謝勇

（黑龍江省佳木斯市中心醫(yī)院，黑龍江佳木斯154002）

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骨質(zhì)疏松癥抑制人間充質(zhì)干細胞的成骨分化研究

謝勇

（黑龍江省佳木斯市中心醫(yī)院，黑龍江佳木斯154002）

摘要：為探討骨質(zhì)疏松癥對人骨髓間充質(zhì)干細胞（hMSC）的成骨分化抑制作用，選取，抽取骨髓血樣，取原代干細胞，培養(yǎng)增殖至P4代，進行實驗分組和成骨誘導，隨后測定堿性磷酸酶含量，判斷成骨分化活性。實驗培養(yǎng)期間，觀察干細胞形態(tài)學特征。堿性磷酸酶含量檢測：隨培養(yǎng)時間延長，A組和B組堿性磷酸酶含量均出現(xiàn)上升趨勢。A組和B組中，使用成骨誘導液的1組，堿性磷酸酶含量更高，顯著高于空白對照組，差異p＜0.01。A組和B組中使用成骨誘導液組比較，堿性磷酸酶含量均存在顯著差異p＜0.01。A組和B組中空白對照組比較，堿性磷酸酶含量均存在顯著差異，A組顯著低于B組，差異p＜0.01。說明骨質(zhì)疏松癥患者人骨髓間充質(zhì)干細胞（hMSC）存在成骨分化抑制作用，給予成骨誘導液后，可促進成骨分化。

關(guān)鍵詞：骨質(zhì)疏松癥；人骨髓間充質(zhì)干細胞；成骨分化

我國老年性骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率隨人口老齡化趨勢發(fā)展逐漸升高，成為老年疾病防治的重點。近年來，hMSC體外培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，可誘導成骨、成軟骨及成脂肪分化，而成骨分化對于改善老年性骨質(zhì)疏松癥骨量和骨微細結(jié)構(gòu)具有重要作用［1］。為此，本次研究選取2013年5月——2015年5月本院收治的5例骨質(zhì)疏松癥患者作為A組，另選擇非骨質(zhì)疏松癥患者5例作為B組，對骨質(zhì)疏松癥對hMSC成骨分化的抑制作用進行了對比分析，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1一般資料

選取2013年5月——2015年5月本院收治的5例骨質(zhì)疏松癥患者作為A組，另選擇非骨質(zhì)疏松癥患者5例作為B組。A組，男2例，女3例，年齡49～71歲，平均年齡（60.25±11.33）歲；B組，男2例，女3例，年齡49～72歲，平均年齡（60.68±11.63）歲。兩組患者在年齡、性別等一般資料方面，無比較差異p＞0.05，認為有可比性。兩組患者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)院倫理委員會批準。

1.2實驗方法

1.2.1分離培養(yǎng)

兩組患者均在本院行脊柱手術(shù)治療，術(shù)中抽取腰椎骨髓血20mL。兩組患者骨髓血樣均常規(guī)離心，取原代干細胞，吹打懸浮細胞，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)14d后，使用胰蛋白酶收集細胞，并接種記錄為P1代，然后繼續(xù)按照上述方法進行傳代。

1.2.2實驗分組與成骨誘導

將A組和B組兩組患者的hMSC均擴增至P4代，按相同密度接種至96孔培養(yǎng)板（1.33×104／cm2）。兩組成骨誘導液成分相同：地塞米松、二磷酸抗壞血酸、β－甘油磷酸、BSL－DMEM培養(yǎng)基。A組均分為2組，其中1組作為對照組（空白），使用10%FBS L－DMEM培養(yǎng)液；另1組使用上述成骨誘導液。B組分組方法同A組。兩組96孔板細胞增殖，用于堿性磷酸酶含量檢測。

1.2.3人間充質(zhì)干細胞堿性磷酸酶（ALP）含量檢測

將人骨髓間充質(zhì)干細胞接種于96孔板上，成骨誘導開始后，記錄第3d、7d、14d細胞增殖活性堿性磷酸酶含量。采用酶聯(lián)免疫檢測儀（Thermo354）計算各孔吸光度值，然后使用PBS、ALP緩沖液、對磷酸對硝基苯酯，常規(guī)避光孵育，然后測量OD值。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS20. 0統(tǒng)計學軟件分析研究數(shù)據(jù)，計量資料采用t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗，p<0.05認為差異顯著，有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1形態(tài)學特征

骨髓間充質(zhì)干細胞混懸液接種初始：干細胞呈圓形，可見懸浮的紅細胞，同含有細胞碎片，未見細胞貼壁。

原代干細胞接種完成后，細胞形態(tài)為小圓形、多角形和梭形，接種3～5h開始出現(xiàn)細胞貼壁，僅為少量貼壁，呈集落樣生長，此狀態(tài)持續(xù)約48h，后可見少量細胞貼壁；細胞接種3d后，細胞形態(tài)較為均一，均呈現(xiàn)長梭型，吸棄未貼壁細胞，對培養(yǎng)液進行更換（首次）。

培養(yǎng)接種7d后，干細胞仍為形態(tài)均一的長梭型，呈集落樣生長。

培養(yǎng)至14d時，干細胞呈漩渦樣生長，融合達到70%～90%時，出現(xiàn)纖維細胞樣形態(tài)。

2.2人間充質(zhì)干細胞堿性磷酸酶含量檢測

體外培養(yǎng)3d、4d、7d，隨培養(yǎng)時間延長，A組和B組堿性磷酸酶含量均出現(xiàn)上升趨勢。A組中，使用成骨誘導液的1組，堿性磷酸酶含量更高，顯著高于空白對照組，差異p＜0.01（χ2＝29.256，P＝0.002），認為有統(tǒng)計學意義。B組中，使用成骨誘導液的1組，堿性磷酸酶含量更高，顯著高于空白對照組，差異，認為有統(tǒng)計學意義。

A組和B組中使用成骨誘導液組比較，堿性磷酸酶含量均存在顯著差異，A組顯著低于B組，差異，認為有統(tǒng)計學意義。

A組和B組中空白對照組比較，堿性磷酸酶含量均存在顯著差異：A組顯著低于B組，差異，有統(tǒng)計學意義，如圖1所示：

圖1兩組hMSC細胞堿性磷酸酶（ALP）活力檢測Fig.1 Activity detection ofALP of two group hMSC cells

3　討論

目前，骨質(zhì)疏松癥治療方法較多，但是總體效果不夠理想，尤其在骨愈合與骨再生方面治療效果較差。hMSC與成骨分化存在密切聯(lián)系，而成骨分化骨再生及愈合的基礎(chǔ)。故本次研究中對骨質(zhì)疏松癥患者的hMSC與成骨分化進行了對比，研究結(jié)果顯示，骨質(zhì)疏松癥患者hMSC堿性磷酸酶含量較非骨質(zhì)疏松者下降。本次研究還發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥患者hMSC使用成骨誘導液后，堿性磷酸酶含量升高。

堿性磷酸酶是hMSC細胞早期成骨分化指標，可于早期促進hMSC向成骨細胞分化，而本次研究發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥患者hMSC細胞中堿性磷酸酶含量下降，對于成骨細胞分化不利，提示發(fā)生了抑制作用。此外，通過成骨誘導液可提高堿性磷酸酶含量，從而促進成骨分化。國外相關(guān)臨床研究認為，骨質(zhì)疏松患者hMSC培養(yǎng)液中堿性磷酸酶含量略低于非骨質(zhì)疏松患者，但差異不顯著，與本次研究存在差異，分析其原因可能與時間、誘導液劑量相關(guān)，應(yīng)進一步深入研究［2］。

骨質(zhì)疏松癥患者人骨髓間充質(zhì)干細胞（hMSC）存在成骨分化抑制作用，給予成骨誘導液后，可促進成骨分化［3］。

參考文獻：

［1］代學俊，岑藹兒，張春梅，等.骨質(zhì)疏松癥抑制人間充質(zhì)干細胞的成骨分化［J］.中山大學學報(醫(yī)學科學版)，2014，11（05）:723- 729.

［2］楊楠. miR- 21及其靶基因Sprouty1調(diào)控人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的機制研究［D］.西安：第四軍醫(yī)大學，2012.

［3］董海，周之德，戴力揚.骨髓間充質(zhì)干細胞成骨定向分化的研究進展［J］.創(chuàng)傷外科雜志，2012，（05）：138- 139.

Research on Inhibition of Osteoporosis on hMSCOsteogenic Differentiation

XIE Yong
(JiamusiCentral Hospital of Heilongjiang Province, Jiamusi 154002, China)

Abstract:To investigate inhibition of osteoporosis on hMSC osteogenic differentiation, this paper selected two group patients. Extractingmarrow blood and primary stem cells of two groups, make cell proliferation to P4 generation, take osteogenic induction, and then mesure the content of alkaline phosphatase to determine the activity of osteogenic differentiation. Boththe alkaline phosphatase content of group A and group Bincreased. Alkaline phosphatase content of the group with the use of osteogenic induction solution was significantly higher than the control group, the difference was p< 0.01. Alkaline phosphatase content of group A and group B used osteogenic induction solution were significantly different p<0.01. Alkaline phosphatase levels were significantly different p<0.01 in the control group of group A and group B, and group A was significantly lower than group B. It indicated thatinhibition of osteoporosis on hMSC osteogenic differentiation, after given osteogenic induction liquid can promote osteogenic differentiation.

Key words:Osteoporosis; hMSC; Osteogenesis differentiation

作者簡介：謝勇（1979-），男，黑龍江佳木斯人，主治醫(yī)師，碩士研究生，從事骨外科工作。

收稿日期：2015- 12- 26

中圖分類號：R580

文獻標志碼：A

文章編號：1674-8646（2016）03-0016-02