胞中出現(xiàn)衰老相關(guān)分泌表型（senescence-associated secretory phenotype， SASP），引起多種炎癥和腫瘤因子分泌，導(dǎo)致小鼠發(fā)生HCC。去除衰老的肝星狀細(xì)胞或SASP誘導(dǎo)因子缺失可降低HCC發(fā)生率。

3 腸道微生態(tài)失衡參與HBV相關(guān)性HCC（HBV-related HCC， HBV-HCC）進展的假說

流行病學(xué)調(diào)查亦提示腸道微生態(tài)失衡和HCC具有內(nèi)在聯(lián)系。多項研究顯示糖尿病和肥胖患者腸道微生態(tài)均出現(xiàn)不同程度的失衡［13-14］。Welzel等［15］通過流行病學(xué)調(diào)查顯示，在美國糖尿病和肥胖已成為大規(guī)模人群發(fā)生HCC的最大危險因素，在總數(shù)上已經(jīng)超過肝炎等病因?qū)е碌腍CC。上述結(jié)論可供HBV-HCC發(fā)生和發(fā)展的研究借鑒。

HBV是HBV-HCC 的重要原因，但是HBV本身并不具有細(xì)胞致病能力，其引起的肝臟炎性損傷一般被認(rèn)為是宿主的免疫系統(tǒng)針對HBV 抗原的免疫反應(yīng)，HBV 的DNA 能夠整合進肝細(xì)胞的DNA中，容易產(chǎn)生免疫逃逸，引發(fā)持續(xù)的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致慢性肝炎，進而進展為肝硬化。肝硬化可導(dǎo)致肝功能異常，腸道靜脈淤血和滲出增加，腸道正常菌群組成和比例發(fā)生變化，腸道菌群可通過產(chǎn)生內(nèi)毒素和其他代謝物進一步加重對肝臟的損傷［16］。從整合肝腸病學(xué)的觀點看，HBV通過機體免疫系統(tǒng)引起的慢性乙型肝炎及肝硬化，對腸道微生態(tài)產(chǎn)生負(fù)面影響，腸道微生態(tài)存在著慢性失衡，進而通過免疫、代謝及營養(yǎng)等多途徑影響炎性或者硬化狀態(tài)的肝臟，失衡的腸道菌群可能作為HBV 致癌的協(xié)同因素即通過“肝-腸軸”促進肝細(xì)胞癌變的局部微環(huán)境的形成，進而促進HCC的進展。這就是本文作者蔣建文提出的假說——腸道微生態(tài)失衡參與乙型肝炎相關(guān)性HCC的進展。

4 腸道微生物中關(guān)鍵功能菌可能成為HCC的新型生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)

在HCC的診斷和治療中，尋找精準(zhǔn)的生物標(biāo)志物和治療靶點至關(guān)重要。腸道未知微生物極多，其關(guān)鍵菌群可能具有重要的研究前景。Lu等［17］發(fā)現(xiàn)腸道中雙歧桿菌與腸桿菌比值（B/E值，B/E）在肝病發(fā)展中可用于跟蹤腸道微生態(tài)失調(diào)的水平。Zhu等［18］發(fā)現(xiàn)非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steato hepatitis， NASH）患者腸道中產(chǎn)酒精細(xì)菌比例上升，導(dǎo)致血液中內(nèi)源性乙醇濃度升高，提示產(chǎn)酒精細(xì)菌參與NASH發(fā)病，可能作為干預(yù)靶點或疾病標(biāo)記物。Arumugam等［19］應(yīng)用腸道菌群的宏基因組測序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，人類腸道微生物包含300萬個基因，是人類基因的150倍，同時發(fā)現(xiàn)人類腸道內(nèi)包括3類不同的細(xì)菌生態(tài)系統(tǒng)，稱之為“腸型”，包括bacteroides（腸型1）、prevotella（腸型2）和ruminococcus（腸型3）3種類型?！澳c型”結(jié)構(gòu)與功能是相符的，提示腸道菌群標(biāo)志物具有潛在的診斷作用，腸道菌群“腸型”構(gòu)成可以反映人群的疾病易感性。

2013年11月22日，Science連續(xù)發(fā)表3篇關(guān)于腸道微生態(tài)與腫瘤治療反應(yīng)的文章。其中，Iida 等［20］發(fā)現(xiàn)腸道共生菌通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境來控制腫瘤對于治療的反應(yīng)，Pennisi［21］指出腸道共生菌有助于癌癥的治療，Viaud 等［22］指出腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)環(huán)磷酰胺的抗腫瘤免疫作用。這一發(fā)現(xiàn)表明腸道微生態(tài)有助于機體形成抗腫瘤的免疫反應(yīng)。2016 年2 月Li 等［23］報道新型益生菌組合prohep可以有效抑制小鼠的肝臟腫瘤生長。這組益生菌的抗癌功能可能與促進抗炎IL-10 細(xì)胞因子的分泌和抑制促炎細(xì)胞Th17 細(xì)胞的分化和IL-17細(xì)胞因子的分泌有關(guān)。因此，靶向腸道微生物標(biāo)記物可能是HCC診斷的有力工具，通過對靶向微生物進行調(diào)節(jié)可以成為治療HCC的新的靶標(biāo)。

5 第二代高通量測序技術(shù)為認(rèn)識腸道菌群和HCC的關(guān)系開辟了新的途徑

腸道菌群復(fù)雜多樣，絕大多數(shù)厭氧生長，大多數(shù)細(xì)菌目前條件下無法培養(yǎng)。元基因組學(xué)是指通過直接從環(huán)境樣品中提取全部微生物的DNA，構(gòu)建元基因組文庫，利用基因組學(xué)的研究策略研究環(huán)境樣品所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能。第二代高通量測序技術(shù)為深入研究人類腸道微生態(tài)的元基因組提供了快速、準(zhǔn)確及可行的方法。Illumina公司推出的HiSeq高通量測序系統(tǒng)，以其革命性的流程和無可比擬的準(zhǔn)確性，成為國際上最先進和實用的快速高效的測序平臺，適合進行腸道菌群元基因組研究。

2010年3月，歐洲人體腸道微生物基因組（metagenomics of the human intestinal tract， MetaHIT）聯(lián)盟研究人員報道，該組織運用Illumina高通量測序技術(shù)完成了對124名歐洲個體的腸道菌群樣本的元基因組學(xué)分析，產(chǎn)生了576.7 Gb的數(shù)據(jù)量，完成了3 300 000微生物基因的序列組裝拼接和功能注釋［24］。2012年，Qin等［25］報道他們在糖尿病患者的研究中也證實了Hiseq高通量測序系統(tǒng)用于腸道元基因組研究的可靠性和科學(xué)性，并且構(gòu)建了中國人群糖尿病患者的腸道菌群元基因數(shù)據(jù)集。2013年Karlsson等［26］報道他們比較了145位患有Ⅱ型糖尿病、葡萄糖耐量降低和正常女性的腸道菌群元基因組，開發(fā)出一種基于元基因組分析的腸道菌群模型，該模型能夠區(qū)分Ⅱ型糖尿患者和健康人，比目前常用的身體質(zhì)量指數(shù)和腰臀圍比例等指標(biāo)更具有預(yù)測價值。2014年秦楠等［27］報道，利用HiSeq2000高通量測序平臺解析了中國肝硬化患者的腸道微生態(tài)元基因組變化，構(gòu)建的基因集中有75 245個基因在肝硬化患者和健康志愿者中呈顯著差異，并創(chuàng)建了由15個特異性的腸道菌群標(biāo)記物構(gòu)成的具有高準(zhǔn)確度的肝硬化患者區(qū)分指數(shù)，在獨立樣本中得到驗證。這些生物標(biāo)志物對于肝硬化的診斷和治療具有重要意義。

肝癌嚴(yán)重的危害我國人民的健康， 2015年中國HCC的發(fā)病率居所有腫瘤的第4位（約46.6萬例），死亡率居第3位（約42萬例）［28］。HCC的發(fā)生是一個較為漫長的過程，通常經(jīng)過肝炎、肝硬化、HCC的病理進展過程。從腸道微生態(tài)角度研究其與HCC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系，并從腸道微生態(tài)角度探索HCC的輔助治療方法具有明顯的創(chuàng)新性和重要意義。

6 展 望

腸道微生態(tài)基礎(chǔ)和應(yīng)用基礎(chǔ)研究已經(jīng)得到各國的廣泛重視。隨著第二代高通量測序技術(shù)的發(fā)展，元基因組學(xué)研究從極大的深度和廣度為人類認(rèn)識腸道菌群和疾病的關(guān)系開辟了新的途徑。從腸道微生物與肝臟的相互作用方面探索HCC新的促發(fā)原因和形成機制，對我國HBV-HCC的發(fā)病機制研究，預(yù)防和治療都將有著重要的意義。

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（2016-09-01收稿 2016-10-07修回）

（責(zé)任編委 李 軍 本文編輯 趙雅琳）

The Cutting Edge of Research Advance on the relationship between intestinal microecology and hepatocellular carcinoma

JIANG Jian-wen， REN Zhi-gang， ZHENG Shu-sen*
Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery， First Affiliated Hospital， School of Medicine， Zhejiang University； Key Laboratory of Combined Multi-organ Transplantation， Ministry of Public Health， Hangzhou， Zhejiang 310003， China

， E-mail: shusenzheng@zju.edu.cn

Due to the close anatomical and functional relationship between the liver and the intestine， intestinal microflora，interact with liver function through the liver-intestinal axis. It plays an important role in the development of the liver inflammation，fibrosis and tumor. Intestinal microflora disorders promote the progress of hepatocellular carcinoma （HCC）， which is an international breakthrough in the pathogenesis of HCC in experimental animals. Key feature strains of the intestinal microflora may become new biomarkers and therapeutic targets of HCC. With the development of the second generation high throughput sequencing technology， the research of metagenomics has opened up a new way for us to understand the relationship between intestinal microflora and HCC from the great depth and breadth.

intestinal microecology； hepatocellular carcinoma； metagenomics； inflammation-carcinoma shift； holistic integrative hepato-enterology

R37； R735.7

A

1007-8134（2016）05-0264-04

10.3969/j.issn.1007-8134.2016.05.002

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究基金（2014KYB081）；浙江省自然科學(xué)基金（LY15H160033）；傳染病診治國家重點實驗室開放基金（2015KF03）；國家自然科學(xué)基金（81672422）；國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（2013CB531403）

310003 杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院肝膽胰外科 衛(wèi)生部多器官聯(lián)合移植重點實驗室（蔣建文、 任志剛 、鄭樹森）；感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心（蔣建文、鄭樹森）；國際保健中心（蔣建文）；450002，鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科（任志剛）

鄭樹森，E-mail: shusenzheng@zju.edu.cn