張喜慶，勾長龍，婁玉杰，2，徐佳萍，高云航*（.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春08；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春08；.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春02）

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高效纖維素分解菌的分離鑒定及堆肥效果研究

張喜慶1，勾長龍1，婁玉杰1，2，徐佳萍3，高云航1*
（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春130118；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春130112）

摘要：采用CMC-Na平板法和剛果紅染色法從自然發(fā)酵的牛糞中分離獲得高效纖維素分解菌，通過形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)及16S rDNA分子生物學(xué)對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，采用單因素法確定菌株的最佳培養(yǎng)條件，最后接種牛糞進(jìn)行堆肥發(fā)酵觀測其效果。結(jié)果表明：獲得的菌株Y2鑒定為枯草芽孢桿菌；經(jīng)產(chǎn)酶條件優(yōu)化后，菌株Y2的濾紙酶活力（FPA）為15.83 U·mL-1，羧甲基纖維素酶活力（CMCA）高達(dá)100.81 U·mL-1，分別是優(yōu)化前的1.3、2.76倍。堆肥試驗(yàn)結(jié)果表明：接種Y2組和EM菌劑組均在第3 d進(jìn)入高溫期（＞50℃），且高溫期分別維持了9 d和8 d；接種Y2組纖維素降解率達(dá)到42%，而EM菌劑組為35%，接種無菌水組只有10.5%。菌株Y2在堆肥發(fā)酵方面具有較大的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：纖維素降解菌；篩選鑒定；產(chǎn)酶條件優(yōu)化；堆肥發(fā)酵

張喜慶，勾長龍，婁玉杰,等.高效纖維素分解菌的分離鑒定及堆肥效果研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 35（2）：380-386.

在中國，畜禽糞便是農(nóng)業(yè)廢棄物的主要來源之一，每年產(chǎn)生的糞便量超過3億t[1]。大量的畜禽糞便如不經(jīng)有效處理，會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。目前，堆肥發(fā)酵被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)有機(jī)廢棄物資源化利用的理想途徑之一[2]，該方法既可以有效殺滅糞便中的病原菌、消除惡臭，使糞便達(dá)到無害化，又可以將糞便中的有機(jī)物生物轉(zhuǎn)化為可被植物吸收的小分子物質(zhì)，使糞便達(dá)到肥料化[3]。然而傳統(tǒng)的自然堆肥發(fā)酵周期長、腐熟程度低，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足糞便資源化處理的需要。近年來，一些研究證明在堆肥過程中接種外源微生物既可以縮短堆肥周期，又可以提高堆肥質(zhì)量。沈根祥等[4]在牛糞和秸稈的堆肥中接種外源微生物，結(jié)果顯示比自然堆肥提前10 d達(dá)到腐熟；李玉紅等[5]在牛糞和玉米秸稈的堆肥中接種外源微生物菌劑，結(jié)果表明添加菌劑可以使堆肥的高溫期延長3～4 d；Jiang等[6]在牛糞和麥稈的堆肥中接種氮轉(zhuǎn)化菌劑，結(jié)果顯示氮損失達(dá)到最低，總氮含量增加了36.1%。然而堆料中木質(zhì)纖維素難降解的問題仍是限制堆肥腐熟的關(guān)鍵問題。因此，本研究從自然發(fā)酵的牛糞中篩選出高效纖維素分解菌，優(yōu)化其產(chǎn)酶條件，并接種于牛糞進(jìn)行堆肥發(fā)酵，研究其對(duì)堆肥溫度及堆肥質(zhì)量的影響，以便開發(fā)出具有應(yīng)用價(jià)值的微生物接種劑，為促進(jìn)堆肥腐熟提供優(yōu)良的菌種資源。

1　材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)用牛糞來源于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)牛場自然腐熟的牛糞。

1.2培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基、羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基、產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基均參照勾長龍[7]方法配制。

1.3菌株的篩選與鑒定

采用羧甲基纖維素鈉平板法和剛果紅染色法[8]篩選出具有纖維素分解能力的菌株，并測量菌落直徑（D）和水解圈直徑（d）。

1.4酶活力測定

參照江國忠[8]介紹的方法對(duì)菌株的濾紙酶活力（FPA）和羧甲基纖維素酶活力（CMCA）進(jìn)行測定。

1.5形態(tài)學(xué)鑒定

篩選出纖維素分解能力較強(qiáng)的菌株（Y2），為確定菌株菌屬，對(duì)其進(jìn)行菌落形態(tài)和培養(yǎng)特征觀察，并進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色鑒定，同時(shí)進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定。

1.6 16S rDNA鑒定

細(xì)菌DNA提取按參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。以提取菌株的基因組為模板，用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后連接至pMD-18T轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌中，將提取重組質(zhì)粒送至生工生物公司進(jìn)行序列測定。所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析，利用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，根據(jù)菌株間的親緣關(guān)系確定菌株的種屬。

1.7產(chǎn)酶條件優(yōu)化

1.7.1種子液制備

將Y2的菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于振蕩培養(yǎng)箱中28℃、160 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 d，制成種子液備用。

1.7.2不同因素對(duì)菌株Y2酶活的影響

保持培養(yǎng)基中其他成分不變，設(shè)定以下條件：碳源，羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、淀粉、秸稈、麩皮；氮源，牛肉膏、酵母粉、蛋白胨、硫酸銨、酵母粉和蛋白胨混合物、尿素。分別在初始pH值5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，溫度25、28、33、37、40℃，將種子液以2%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、160 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 d，測定酶活力；按不同接種量（2%、4%、6%、8%、10%）接入培養(yǎng)基中28℃、160 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 d，測定酶活力；將種子液以2%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、160 r·min-1分別振蕩培養(yǎng)24、48、72、96、120 h，測定酶活力。

1.8堆肥試驗(yàn)

1.8.1堆肥物料

堆肥物料為牛糞和稻殼（表1）。牛糞取自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)牛場，稻殼取自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)殖基地。菌株Y2，有效活菌數(shù)調(diào)制為≥108個(gè)·mL-1；EM菌劑購于河南省鶴壁市人元生物技術(shù)發(fā)展有限公司。

表1　堆肥材料基本理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of composting materials

1.8.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)A、B、C 3組（每組3個(gè)重復(fù)）。每組均用新鮮牛糞與稻殼按體積比6：4進(jìn)行配比，C/N調(diào)節(jié)至25～30之間，水分控制在55%左右，其中A組按體積比接種0.5%的Y2，B組接種0.5%的EM菌劑，空白組接種0.5%的無菌水。充分混勻后裝入容積10 L的泡沫箱中，每3 d翻堆一次。每天上午9：00和下午16：00進(jìn)行溫度測定，以測定的平均值作為當(dāng)天的溫度值。

1.9纖維素降解率的測定

纖維素降解率的測定參照劉旭[10]的測定方法。

1.10數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0軟件進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)，用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，用鄧肯氏新復(fù)極差測驗(yàn)法（Duncan's Multiple Range Test，DMRT法）進(jìn)行差異顯著性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株的篩選

經(jīng)過CMC-Na平板法和剛果紅染色法初步篩選，挑取6株菌落直徑與水解圈直徑比值（D/d）較大的菌株（圖1）進(jìn)行復(fù)篩。

圖1　菌株在篩選平板上的水解圈Figure 1 Clear hydrolytic zone on screening plate

將初篩獲得的6株菌進(jìn)行酶活力測定（表2）。結(jié)果顯示菌株Y2的FPA（12.15 U·mL-1）和CMCA （36.57 U·mL-1）均顯著高于其他菌株的酶活力，且差異顯著（P＜0.05），結(jié)合初篩D/d值，選取菌株Y2進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表2　菌株酶活力測定結(jié)果Table 2 Results of enzyme activities of strains

2.2菌株Y2的鑒定

菌株Y2的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果如圖2所示。在NA培養(yǎng)基上的呈灰白色，表面多褶皺，干燥不透明，邊緣不整齊。革蘭氏染色陽性，顯微鏡下觀察菌體呈長桿狀；孔雀石綠染色芽孢呈綠色，芽孢在菌體的中央位置，屬于中間芽孢體，營養(yǎng)體呈紅色。

圖2　菌株Y2的菌落形態(tài)（a）、革蘭氏染色（b）、芽孢染色（c）Figure 2 Colony morphology（a）, Gram staining（b）, spore staining（c）of strain Y2

生化試驗(yàn)結(jié)果如表3。結(jié)合菌體形態(tài)和培養(yǎng)特征的觀察，初步判斷菌株Y2為芽孢桿菌屬。

表3　 Y2菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Physical and biochemical properties of strain Y2

以Y2菌株基因組DNA為模板，獲得的核苷酸片段大小約為23 000 bp。利用16S rDNA細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測得菌株Y2的16S rDNA核苷酸序列長度為1450 bp。該結(jié)果與預(yù)期相符。將序列通過GenBank比對(duì)后，選取相似序列構(gòu)建基因系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），結(jié)果顯示拮抗菌Y2與Bacillus subtilis strain M15J同源性達(dá)到98%，綜合菌體形態(tài)、生化試驗(yàn)結(jié)果和16SrDNA序列分析，鑒定菌株Y2為枯草芽孢桿菌。

圖3　 Y2系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 3 Phylogenetic tree of stain Y2

2.3單因素對(duì)菌株Y2產(chǎn)酶活力的影響

不同培養(yǎng)條件下，菌株Y2的酶活力如圖4所示。當(dāng)以麩皮為碳源時(shí)，菌株Y2的FPA和CMCA均最高，分別為（13.78±2.23）U·mL-1和（66.35±2.05）U· mL-1，與其他各物質(zhì)差異顯著（P＜0.05）。因此可以認(rèn)為麩皮為菌株Y2產(chǎn)酶的最優(yōu)碳源（圖4a）。

以蛋白胨、酵母粉、硫酸銨、牛肉膏、蛋白胨+酵母粉和尿素為氮源的結(jié)果如圖4b。當(dāng)以酵母粉和硫酸銨為氮源時(shí)，F(xiàn)PA較高分別為（15.51±2.18）U·mL-1和（18.49±1.82）U·mL-1，與其他物質(zhì)差異顯著（P＜0.05）；當(dāng)以酵母粉為氮源時(shí)，Y2的CMCA最高為（86.75± 2.84）U·mL-1，其余各物質(zhì)的CMCA差異均顯著（P＜0.05）。綜合上述結(jié)果，酵母粉為最適氮源。

當(dāng)初始pH為5時(shí)，菌株Y2的FPA和CMCA最高，分別為（14.33±1.15）U·mL-1和（68.61±1.12）U·mL-1，隨著pH的增加，菌株Y2的CMCA逐漸降低，可以初步判定菌株Y2為嗜酸性纖維素分解菌（圖4c）。

當(dāng)種子液接種量為4%時(shí)，菌株Y2的FPA和CMCA分別為（15.58±1.22）U·mL-1和（40.67±1.91）U·mL-1，相比接種量為2%時(shí)菌株Y2的FPA和CMCA均有所升高，其中CMCA差異顯著（P＜0.05）；當(dāng)接種量大于4%時(shí)，菌株的FPA和CMCA隨著接種量的增加而呈下降趨勢。由該結(jié)果可知，4%為最佳接種量（圖4d）。

由圖4e可知，溫度在25～28℃之間時(shí)，菌株Y2 的FPA和CMCA均呈上升趨勢。28℃時(shí)菌株Y2的FPA和CMCA均達(dá)到最高，分別為（14.26±1.17）U· mL-1和（44.76±1.52）U·mL-1；當(dāng)培養(yǎng)溫度高于28℃時(shí)，F(xiàn)PA和CMCA均隨溫度的增加而降低。由此推斷，28℃為最佳培養(yǎng)溫度。

由圖4f可知菌株Y2的FPA在72 h增到最高，可達(dá)（29.86±1.52）U·mL-1，與其他時(shí)間段差異顯著（P＜0.05）；72 h后，隨著時(shí)間的增長，F(xiàn)PA逐漸下降。而菌株Y2的CMCA變化則相對(duì)平緩，在48 h達(dá)到最高

（41.14±1.76）U·mL-1，與其他時(shí)間段差異顯著（P＜0.05），之后緩慢下降。

2.4堆肥試驗(yàn)結(jié)果

由圖5可知，接種Y2組和EM菌劑組均在第3 d達(dá)到高溫期，接種無菌水組未進(jìn)入高溫期。接種Y2組最高溫度為61℃，EM菌劑組最高溫度達(dá)64℃；接種Y2組在高溫期（＞50℃）維持了9 d，EM菌劑組高溫期維持了8 d；兩組均在第30 d降至20℃左右；接種無菌水組在第5 d有過升溫跡象，但隨后溫度下降，一直未進(jìn)入高溫期。

2.5纖維素降解率

由圖6可知，接種Y2組和EM菌劑組纖維素降解率從堆肥開始至第12 d呈平緩上升趨勢，此后直至堆肥結(jié)束時(shí)，接種Y2組纖維素降解率達(dá)到42%，而EM菌劑組只達(dá)到35%，Y2組的纖維素降解率比EM菌劑組高了7個(gè)百分點(diǎn)；自然發(fā)酵組的纖維素降解率至堆肥結(jié)束時(shí)只有10.5%。

3　討論

本研究采用剛果紅染色法和搖瓶復(fù)篩從自然發(fā)酵的牛糞中獲得一株高效纖維素分解菌Y2，經(jīng)鑒定菌株為枯草芽孢桿菌（Baclitis sublitis）。目前國內(nèi)外選育出的優(yōu)良纖維素分解菌主要包括里氏木霉（T. reesei）[11]、斜臥青霉（Penicillium decumbens）、草酸青霉（Penicillium oxalicum）等真菌和放線菌（Streptomyces sp.），關(guān)于纖維素酶高產(chǎn)細(xì)菌的報(bào)道較少。與真菌和放線菌相比，細(xì)菌增殖速度更快，可以在短期內(nèi)產(chǎn)生大量的生物熱，有利于堆體的升溫。而在細(xì)菌中枯草芽孢桿菌具有良好的耐高溫、耐酸能力，適應(yīng)環(huán)境能力很強(qiáng)。另外一些研究表明[12]，枯草芽孢桿菌還有很強(qiáng)的生物同化作用，能有效降低糞便中的吲哚、氨氣等有害氣體的濃度，有利于糞便的資源化利用。纖維素酶活力的高低決定了菌株對(duì)纖維素物質(zhì)的分解能力。劉清鋒等[13]對(duì)產(chǎn)纖維素酶菌株青霉T24-2進(jìn)行優(yōu)化后，獲得的最大濾紙酶活力和內(nèi)切酶活力分別為6.89、45.01 U·mL-1；李保深等[14]研究對(duì)秸稈降解效果較好的斜臥青霉的產(chǎn)酶條件，28℃、120 r·min-1培養(yǎng)4 d，濾紙酶活力和內(nèi)切酶活力分別達(dá)到7.085、3.856 IU·mL-1。本試驗(yàn)篩選出的菌株Y2在28℃、pH5.0培養(yǎng)48 h，F(xiàn)PA和CMCA分別可達(dá)15.83、100.81 U·mL-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以上報(bào)道的真菌和放線菌的酶活力。這說明細(xì)菌Y2屬于高產(chǎn)優(yōu)良纖維素分解菌，有利于堆體中纖維素物質(zhì)的降解。

圖4　不同因素對(duì)菌株Y2酶活力的影響Figure 4 Enzymatic activities of strain Y2

溫度是反映堆肥是否順利進(jìn)行的重要標(biāo)志，溫度變化可以作為堆肥過程評(píng)價(jià)的指標(biāo)[7]。本試驗(yàn)中接種Y2組和EM菌劑組均在第3 d進(jìn)入高溫期，而且接種Y2組高溫期維持了9 d，比EM菌劑組多維持了1 d。分析認(rèn)為可能是枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)生芽孢，抗熱性較強(qiáng)，經(jīng)過高溫階段的休眠，溫度下降后仍可大量繁殖產(chǎn)生熱量，因此高溫期維持時(shí)間更長。根據(jù)國家衛(wèi)生合格標(biāo)準(zhǔn)，堆體溫度在50℃以上保持5～7 d，是殺滅糞便中致病菌和寄生蟲卵的重要條件（GB 7959—2012）[15]。結(jié)果顯示接種Y2組和EM菌劑均達(dá)到無害化腐熟標(biāo)準(zhǔn)。纖維素降解率是反映堆肥腐熟程度的重要指標(biāo)，Zhou等[16]在牛糞和秸稈的堆肥中通過三階段接種不同的微生物，結(jié)果顯示堆肥結(jié)束后接種微生物組纖維素的降解率達(dá)到43%，而空白組只有15%；Wang等[17]研究結(jié)果顯示，接種青霉組的雞糞和牛糞堆肥纖維素降解率均顯著高于對(duì)照組，達(dá)到41%左右。本研究的纖維素降解率達(dá)到42%，高于接種EM 組7個(gè)百分點(diǎn)，與Zhou和Wang等的研究結(jié)果相近，說明本實(shí)驗(yàn)所用的纖維素降解菌Y2對(duì)堆肥發(fā)酵的腐熟具有較好的促進(jìn)作用。

圖5　不同菌劑對(duì)堆肥溫度的影響Figure 5 Effects of different microbial agents on composting temperature

圖6　不同菌劑對(duì)堆肥中纖維素分解率的影響Figure 6 Effects of different microbial agents on cellulose decomposition

4　結(jié)論

（1）從自然發(fā)酵的牛糞中獲得一株高效纖維素分解菌Y2，經(jīng)形態(tài)特征、生化特性及16S rDNA分子序列分析鑒定菌株為枯草芽孢桿菌（Baclitis sublitis）。

（2）通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化菌株Y2的產(chǎn)酶條件，經(jīng)產(chǎn)酶條件優(yōu)化后，菌株Y2的濾紙酶活（FPA）為15.83 U·mL-1，羧甲基纖維素酶活力（CMCA）高達(dá)100.81 U·mL-1，分別是優(yōu)化前的1.3、2.76倍。

（3）采用Y2接種牛糞進(jìn)行堆肥試驗(yàn)，不僅延長了堆肥的高溫期，也提高了堆肥質(zhì)量。

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Isolation and identification of a cellulolytic bacterium and its composting application

ZHANG Xi-qing1, GOU Chang-long1, LOU Yu-jie1,2, XU Jia-ping3, GAO Yun-hang1*
（1. College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2.Key Laboratory of Animal Production, Product Quality and Security, Jilin Agriculture University, Changchun 130118, China; 3.Institute of Special Animal and Plant Sciences of CAAS,Changchun 130112, China）

Abstract：Composting is a good approach to utilizing agricultural organic wastes. Supplying microorganisms could shorten composting period and improve compost quality. In this study, a cellulose-decomposing strain was isolated from natural composting manure by using congo red staining and CMC-Na plate method. The strain was identified according to morphological observation, biochemical testing and 16S rDNA gene sequence. The optimal fermentation conditions were also determined by using single factor and orthogonal experiment. Finally, the isolate was inoculated into cattle mature to test its effect. The strain Y2 was identified as Bacillus subtilis; Its FPA and CMCA were 15.83 U· mL-1and 100.81 U·mL-1, 1.3 times and 2.76 times higher than originals, respectively. Compost inoculated with Y2 and EM microbial agents reached high temperature after 3 d, with high temperature maintained for 9 d and 8 d, respectively. The degradation rate of cellulose was 42% for Y2 group, while it was 35% for EM microbial agent and 10.5% for sterile water. Therefore, strain Y2 has a great potential to be applied to composting fermentation.

Keywords：cellulose decomposing bacterium; screening and identification; optimized conditions; composting

*通信作者：高云航E-mail：gaoyunhang@163.com

作者簡介：張喜慶（1992—），男，吉林集安人，碩士研究生，從事動(dòng)物疫病防治研究。E-mail：zhangxiqing1020@163.com

基金項(xiàng)目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)“牛場環(huán)境控制與廢棄物處理技術(shù)”（CARS-38）；2013年公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)“牛場廢棄物處理利用技術(shù)模式集成與示范”（201303091）；吉林省青年科研基金項(xiàng)目（20130522092JH）

收稿日期：2015-07-18

中圖分類號(hào)：X71

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-2043（2016）02-0380-07

doi:10.11654/jaes.2016.02.024