丁麗玲，魯曉旭，李銀生，邱江平（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240）

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蚯蚓體內(nèi)恩諾沙星殘留的檢測(cè)方法研究

丁麗玲，魯曉旭，李銀生*，邱江平
（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240）

摘要：為進(jìn)一步研究恩諾沙星對(duì)蚯蚓的生態(tài)毒理，建立了用熒光檢測(cè)高效液相色譜法測(cè)定蚯蚓體內(nèi)恩諾沙星殘留量的檢測(cè)方法。以0.1 mol·L-1磷酸液（pH12）+乙腈=1+3（V/V）作為提取液，脫脂，濃縮，再用流動(dòng)相溶解。液相色譜條件：熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長450nm。流動(dòng)相：0.025 mol·L-1磷酸/三乙胺緩沖液（pH3.0）+乙腈=83+17（V/V）。恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍5～500 ng·mL-1，對(duì)其進(jìn)行3種濃度回收率測(cè)定，回收率在81%～88%之間，平均回收率為84.5%，變異系數(shù)10%以內(nèi)，恩諾沙星的最低檢出限為2 ng·g-1。對(duì)蚯蚓進(jìn)行恩諾沙星濾紙染毒，濃度分別為0.16、1.6、16、32 μg·cm-2，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)平行，對(duì)照為不加恩諾沙星的超純水，48 h后檢測(cè)各個(gè)濃度下蚯蚓體內(nèi)恩諾沙星的平均含量分別為1.53、16.81、113.32、120.83 μg·g-1?？梢姡球緦?duì)外源恩諾沙星有較好的吸收，但當(dāng)外源藥物濃度達(dá)到一定程度后，對(duì)恩諾沙星的吸收量將不再無限制增加，且趨于穩(wěn)定，驗(yàn)證了該測(cè)試方法是簡單、快速、可行的。

關(guān)鍵詞：恩諾沙星；蚯蚓；高效液相色譜法；回收率；濾紙染毒

丁麗玲，魯曉旭，李銀生,等.蚯蚓體內(nèi)恩諾沙星殘留的檢測(cè)方法研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 35（2）：403-408.

恩諾沙星（Enrofloxacin，EF）又名乙基環(huán)丙沙星，屬于第三代氟喹諾酮類（Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs）合成抗菌藥，是第一個(gè)動(dòng)物專用的FQs藥物。它具有抗菌譜廣、殺菌力強(qiáng)、作用迅速、體內(nèi)分布廣、副作用小及與其他抗生素間無交叉耐藥性等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。有研究表明恩諾沙星進(jìn)入動(dòng)物體后，其原形及活性代謝產(chǎn)物會(huì)隨排泄物排出體外。由于恩諾沙星是一種廣譜抗生素，它進(jìn)入到土壤環(huán)境后，可能對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響[1-3]。

藥物殘留對(duì)環(huán)境的影響是近年來國際上新興的研究領(lǐng)域[4-5]。獸藥殘留已逐漸成為人們普遍關(guān)注的一個(gè)社會(huì)焦點(diǎn)。近年來，人們?cè)絹碓疥P(guān)注藥物通過人和動(dòng)物的排泄物進(jìn)入環(huán)境后，在環(huán)境中蓄積、遷移和轉(zhuǎn)化，以及在食物鏈中逐漸濃縮，進(jìn)而對(duì)各種生物和人類健康造成的潛在危害[6]。

蚯蚓作為土壤動(dòng)物中最大的常見類群之一，是土壤可持續(xù)利用的關(guān)鍵生物種。蚯蚓對(duì)土壤系統(tǒng)有重要的生態(tài)作用，是生態(tài)系統(tǒng)的重要物質(zhì)分解者，同時(shí)也是展開土壤污染生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的重要指示生物[7-8]。蚯蚓經(jīng)常被作為載體對(duì)可能造成土壤環(huán)境污染的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)試，并根據(jù)這些化學(xué)物質(zhì)對(duì)蚯蚓的毒害程度來評(píng)價(jià)其對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)可能的危害程度[7-10]，故本文選取蚯蚓作為靶動(dòng)物進(jìn)行研究。

近年來，國內(nèi)外對(duì)氟喹諾酮類藥物的殘留檢測(cè)方法報(bào)道較多，有熒光分光光度法[11]、酶聯(lián)法[12-13]、液相色譜法等，所測(cè)的靶動(dòng)物不同，前處理和色譜測(cè)定條件也不相同[17-21]。但蚯蚓體內(nèi)恩諾沙星的檢測(cè)方法以及恩諾沙星對(duì)蚯蚓的影響尚未見報(bào)道。本文旨在建立一種簡單、快速、可靠的檢測(cè)恩諾沙星在蚯蚓體內(nèi)殘留量的方法，并運(yùn)用所建立的檢測(cè)方法進(jìn)行了濾紙接觸試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明該方法在蚯蚓體內(nèi)恩諾沙星殘留的實(shí)際檢測(cè)中應(yīng)用良好，為后續(xù)研究蚯蚓對(duì)恩諾沙星的吸收動(dòng)力學(xué)以及毒理反應(yīng)等奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

赤子愛勝蚓（Eiseniafoetida），在適宜環(huán)境條件中預(yù)養(yǎng)一段時(shí)間，然后挑選體重為300～400 mg、環(huán)帶明顯且大小一致的健康成蚓進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2儀器和設(shè)備

高效液相色譜儀（附熒光檢測(cè)器），美國Thermo，SURVERY PLUS；色譜柱Halo C18，4.6 mm×150 mm，2.7 μm；電子分析天平，梅特勒-托利多（METTLER TOLEDO），MX5；離心機(jī)，德國SIGMA，3K30；勻漿機(jī)，F(xiàn)LUKO，F(xiàn)A25；恒溫水浴氮吹儀，上海啟全儀器科技有限公司，PHC-12R；MX-S可調(diào)式漩渦混勻儀，美國SCILOGEX。

1.3試劑和溶液

恩諾沙星分析標(biāo)準(zhǔn)品（純度100.0%）、恩諾沙星原粉（純度≥98%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司。乙腈為色譜純；磷酸（≥85%）、正己烷、正丙醇、三乙胺、氫氧化鈉、乙酸、無水乙醇等均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。試驗(yàn)用水為超純水。

1.3.1 0.1 mol·L-1磷酸溶液（pH12）

吸取85%的磷酸6.8 mL，加超純水稀釋至1000 mL，滴加1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)pH至12。

1.3.2提取液

取0.1 mol·L-1磷酸溶液（pH12）100 mL，乙腈300 mL，充分混合，放置待溶液澄清后，過濾即得。

1.3.3流動(dòng)相

0.025 mol·L-1磷酸/三乙胺緩沖液（pH3.0）+乙腈=83+17（V/V），超聲脫氣處理。0.025mol·L-1磷酸/三乙胺緩沖液（pH3.0）：取85%磷酸1.7 mL，超純水稀釋至1000mL，用三乙胺調(diào)節(jié)pH至3.0，過0.22μm微孔濾膜。

1.4液相色譜條件

色譜柱見1.2所述；柱溫25℃。熒光檢測(cè)器檢測(cè)波長：激發(fā)波長280 nm、發(fā)射波長450 nm。流動(dòng)相流速300 μL·min-1。進(jìn)樣體積2 μL。

1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.5.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

準(zhǔn)確稱取2.000 mg恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL棕色容量瓶中，以流動(dòng)相溶解并定容，配制成200 μg· mL-1恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃避光保存。

1.5.2標(biāo)準(zhǔn)工作液

吸取990 μL流動(dòng)相于1.5 mL棕色進(jìn)樣瓶中，加入10 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，漩渦混勻，制成2 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.5.3標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度工作液

用流動(dòng)相將標(biāo)準(zhǔn)工作液分別稀釋成10、20、50、100、250、500 ng·mL-1的系列工作液。

1.6蚯蚓體內(nèi)恩諾沙星的提取

取蚯蚓三條，稱重（約1.0 g），剪碎置于15 mL離心管中，按1：4（W：V）加入提取液4 mL，勻漿；勻漿液以4000 r·min-1離心10 min，收集上清液，殘?jiān)儆蒙鲜龇椒ㄖ貜?fù)提取一次，合并兩次上清液；加入4 mL正己烷，充分漩渦混勻，4000 r·min-1離心5 min；用注射器吸取下層清液于離心管中，加入2 mL正丙醇，于50℃水浴中以氮?dú)獯蹈扇軇挥? mL流動(dòng)相溶解后轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中4000 r·min-1離心5 min，取上清液過0.22 μm微孔膜，裝入棕色進(jìn)樣瓶中，取2 μL進(jìn)行HPLC分析。

1.7回收率及變異系數(shù)的測(cè)定

取蚯蚓三條，稱重，剪碎，分別添加10、50、250μL的標(biāo)準(zhǔn)工作液（1.5.2），制得恩諾沙星濃度分別為20、100、500 ng·g-1的蚯蚓樣品。每個(gè)濃度水平4個(gè)重復(fù)，按上述1.6的方法進(jìn)行提取、脫脂、濃縮和進(jìn)樣分析。取恩諾沙星峰面積值（y）代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸直線方程中，得到回歸后的恩諾沙星濃度（x）。計(jì)算相應(yīng)濃度的平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）及變異系數(shù)。

1.8濾紙接觸法測(cè)定蚯蚓對(duì)恩諾沙星的吸收

（1）清腸：取直徑15 cm的培養(yǎng)皿，在底部鋪上2層濾紙，加適量水，以剛好浸沒濾紙為宜。挑選具有環(huán)帶、個(gè)體大小相似的健壯蚯蚓，用水清洗后用濾紙清除體表泥土雜物。放在濾紙上，用塑料薄膜封口，并用解剖針扎孔，然后放置于人工氣候箱中清腸24 h。

（2）染毒：參照OECD標(biāo)準(zhǔn)化濾紙染毒法[14]，在直徑15 cm的培養(yǎng)皿底鋪一層濾紙，以剛好鋪滿皿底為宜。將恩諾沙星用無水乙醇配成0.02、0.2、2、4 mg· mL-1系列濃度，對(duì)照組為不加恩諾沙星的無水乙醇。各取5.652 mL倒入培養(yǎng)皿中，剛好浸潤濾紙，于暗室中揮發(fā)至干，然后逐一加入5.652 mL超純水，使染毒組濃度分別為0.16、1.6、16、32 μg·cm-2。每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)重復(fù)。

（3）放入蚯蚓：將清腸后的蚯蚓沖洗干凈并用濾紙吸干蚯蚓體表的水分，放入培養(yǎng)皿中。每個(gè)處理放入蚯蚓5條，用塑料薄膜封口，并用解剖針扎孔。

（4）培養(yǎng)：將培養(yǎng)皿放入人工氣候箱中培養(yǎng)。箱中為標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件：溫度（20±1）℃，濕度75%±2%，光暗比為12 h/12 h[15]。

（5）檢測(cè)：48 h后，每個(gè)重復(fù)各取3條大小、重量盡量相同的蚯蚓，清洗、吸干體表水分后，稱重。然后按1.6的方法處理并進(jìn)行HPLC分析。將恩諾沙星的峰面積（y）代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中，計(jì)算出相應(yīng)處理組蚯蚓體內(nèi)恩諾沙星的含量（x）。

2　結(jié)果與討論

2.1檢測(cè)方法的確定以及色譜條件的優(yōu)化

2.1.1樣品前處理

在樣品處理中，采用了勻漿、離心、脫脂、濃縮的提取過程[16，21]。從測(cè)定效果來看，達(dá)到了將恩諾沙星從樣品中分離的目的，操作簡單、方便。

2.1.2流動(dòng)相的選擇

在反相HPLC中，優(yōu)化流動(dòng)相的組成是控制保留時(shí)間和選擇性最方便的方法。氟喹諾酮類藥物具有可質(zhì)子化的氮原子和可離解的羥基，在水溶液中通常以離子形式存在。選用適當(dāng)離子對(duì)試劑有利于分離，該類藥物的離子對(duì)流動(dòng)相有四丁基溴化銨與磷酸、三乙胺與磷酸、乙酸銨與檸檬酸等[21]。已報(bào)道的氟喹諾酮類的各種HPLC分離方法的基本體系是C18/乙腈-甲醇-磷酸鹽緩沖液。氟喹諾酮類藥物是酸堿兩性化合物，其解離狀態(tài)和流動(dòng)相中的溶解性在整個(gè)pH區(qū)域內(nèi)隨pH變動(dòng)而增大或減小。根據(jù)Rogstad等[22]報(bào)道，恩諾沙星在酸性pH2.0～2.8范圍內(nèi)，顯示熒光強(qiáng)度最大。綜合考慮到恩諾沙星在酸性流動(dòng)相中熒光強(qiáng)度較高和柱中填料對(duì)pH的耐受性，我們選擇pH為3.0。本文采用了0.025 mol·L-1磷酸/三乙胺緩沖液（pH3.0）[18-21]。結(jié)果顯示以0.025 mol·L-1磷酸/三乙胺緩沖液（pH3.0）+乙腈=83+17（V/V）作流動(dòng)相體系分離效果較好，其基線平穩(wěn)，色譜峰良好（圖1中a曲線），且配制方便、快捷。

圖1　恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)色譜圖、空白蚯蚓樣品和加標(biāo)樣品色譜圖Figure 1 Chromatograms for enrofloxacin standard，blank and spiked samples

2.2蚯蚓樣品中恩諾沙星的色譜行為

在1.4所設(shè)計(jì)的色譜條件下，HPLC基線平穩(wěn)，恩諾沙星保留時(shí)間為11～12 min。蚯蚓樣品中雖有雜峰出現(xiàn)，但無干擾峰，與藥峰分離良好，見圖1中b、c曲線（空白蚯蚓樣品和加標(biāo)樣品的色譜圖）。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線

將繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線用的工作液（1.5.3）依次從低濃度到高濃度，按照液相色譜條件（1.4）進(jìn)行測(cè)定，每一濃度測(cè)定4次。按其所得峰面積的平均值和對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，見圖2，并計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示：恩諾沙星在10～500 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：

y=0.105 1x+0.136 2，R2=0.999 7

在上述樣品處理方法及色譜操作條件下，以信噪比S/N=3計(jì)，測(cè)得恩諾沙星的最低檢出限為2 ng·g-1。

圖2　恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Figure 2 Standard curve for enrofloxacin

2.4回收率及變異系數(shù)

對(duì)恩諾沙星進(jìn)行3種濃度回收率測(cè)定，結(jié)果見表1。平均回收率在81%～88%之間，總平均回收率為84.5%，總平均變異系數(shù)為3.46%?？梢娫摍z測(cè)方法的準(zhǔn)確度與精密度良好。

表1　恩諾沙星回收率測(cè)定結(jié)果（n=4）Table 1 Recovery percentages of enrofloxacin（n=4）

2.5濾紙接觸法中恩諾沙星在蚯蚓體內(nèi)的吸收情況

濾紙接觸法是標(biāo)準(zhǔn)的蚯蚓生態(tài)毒理學(xué)測(cè)定方法之一，簡便快捷，可用于快速判定毒物毒性的大小。實(shí)驗(yàn)過程中0.16 μg·cm-2與1.6 μg·cm-2濃度組以及對(duì)照組中蚯蚓的存活率約為100%，16 μg·cm-2濃度組蚯蚓的存活率為95%，32 μg·cm-2濃度組蚯蚓的存活率為85%。這說明濾紙接觸法中恩諾沙星對(duì)蚯蚓的LC50遠(yuǎn)大于32 μg·cm-2，高于多種重金屬或農(nóng)藥[23-25]，說明恩諾沙星對(duì)蚯蚓是低毒的，符合一般規(guī)律。因?yàn)楂F藥可用于動(dòng)物，毒性一般低于農(nóng)藥或重金屬[15]。

濾紙染毒48 h后，蚯蚓體內(nèi)的恩諾沙星吸收濃度見圖3。由圖3可知，當(dāng)染毒濃度小于16 μg·cm-2時(shí)，蚯蚓體內(nèi)恩諾沙星的吸收量隨染毒濃度變化明顯，染毒濃度越高，蚯蚓吸收越多。染毒濃度1.6 μg· cm-2的吸收量是0.16 μg·cm-2吸收量的11.0倍，16 μg·cm-2的吸收量是1.6 μg·cm-2吸收量的6.7倍。然而，隨著濃度的繼續(xù)升高，蚯蚓體內(nèi)恩諾沙星的吸收量趨于穩(wěn)定。32 μg·cm-2濃度組中蚯蚓對(duì)恩諾沙星的吸收量與16 μg·cm-2濃度組相比已沒有顯著差異（P＜0.05）。濾紙接觸法主要是通過體表接觸吸收毒物，可見蚯蚓通過體表對(duì)外源恩諾沙星有著較好的吸收，且這種吸收具有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)外源藥物濃度達(dá)到一定程度后，其吸收量不再繼續(xù)增加，而是趨于穩(wěn)定。這為進(jìn)行下一步慢性毒性試驗(yàn)和土壤染毒試驗(yàn)，進(jìn)一步評(píng)價(jià)恩諾沙星的生態(tài)毒理提供了參考。

圖3　濾紙染毒48 h后蚯蚓體內(nèi)恩諾沙星的吸收量（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=4）Figure 3 Absorption of enrofloxacin by earthworms exposed to filter paper for 48 h（Mean±SD，n=4）

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法分析檢測(cè)蚯蚓體內(nèi)恩諾沙星的含量，對(duì)該方法的色譜條件進(jìn)行了研究探索，最終確定采用Halo C18色譜柱，0.025 mol·L-1磷酸/三乙胺緩沖液（pH3.0）+乙腈=83+17（V/V）作為流動(dòng)相，柱溫為25℃，熒光檢測(cè)器激發(fā)波長280 nm、發(fā)射波長450 nm，流動(dòng)相流速300 μL·min-1，進(jìn)樣體積2 μL。在該實(shí)驗(yàn)條件下所測(cè)得的樣品有良好的分離度，并通過最低檢出限和加標(biāo)回收率的檢測(cè)，驗(yàn)證了該方法的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。恩諾沙星的最低檢出限為2 ng·mL-1。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為10～500 ng·mL-1，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 7。在加標(biāo)回收率檢測(cè)中平均回收率為84.5%，平均變異系數(shù)為3.46%。

將建立的方法實(shí)際應(yīng)用于濾紙接觸法中蚯蚓對(duì)恩諾沙星的吸收測(cè)定。結(jié)果表明，蚯蚓對(duì)外源恩諾沙星有著較好的吸收，但當(dāng)外源藥物濃度到達(dá)一定程度后，吸收量不再無限制增加，而是趨于穩(wěn)定。本文建立的測(cè)試方法為進(jìn)一步進(jìn)行恩諾沙星對(duì)蚯蚓的生態(tài)毒理研究奠定了基礎(chǔ)，濾紙接觸吸收試驗(yàn)的結(jié)果驗(yàn)證了該檢測(cè)方法的可行性，也為相關(guān)試驗(yàn)提供了參考。

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A detection method for enrofloxacin residues in earthworms

DING Li-ling, LU Xiao-xu, LI Yin-sheng*, QIU Jiang-ping
（Department of Agriculture and Biology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China）

Abstract：An assay method using high performance liquid chromatography（HPLC）with fluorescence detection was established to quantify enrofloxacin residues in earthworms. The extraction solution comprised 0.1 mol·L-1phosphoric acid（pH12）+ acetonitrile（1+3,V/V）. The initial extracts were defatted, evaporated, and re-dissolved in mobile phase consisting of 0.025 mol·L-1phosphoric acid/triethylamine buffer （pH3.0）+ acetonitrile（83+17,V/V）. The fluorescence detector excitation wavelength was 280 nm, and the emission wavelength 450 nm. The linear range of the standard curve was 5～500 ng·mL-1. The recoveries of 3 concentration groups were between 81% and 88% with an average of 84.5% and the coefficient of variation was less than 10%. The detection limit of enrofloxacin was 2 ng·g-1. Earthworms were exposed to filter papers soaked in enrofloxacin with concentrations of 0, 0.16, 1.6, 16 μg·g-1and 32 μg·cm-2, and 4 replicates in each case. After 48 hours of exposure, the average enrofloxacin concentration in earthworms was 0, 1.53, 16.81, 113.32 μg·g-1and 120.83 μg·g-1, respectively. These results show that the absorption of enrofloxacin by earthworms increased linearly up to 1.6 μg·cm-2exposure concentration, and then asymptotically to a maximum of approximately 120 μg enrofloxacin·g-1earthworm tissue.

Keywords：enrofloxacin; earthworm; HPLC; recovery rate; filter paper exposure

*通信作者：李銀生E-mail：yinshengli@sjtu.edu.cn

作者簡介：丁麗玲（1991—），女，浙江紹興人，碩士研究生，研究方向?yàn)樯鷳B(tài)毒理。E-mail：987530144@qq.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31172360）

收稿日期：2015-09-20

中圖分類號(hào)：X503.22

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-2043（2016）02-0403-06

doi:10.11654/jaes.2016.02.027