福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福建省眼科研究所胡淑琴 徐國興

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睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子在視網(wǎng)膜疾病中的應(yīng)用研究進展*

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福建省眼科研究所
胡淑琴 徐國興

[摘要]睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)是視網(wǎng)膜神經(jīng)保護中被研究最多的因子之一，以往大量的研究證據(jù)表明，CNTF對光感受器細胞具有神經(jīng)保護作用。近期研究則表明其對視網(wǎng)膜色素上皮細胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞同樣具有神經(jīng)保護作用，并且能提高病理狀態(tài)下這些視網(wǎng)膜細胞的存活能力。該文就CNTF的基本結(jié)構(gòu)及其在不同視網(wǎng)膜疾病中的研究應(yīng)用進展等方面進行綜述，并展望其在不同視網(wǎng)膜疾病治療中的應(yīng)用前景。

[關(guān)鍵詞]睫狀神經(jīng)生長因子 視網(wǎng)膜 視網(wǎng)膜色素變性 年齡相關(guān)性黃斑變性 青光眼 研究綜述

0 引言

許多視網(wǎng)膜相關(guān)的疾病如視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)、年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）以及青光眼等由于特定的視網(wǎng)膜細胞的不可逆性壞死凋亡，造成了永久性的視力喪失。睫狀神經(jīng)生長因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)可有效挽救由于各種原因引起的視網(wǎng)膜變性，包括由光感受器或視網(wǎng)膜色素上皮細胞（retinal pigment epithelium,RPE）表達的基因突變，以及由強光照射、神經(jīng)毒素或抗體導(dǎo)致的視網(wǎng)膜變性；CNTF可以促進視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGCs）的存活，在視神經(jīng)挫傷或橫斷模型中CNTF可以促進視神經(jīng)軸突生長；此外，CNTF可以影響RPE的生理學(xué)特性并能促進其存活。

1 CNTF及其神經(jīng)保護機制

1.1 CNTF及其受體

CNTF最初是從雞胚提取物中分離出，由于它能促進雞胚睫狀神經(jīng)元存活而被命名為睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子。它是由200個酸性氨基酸組成分子質(zhì)量為22.7kDa的單鏈多肽，像大多數(shù)細胞因子，具有由四個反向平行的α-螺旋束組成的三級結(jié)構(gòu)，屬于白細胞介素-6細胞因子家族，該家族成員還包括IL-6、IL-11、白血病抑制因子、心肌營養(yǎng)蛋白-1、心肌營養(yǎng)蛋白樣細胞因子和抑癌蛋白M[1]。睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(ciliary neurotrophic factor receptor，CNTFR)是由三個亞基 (CNTFR-α、LIFR-β和gpl30)構(gòu)成的復(fù)合體，其中CNTFR-α為CNTF結(jié)合蛋白，LIFR-β和gpl30屬于細胞因子受體家族成員，存在于細胞膜上，參與JAK／TYK偶聯(lián)，起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。CNTFR-α主要存在于大腦、視網(wǎng)膜和骨骼肌，最近的蛋白質(zhì)組學(xué)分析證實，腸、腎和脂肪細胞上亦可大量表達CNTFR-α。

1.2 CNTF的神經(jīng)保護機制

同大部分的IL-6家族成員一樣，CNTF主要激活JAK/STAT通路，在CNTF發(fā)揮作用的經(jīng)典信號傳導(dǎo)途徑中，CNTF與其受體亞基結(jié)合后再與細胞膜上亞基gpl30和LIFR-β聚合形成受體復(fù)合物，使膜內(nèi)側(cè)的JAK/TYK激酶活化，后者又進一步使gpl30和LIFR-β胞內(nèi)段的酪氨酸殘基磷酸化，為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3) 提供結(jié)合位點，STAT3形成二聚體后遷移至細胞核，進一步調(diào)控細胞核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成[2]。CNTF對神經(jīng)的保護作用、促進軸突生長和神經(jīng)元遷移的特性主要由STAT3誘導(dǎo)特異性靶序列的轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)。CNTF與CNTFR-α相互作用后發(fā)揮的神經(jīng)保護作用被認(rèn)為是首先活化Muller細胞，之后激發(fā)JAK/STAT信號通路介導(dǎo)的[3]，然而，在脊椎動物視網(wǎng)膜，CNTF-α的表達僅限于內(nèi)層視網(wǎng)膜神經(jīng)元，特別是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞，沒有證據(jù)表明光感受器細胞的胞體和Muller細胞上有CNTFR-α表達。神經(jīng)元上CNTFR-α通過GPI錨定于細胞膜上，在某些生理條件下，允許CNTFR-α從胞膜上釋放成可溶性CNTFR-α，在視網(wǎng)膜，這種情況主要發(fā)生在無長突細胞和水平細胞上?？扇苄訡NTFR-α能夠結(jié)合游離CNTF，然后通過gpl30/LIFR-β異二聚體傳遞信號，從而導(dǎo)致Muller細胞活化介導(dǎo)Jak/ STAT3信號通路活化[4]。

2 CNTF在視網(wǎng)膜疾病中的應(yīng)用進展

2.1 CNTF在視網(wǎng)膜色素變性中的作用

目前尚無有效的治療方法可以用于RP，干預(yù)性研究證實了用神經(jīng)營養(yǎng)因子治療RP的可能性。

CNTF可以有效延緩視網(wǎng)膜色素變性的疾病進程在至少13種不同的動物模型中得到證明[5]。邱曉榮[6]將日齡為10d的12只RP小鼠隨機分為CNTF治療組、磷酸緩沖液（PBS）注射組及空白對照組，CNTF 治療組小鼠在眼玻璃體腔內(nèi)注射CNTF，PBS 注射組小鼠在眼玻璃體腔內(nèi)注射磷酸緩沖液PBS，對空白對照組小鼠不進行任何干預(yù)，在三組小鼠日齡14d、18d、22d、30d 時分別為其進行視網(wǎng)膜電圖（ERG）檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CNTF 治療組相比，PBS注射組小鼠獲得暗適應(yīng)后發(fā)生最大混合反應(yīng)（Max-ERG）、獲得明適應(yīng)后發(fā)生 ERG（Cone-ERG）及30Hz閃爍光ERG （Flick-ERG）的a波、b波的振幅均較低且潛伏期較長。CNTF治療組小鼠出生后第30d為其進行視網(wǎng)膜電圖檢查仍能記錄到a波和b 波。該研究結(jié)果表明，在RP小鼠玻璃體腔內(nèi)注射CNTF能夠有效延緩其光感受器細胞的凋亡，使其光感受器細胞功能得到顯著提高。CNTF可以有效保護視桿細胞已經(jīng)在多種RP動物模型中得到證實，Li Y等[7]研究證明，在RP中視錐細胞的退行性變是從外節(jié)層開始的，它們在攜帶視紫紅質(zhì)突變基因的S334ter-3大鼠玻璃體腔內(nèi)注入重組人CNTF，可以誘導(dǎo)視錐細胞外節(jié)層再生，逆轉(zhuǎn)其變性過程，持續(xù)性的CNTF治療可以明顯延緩視錐細胞的退行性變。Wen R等[8]研究表明，退化中的視錐細胞仍然能夠再生外節(jié)層，且再生的視錐細胞外節(jié)層可以恢復(fù)視錐細胞的感光功能，這對于RP患者來說是非常有意義的，我們可以利用CNTF刺激退行性變中的視錐細胞再生外節(jié)層，從而在一定程度上恢復(fù)患者的視力。Lipinski DM等[9]研究表明，在CNTF介導(dǎo)的神經(jīng)保護效果中，劑量是關(guān)鍵因素，而且由腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的持續(xù)hCNTF分泌可以對視網(wǎng)膜變性鼠模型中整個視網(wǎng)膜外層的視錐細胞發(fā)揮保護作用，可以保持有效的視力直至視網(wǎng)膜色素變性的終末階段。此外，轉(zhuǎn)錄組分析強烈表明，由Stat3介導(dǎo)的高表達的細胞內(nèi)和細胞外蛋白酶抑制劑是CNTF治療RP的基礎(chǔ)，細胞內(nèi)和細胞外蛋白酶抑制劑可能是通過直接抑制細胞內(nèi)和細胞外基質(zhì)降解發(fā)揮作用，因此，Daniel M等提出介導(dǎo)高表達內(nèi)源性蛋白酶抑制劑可能成為一種新的治療RP/AMD等退行性疾病中細胞死亡的新思維。

Sieving PA等[10]完成了一項前瞻性、單中心、非隨機的Ⅰ期臨床實驗，結(jié)果證實：10例接受NT-501（一種可以持續(xù)分泌CNTF的新型給藥裝置）植入術(shù)的RP患者中，7例患者的視力有不同程度的提高，42.8%（3/7）的CNTF治療眼的視力可以提高2～3行（用Snellen視力表）并能長期維持在該水平；植入術(shù)后6個月時NT-501裝置內(nèi)的細胞數(shù)量較植入時略有減少，但仍然能夠分泌治療量的CNTF；所有接受ECT植入患者均未發(fā)生眼局部和全身的不良反應(yīng)，僅有一例患者在植入NT-501時因為手術(shù)操作原因?qū)е乱贿^性視力下降和脈絡(luò)膜淺脫離，經(jīng)保守藥物治療后病情恢復(fù)。該Ⅰ期臨床實驗表明，玻璃體腔內(nèi)植入NT-501用于治療RP的安全性。已完成的隨機、多中心、劑量-梯度變化的Ⅱ期臨床實驗中，以65名晚期RP患者、68名早期RP患者作為研究對象。結(jié)果表明：在RP患者眼內(nèi)持續(xù)提供CNTF可以延緩甚至停止RP的病程進展，且無任何嚴(yán)重不良反應(yīng)的報道[11-12]。Talcott KE等[13]為了研究持續(xù)的CNTF治療對于視錐細胞的結(jié)構(gòu)和功能的影響，進行了一項為期30～35個月的臨床實驗，他們分別在剛植入NT-501時、3個月、6個月、12個月、18個月和24個月時用自適應(yīng)光學(xué)掃描激光眼底鏡檢測視錐細胞之間的距離和密度，用OCT檢測視網(wǎng)膜厚度。結(jié)果顯示：在第24個月時，CNTF治療眼的外層視網(wǎng)膜厚度明顯高于對側(cè)眼（P＜0.005），與治療眼相比，對照眼中視錐細胞間距每年增加2.9%（P＜0.001），視錐細胞的密度下降9.1%（P=0.002）。該研究結(jié)果表明，持續(xù)的CNTF治療可以明顯延緩視網(wǎng)膜色素變性中視錐細胞的丟失。

2.2 CNTF在年齡相關(guān)性黃斑變性中的作用

AMD以原發(fā)的進行性黃斑部光感受器——視網(wǎng)膜色素上皮復(fù)合體變性為特點，最終導(dǎo)致不可逆的中心視力散失。Rong Li等[14]研究表明，CNTF可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮在細胞生物學(xué)，生物化學(xué)，生理學(xué)上發(fā)生深刻的變化，包括促進RPE細胞存活、促進其分泌細胞因子/神經(jīng)營養(yǎng)因子和由JAK/STAT3信號介導(dǎo)的視網(wǎng)膜下腔積液的吸收。在體內(nèi)，這些變化加在一起可用于調(diào)節(jié)圍繞外層視網(wǎng)膜/RPE/Bruch膜復(fù)合體的微環(huán)境并且可以提供保護，從而防止退行性疾病的發(fā)生。

為了研究眼內(nèi)植入NT-501用于治療GA的安全性和有效性，Zhang K等[15]進行了一項隨機、多中心，雙盲，劑量-梯度變化的Ⅱ期臨床實驗，為期1年。51名AMD患者被隨機分配到接受高劑量CNTF、低劑量CNTF治療組和空白對照組，最后測量12個月后患者最佳矯正視力的變化。結(jié)果顯示：96.3%的高劑量治療組患者可以保持視力穩(wěn)定（視力損失小于15個字母），而低劑量治療組和空白對照組分別為83.3%和75%；在高劑量治療組中最佳矯正視力平均提升0.8個字母，而空白對照組中則平均下降9.7個字母（P=0.0315)；全過程無相關(guān)不良反應(yīng)的發(fā)生。該臨床實驗表明CNTF的治療效果與劑量有關(guān)，持續(xù)的CNTF治療不僅可以在解剖學(xué)上使AMD患者的視網(wǎng)膜厚度增加而且功能學(xué)上可以使患者的視力得到保護并且有一定的提升，CNTF可以有效延緩GA患者的病程進展。

2.3 CNTF在青光眼中的作用

青光眼的主要特征為病理性高眼壓、慢性漸進性視野缺損和RGC死亡，凋亡是青光眼RGC減少的主要原因。目前青光眼的藥物和手術(shù)治療，主要用于降低眼壓，然而，雖然控制了眼壓，大部分青光眼患者的視力仍然不斷喪失。因此，迫切需要尋找到可以阻止RGC功能喪失和死亡的方法。研究表明，由于軸突運輸受損導(dǎo)致的神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的丟失是青光眼視神經(jīng)病變的一個重要因素[16]，因此有學(xué)者把補充神經(jīng)營養(yǎng)因子作為青光眼視神經(jīng)病變的治療策略，以達到保護視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞及其軸突的目的。青光眼神經(jīng)保護策略主要是通過直接或者間接保護RGC從而達到預(yù)防視神經(jīng)變性的目的。Flachsbarth K等[17]將經(jīng)過基因修飾的神經(jīng)干細胞移植到RGC軸索損傷的小鼠模型的玻璃體中，研究表明，神經(jīng)干細胞優(yōu)先分化成星形膠質(zhì)細胞并可持續(xù)表達CNTF，可以顯著減少RGC的丟失，并且可以促進受損RGC軸突的再生。魏樹瑾等[18]研究表明，在慢性青光眼鼠模型玻璃體中注入CNTF可以延緩鼠慢性青光眼視神經(jīng)和視功能損傷，STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活參與此過程。武勁圓等[19]研究表明，在急性高眼壓大鼠玻璃體內(nèi)注入CNTF可以下調(diào)谷氨酸在RGC中的表達，從而對RGC提供保護作用。對于CNTF可以減少RGC死亡的機制，研究表明CNTF可以通過激活Muller細胞、星形膠質(zhì)細胞、RGC上的受體，進而激活STAT3信號通路，以增加體內(nèi)和體外中RGC存活[20]。

然而臨床中神經(jīng)元損傷的修復(fù)，不僅包括解剖學(xué)上的再生和重新建立突觸連接，更重要的是視覺功能的恢復(fù)，因此，在今后關(guān)于RGC實驗研究中，不僅要注重電生理、解剖學(xué)研究，同樣也要關(guān)注視覺功能的恢復(fù)，可以通過觀察動物的大腦功能性突觸連接及視覺地圖重新形成情況評估其視覺功能的情況。

3 細胞包囊技術(shù)的應(yīng)用

傳統(tǒng)給藥方式的藥物生物利用度較低，需要長期連續(xù)給藥，造成治療效果不佳。為解決這一問題，美國Neurotech公司研發(fā)了一種可以緩慢釋放CNTF進入視網(wǎng)膜的一種給藥系統(tǒng)即細胞包囊技術(shù)（encapsulated cell technology，ECT）。ECT是一種新型的藥物輸送系統(tǒng)，該裝置利用基因修飾視網(wǎng)膜色素上皮細胞使其成為可以持續(xù)分泌CNTF的細胞系，然后將該細胞系包裝并依附于一種熱塑性支持物，封裝在半滲透聚合物膜膠囊中[21]。ECT技術(shù)作為一種新近研發(fā)的給藥系統(tǒng)，有其明顯的優(yōu)勢。首先，它可以通過基因編碼將具有治療作用的蛋白質(zhì)工程化至細胞中，使其具有廣泛的應(yīng)用范圍；此外，治療性蛋白是在原位新合成和釋放，因此，相對小的蛋白質(zhì)的量便可以達到治療效果；蛋白質(zhì)穩(wěn)定、內(nèi)源性分泌確保了該蛋白質(zhì)在靶位點的可用性不僅是連續(xù)，也是長期的；最后，如果需要終止該項治療，只需取出ECT裝置即可。Konrad Pauper等[11]通過一項臨床回顧性研究表明NT-501植入物可以在眼內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生CNTF超過2年時間，眼內(nèi)的ECT植入物用于治療慢性視網(wǎng)膜變性等疾病時具有有利的藥代動力學(xué)曲線，并且沒有明顯的毒副作用?；趯κ軗p視網(wǎng)膜的顯著和廣泛的神經(jīng)保護作用，以ECT形式發(fā)揮作用的CNTF已經(jīng)在臨床試驗中進行測試，并經(jīng)美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)可用于治療RP和地圖樣萎縮。

4 小結(jié)

綜上所述，CNTF是一種很有前景的神經(jīng)營養(yǎng)因子，對于多種視網(wǎng)膜細胞都可提供神經(jīng)保護作用，尤其是ECT技術(shù)的開發(fā)更是為CNTF的應(yīng)用提供了保障。雖然大量的動物實驗和臨床實驗已經(jīng)證明了CNTF對相關(guān)視網(wǎng)膜疾病的治療作用，但是深入基因?qū)W和分子生物學(xué)方面的研究可能會產(chǎn)生更大的進步。相信隨著對CNTF的不斷深入研究，將會對RP、AMD等視網(wǎng)膜疾病患者帶來光明的希望。

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* 基金項目:福建省教育廳科研項目( No.JA12139) 。