吳　敏，胡竹林，孫曉梅，代解杰

1 昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院眼科，昆明 650021　2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院　北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院　醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種屬資源中心，昆明 650118

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·論著·

恒河猴超聲乳化角膜內(nèi)皮失代償動(dòng)物模型的活體共聚焦顯微鏡觀察

吳敏1，胡竹林1，孫曉梅2，代解杰2

1昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院眼科，昆明 6500212中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種屬資源中心，昆明 650118

摘要：目的觀察恒河猴超聲乳化角膜內(nèi)皮失代償動(dòng)物模型在共聚焦顯微鏡下的角膜特征性變化。方法健康恒河猴4只，以右眼為實(shí)驗(yàn)組，通過超聲乳化能量破壞角膜中央直徑7～9 mm處內(nèi)表面制作角膜內(nèi)皮失代償模型；以左眼為空白對(duì)照組。于術(shù)前，術(shù)后1、2、3、4周應(yīng)用裂隙燈顯微鏡和活體共聚焦顯微鏡觀察角膜各層結(jié)構(gòu)變化。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，基底層下神經(jīng)叢數(shù)量、內(nèi)皮細(xì)胞密度的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，角膜厚度采用重復(fù)測(cè)量方差分析。結(jié)果在超聲乳化損傷角膜內(nèi)皮后，角膜改變逐漸出現(xiàn)在內(nèi)皮層、基質(zhì)層、前彈力層和基底上皮層。早期主要改變是角膜內(nèi)皮細(xì)胞間隙增寬、細(xì)胞輕度水腫，基質(zhì)層出現(xiàn)活化的基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞形態(tài)改變，基質(zhì)厚度增加；術(shù)后2周開始出現(xiàn)前彈力層上皮狀神經(jīng)纖維減少，同時(shí)伴有基質(zhì)層和內(nèi)皮水腫加重；術(shù)后3周基底上皮細(xì)胞間隙增寬，少量朗漢細(xì)胞浸潤，基質(zhì)層和內(nèi)皮水腫加重；術(shù)后4周基底上皮層大量朗漢細(xì)胞浸潤，前彈力層僅見少量上皮狀神經(jīng)纖維，基質(zhì)層大量活化的基質(zhì)細(xì)胞，內(nèi)皮層嚴(yán)重水腫。術(shù)后2周實(shí)驗(yàn)組基底膜下神經(jīng)叢數(shù)量(t=6.9192，P=0.002)和內(nèi)皮細(xì)胞密度(t=7.8936，P<0.0001)明顯低于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1(t=28.31，P<0.0001)、2(t=63.56，P<0.0001)、3(t=123.22，P<0.0001)、4周(t=180.80，P<0.0001)的角膜厚度明顯高于對(duì)照組。結(jié)論活體共聚焦顯微鏡可清晰顯示超聲乳化后恒河猴角膜的變化，主要特征是逐漸加重的內(nèi)皮細(xì)胞間隙增寬、基質(zhì)細(xì)胞活化、朗漢細(xì)胞增多和基底上皮層下神經(jīng)叢減少。

關(guān)鍵詞：恒河猴；角膜內(nèi)皮失代償；活體共聚焦顯微鏡；動(dòng)物模型

ActaAcadMedSin，2016,38(1)：42-48

由于炎癥、外傷、機(jī)械性損傷、遺傳等因素引起的角膜內(nèi)皮功能失代償是致盲性眼病，也是臨床上的難題，隨著超聲乳化手術(shù)的廣泛開展后，由超聲乳化手術(shù)引發(fā)的角膜內(nèi)皮功能失代償病例不斷增多。角膜內(nèi)皮功能失代償動(dòng)物模型的建立可模擬人類角膜內(nèi)皮功能障礙的病理狀態(tài)，有助于開展角膜內(nèi)皮細(xì)胞方面的研究。常用的角膜內(nèi)皮功能失代償模型建立方法包括冷凍法、化學(xué)物質(zhì)損傷法、角膜內(nèi)皮撕除等，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括兔、貓和鼠，兔的角膜內(nèi)皮有一定的再生能力，模型建立較短時(shí)間后就會(huì)出現(xiàn)內(nèi)皮修復(fù)過程；貓和鼠等動(dòng)物角膜內(nèi)皮細(xì)胞與人類差異較大。恒河猴是與人類在生物遺傳學(xué)上具有高度相似性的靈長類動(dòng)物，本研究擬采用超聲乳化損傷法建立恒河猴角膜內(nèi)皮功能失代償?shù)膭?dòng)物模型，模擬人眼超聲乳化手術(shù)后角膜內(nèi)皮損傷的過程，并在活體共聚焦顯微鏡(invivoconfocal microscopy，IVCM)下觀察角膜各層組織的變化情況，以期為開展角膜內(nèi)皮功能失代償相關(guān)研究提供幫助。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型建立健康恒河猴4只，雌雄各半，平均年齡(46.2±12.5)周(36～60周)，平均體質(zhì)量(4.6±0.5)kg，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滇)2010- 0006]。檢查排除眼部疾病，20 mg/kg氯胺酮肌肉注射麻醉后，將恒河猴固定于手術(shù)臺(tái)上，鹽酸奧布卡因滴眼液表面麻醉，消毒鋪巾后開瞼器開瞼，聚維酮碘沖洗術(shù)眼(右眼)，沿11點(diǎn)角膜緣穿刺前房，將超聲乳化(Universe Ⅱ超聲乳化儀，美國ALCON公司)頭斜面朝向中央7～9 mm范圍角膜內(nèi)表面，距離0.1～0.2 mm不斷擺動(dòng)超聲乳化頭，持續(xù)釋放超聲能量5 min。參數(shù)設(shè)置：負(fù)壓150 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)、流量25 ml·min-1、能量80%。累計(jì)釋放能量(cumulative dissipated energy，CDE；CDE=超聲能量%×超聲時(shí)間)為4 s，前房灌注時(shí)間為5 min，灌注液為無糖型復(fù)方Linger平衡鹽水，灌注液的消耗量為125 ml。水密切口，注入消毒空氣形成前房，妥布霉素地塞米松眼膏涂眼。從做切口開始到切口封閉計(jì)算，平均手術(shù)耗時(shí)(11.3±1.4)min。術(shù)后妥布霉素地塞米松滴眼液點(diǎn)眼。以所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的右眼為實(shí)驗(yàn)組；左眼為空白對(duì)照組，不實(shí)施任何干預(yù)。

裂隙燈顯微鏡和IVCM觀察在制作動(dòng)物模型前1 d，造模后1、2、3、4周分別進(jìn)行檢查。肌肉注射氯胺酮麻醉恒河猴后，鹽酸奧布卡因滴眼液滴眼，開瞼器開瞼，滴用Vidisic眼用凝膠。進(jìn)行裂隙燈顯微鏡觀察及拍照，并根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)對(duì)角膜混濁程度進(jìn)行評(píng)分：(1)0分：完全透明；(2)1分：部分混濁，尤其在角膜的中央?yún)^(qū)；(3)2分：輕度云霧狀混濁，可以看清虹膜血管和瞳孔；(4)3分：混濁嚴(yán)重，大部分虹膜血管不能分辨；(5)4分：混濁進(jìn)一步嚴(yán)重，僅能模糊看到瞳孔邊緣；(6)5分：嚴(yán)重混濁，虹膜和瞳孔完全看不到。

采用德國海德堡視網(wǎng)膜激光斷層掃描系統(tǒng)Ⅱ代(Heldelberg Retina Tomograph Ⅱ，HRT-Ⅱ)對(duì)恒河猴進(jìn)行IVCM檢查，將恒河猴下頜置于下頜托架上，調(diào)整操縱臺(tái)高度和CCD攝像頭位置，蓋上一次性無菌角膜接觸帽。參數(shù)設(shè)置：激光光源波長670 nm，視野為400 μm×400 μm，分辨率為1 μm，放大倍數(shù)為800，圖像采集模式為自動(dòng)獲得模式。將顯微鏡調(diào)整聚焦于中央角膜區(qū)，從表層上皮細(xì)胞逐層掃描到內(nèi)皮細(xì)胞層，觀察角膜各層細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)，每一層次各采集圖片，用于圖像分析。角膜厚度計(jì)算是角膜中央從接觸帽到內(nèi)皮細(xì)胞層之間的距離。所有檢查均由同一名技師完成。分析角膜基底層下神經(jīng)數(shù)量，對(duì)圖像采集部位進(jìn)行匹配，選取5幅清晰圖像分析，以每幅圖像中可見的神經(jīng)數(shù)量支數(shù)計(jì)算平均值；利用HRT-Ⅱ/RCM軟件分析系統(tǒng)，計(jì)算角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，基底層下神經(jīng)叢數(shù)量和內(nèi)皮細(xì)胞密度組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，角膜厚度的不同時(shí)間點(diǎn)比較用重復(fù)測(cè)量方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

裂隙燈顯微鏡觀察結(jié)果實(shí)驗(yàn)組術(shù)后角膜水腫程度不斷加重(圖1)，術(shù)后4周角膜混濁程度評(píng)分均達(dá)到5分(表1)。超聲乳化手術(shù)結(jié)束時(shí)，恒河猴角膜中央輕度水腫，之后角膜水腫和混濁進(jìn)行性加重，術(shù)后4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組中1眼可見手術(shù)切口處見少量新生血管和角膜混濁，其余3眼角膜周邊透明，中央明顯混濁水腫。

表 1　實(shí)驗(yàn)組角膜混濁程度評(píng)分情況(n)

A.正常角膜；B.術(shù)后1周；C.術(shù)后2周；D. 術(shù)后3周；E.術(shù)后4周

A. normal cornea；B.1 week after surgery； C.2 weeks after surgery；D. 3 weeks after surgery； E.4 weeks after surgery

圖1裂隙燈檢查

Fig1Slit-lamp examination in the modeling group

IVCM觀察結(jié)果

對(duì)照組IVCM觀察結(jié)果：(1)角膜表層上皮細(xì)胞邊界清晰，呈現(xiàn)以六邊形為主的多角形，可見細(xì)胞核(圖2A)；(2)Bowman膜看不到形態(tài)和結(jié)構(gòu)，基底上皮層下可見排列規(guī)則、走形平行的神經(jīng)纖維(圖2B)；(3)基質(zhì)層可見發(fā)亮的細(xì)胞核，核呈現(xiàn)出紡錘狀、橢圓形等形態(tài)，胞漿和細(xì)胞邊緣看不清(圖2C)；(4)內(nèi)皮細(xì)胞層由六邊形排列整齊、形態(tài)規(guī)則的細(xì)胞構(gòu)成，看不到細(xì)胞核(圖2D)。

實(shí)驗(yàn)組IVCM結(jié)果：(1)表層上皮：超聲乳化法造模后直到術(shù)后4周，表層上皮層沒有明顯變化。(2)基底上皮層：基底上皮細(xì)胞層術(shù)后1、2周表現(xiàn)與對(duì)照組相似；術(shù)后3周開始出現(xiàn)上皮細(xì)胞間隙增寬，少量朗漢細(xì)胞浸潤(圖3A)；術(shù)后4周見大量朗漢細(xì)胞浸潤(圖3B)。(3)基底層下神經(jīng)叢：術(shù)后1周正常；術(shù)后2周基底層下神經(jīng)叢數(shù)量減少、變細(xì)、連續(xù)性差(圖4A)；術(shù)后3周神經(jīng)叢數(shù)量進(jìn)一步減少；術(shù)后4周神經(jīng)叢數(shù)量顯著減少，可見大量分化的樹突細(xì)胞(圖4B)。(4)基質(zhì)層：術(shù)后1周，深基質(zhì)層開始出現(xiàn)少量處于激活狀態(tài)的基質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)改變(圖5A)；術(shù)后2周，淺基質(zhì)層少量處于激活狀態(tài)的基質(zhì)細(xì)胞，深基質(zhì)層活化的基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多(圖5B)；術(shù)后3周，活化的基質(zhì)細(xì)胞增多(圖5C)；術(shù)后4周，深淺基質(zhì)層均可見大量處于激活狀態(tài)的基質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞胞漿反光增強(qiáng)，細(xì)胞核減少，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，排列紊亂(圖5D)。(5)內(nèi)皮層：術(shù)后1周，內(nèi)皮細(xì)胞層出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞間隙擴(kuò)大，細(xì)胞輕度水腫；術(shù)后2、3、4周，內(nèi)皮細(xì)胞水腫不斷加重(圖6)。

A.上皮細(xì)胞層；B.基底上皮層；C.基質(zhì)層；D.內(nèi)皮細(xì)胞層

A. epithelial layer；B. basal epithelial layer；C. stromal layer；D. endothelial cell layer

圖2對(duì)照組活體共聚焦顯微鏡觀測(cè)結(jié)果(×800)

Fig2Results ofinvivoconfocal microscopy in control group(×800)

A.術(shù)后3周；B.術(shù)后4周

A.3 weeks after surgery；B. 4 weeks after surgery

圖3基底上皮層改變(×800)

Fig3Changes in basal epithelial layer(×800)

A.術(shù)后2周；B.術(shù)后4周

A.2 weeks after surgery；B. 4 weeks after surgery

圖4基底下神經(jīng)叢改變(×800)

Fig4Changes of nerve plexus in Bowman’s layer(×800)

A.術(shù)后1周；B.術(shù)后2周；C.術(shù)后3周；D.術(shù)后4周

A. 1 week after surgery；B. 2 weeks after surgery；C. 3 weeks after surgery；D. 4 weeks after surgery

圖5基質(zhì)層改變(×800)

Fig5Changes in stroma layer(×800)

A. 術(shù)后1周；B. 術(shù)后3周；C. 術(shù)后4周

A. 1 week after surgery；B. 3 weeks after surgery；C.4 weeks after surgery

圖6角膜內(nèi)皮層改變(×800)

Fig6Changes in corneal endothelial layer(×800)

基底膜下神經(jīng)叢和內(nèi)皮細(xì)胞密度的變化情況由于2周后角膜透明度嚴(yán)重下降導(dǎo)致IVCM圖像清晰度不足，選取術(shù)后2周圖像進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的基底膜下神經(jīng)叢數(shù)量和內(nèi)皮細(xì)胞密度分別為(1.6±0.8)支/幅和(1231.5±391.7)細(xì)胞/mm2，顯著低于對(duì)照組的(8.1±1.7)支/幅和(t=6.9192，P=0.002)和(2974.2±203.8)細(xì)胞/mm2(t=7.8936，P<0.0001)。Pearson檢驗(yàn)結(jié)果顯示，角膜厚度與基底膜下神經(jīng)叢數(shù)量沒有相關(guān)關(guān)系(相關(guān)性=-0.303，P=0.697)。

角膜厚度變化情況實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1、2、3、4周的角膜厚度分別為(532±5.1)、(619.5±5.9)、(768±3.7)、(911±5.2)μm；對(duì)照組分別為(461.8±6.8)、(461.2±6.2)、(461.5±6.6)、(461.5±6.5)μm；實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1(t=28.31，P<0.0001)、2(t=63.56，P<0.0001)、3(t=123.22，P<0.0001)、4周(t=180.80，P<0.0001)的角膜厚度均明顯高于對(duì)照組。

討論

角膜內(nèi)皮細(xì)胞層的緊密連接是維持角膜透明性的重要結(jié)構(gòu)，緊密連接受到破壞、角膜內(nèi)皮密度過低時(shí)，會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮功能失代償，引起角膜水腫混濁和失明，視力嚴(yán)重受損。角膜內(nèi)皮功能失代償動(dòng)物模型的建立是開展角膜內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)研究的重要步驟。以往朱勤等[1]曾采用超聲乳化法建立恒河猴角膜內(nèi)皮失代償模型，具體為摘除恒河猴晶狀體后再用超聲乳化破壞角膜內(nèi)皮，達(dá)到損傷角膜內(nèi)皮細(xì)胞的目的，經(jīng)掃描電鏡顯示造模后早期角膜就出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)及功能的改變，隨時(shí)間推移受損的角膜內(nèi)皮細(xì)胞水腫、壞死、內(nèi)皮細(xì)胞脫落。本研究則簡化了手術(shù)方法，省略了摘除晶狀體的步驟，直接利用超聲乳化針頭靠近角膜內(nèi)皮釋放超聲能量的方法，制造角膜內(nèi)皮失代償模型，手術(shù)步驟更為簡單，耗時(shí)更短。

IVCM是非侵入性的成像技術(shù)，1990年首次用于人角膜的影像分析，主要原理是通過共聚焦探測(cè)器接受聚焦后的光源信號(hào)，校準(zhǔn)后再傳入光學(xué)顯微鏡進(jìn)行成像，可以獲得活體角膜光學(xué)切面圖像，觀察角膜所有層面結(jié)構(gòu)及病理生理變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)觀察[2- 4]。臨床上用于感染性角膜炎、異物、翼狀胬肉、角膜變性、營養(yǎng)不良、干眼，包括屈光手術(shù)、白內(nèi)障手術(shù)、角膜移植術(shù)后的角膜分析[2- 13]。IVCM能提供清晰的角膜內(nèi)層結(jié)構(gòu)圖像，且可同時(shí)進(jìn)行角膜厚度、角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度等生物學(xué)參數(shù)的測(cè)量。有文獻(xiàn)報(bào)道用IVCM測(cè)量中央角膜厚度有較好的可重復(fù)性[14]，與OrbscanⅡ方法測(cè)量中央角膜厚度相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[15]。而龐辰久等[16]對(duì)比了IVCM、光學(xué)相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)、OrscanⅡ和超聲角膜測(cè)厚儀4種方法測(cè)量近視眼角膜厚度的差異性，認(rèn)為IVCM測(cè)量結(jié)果偏薄。

本研究采用超聲乳化法建立模型后，實(shí)驗(yàn)組恒河猴角膜出現(xiàn)不斷加重的混濁和水腫，其中1眼手術(shù)切口處出現(xiàn)新生血管和角膜混濁，推測(cè)可能是超聲乳化手術(shù)結(jié)束時(shí)切口封閉不理想造成了切口局部虹膜黏連導(dǎo)致。應(yīng)用IVCM對(duì)角膜進(jìn)行活體動(dòng)態(tài)觀察，與正常對(duì)照組的恒河猴角膜組織相比，在超聲乳化損傷后，早期角膜改變主要出現(xiàn)在內(nèi)皮層和深基質(zhì)層，表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞間隙增寬、細(xì)胞輕度水腫，基質(zhì)層出現(xiàn)活化的基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，變得不規(guī)則。術(shù)后2周與對(duì)照組相比基底膜下神經(jīng)叢數(shù)量和角膜內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著降低。術(shù)后3周基底上皮層可見少量朗漢細(xì)胞浸潤。術(shù)后4周從基底上皮層到內(nèi)皮層各個(gè)層次的病變均較嚴(yán)重。隨著時(shí)間推移，角膜病理改變逐漸從內(nèi)皮和深基質(zhì)層蔓延到基底上皮層，病變的程度不斷加重，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)角膜厚度與對(duì)照組和術(shù)前基線值對(duì)比顯著增加，這與裂隙燈顯微鏡觀察到的角膜水腫程度不斷加重相吻合。朗漢細(xì)胞雖在正常角膜中也存在，但不斷增多的朗漢細(xì)胞提示有免疫和炎癥反應(yīng)存在[17- 18]。IVCM觀察在實(shí)驗(yàn)組角膜基底上皮層中出現(xiàn)朗漢細(xì)胞并且不斷增多，提示可能在角膜內(nèi)皮失代償過程中有免疫和炎癥反應(yīng)參與。Bowman’s膜中基底下神經(jīng)叢主要作用是維持角膜營養(yǎng)、完整性及加快角膜創(chuàng)傷修復(fù)[7]，在IVCM下可以清晰顯示。神經(jīng)叢的減少常見于糖尿病患者[18]、角膜手術(shù)，尤其是LASIK手術(shù)[8- 9]和眼鈍挫傷后[7]。本研究觀察到超聲乳化損傷2周基底下神經(jīng)叢較對(duì)照組顯著減少，推測(cè)可能與灌注液流對(duì)角膜的沖擊造成神經(jīng)纖維的斷裂有關(guān)，也可能是因?yàn)榻悄に[影響了對(duì)神經(jīng)叢的觀察，其確切的機(jī)制尚不清楚，需進(jìn)一步研究證實(shí)。而超聲乳化損傷后神經(jīng)叢顯著減少，將引起角膜營養(yǎng)供應(yīng)減少，角膜水腫加重。結(jié)合IVCM動(dòng)態(tài)觀察結(jié)果，筆者分析超聲乳化法損傷角膜內(nèi)皮的機(jī)制可能為：(1)實(shí)驗(yàn)中采用連續(xù)的超聲能量釋放模式，CDE為4，超聲乳化針頭以40～45 kHz做縱向振動(dòng)，高振動(dòng)頻率釋放出的高熱量造成熱灼傷[19]；(2)灌注液對(duì)角膜內(nèi)皮的機(jī)械性沖擊力[19]；(3)角膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷后的免疫和炎癥反應(yīng)。

本研究存在以下不足：(1)僅設(shè)立了空白對(duì)照組和單一實(shí)驗(yàn)組，通過裂隙燈顯微鏡和IVCM觀察到超聲乳化角膜內(nèi)皮損傷模型的成功建立。但未設(shè)置實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，即利用不同能量、不同超聲能量釋放時(shí)間、不同能量釋放模式的其他實(shí)驗(yàn)組，無法了解超聲能量與角膜內(nèi)皮損傷是否具有線性關(guān)系。(2)由于恒河猴的來源及實(shí)驗(yàn)成本限制，樣本量較小。但本研究中所有實(shí)驗(yàn)眼均成功建立了模型，且IVCM觀察到的改變是穩(wěn)定的。(3)由于實(shí)驗(yàn)觀察后期，角膜水腫嚴(yán)重，IVCM圖像清晰度欠佳，無法進(jìn)行基底膜下神經(jīng)叢數(shù)量的觀察分析。而且IVCM的原理是光學(xué)測(cè)量，角膜清晰度下降可能會(huì)導(dǎo)致角膜厚度測(cè)量的準(zhǔn)確性受到影響。

綜上，本研究結(jié)果顯示，IVCM可清晰、動(dòng)態(tài)地顯示超聲乳化后恒河猴角膜內(nèi)皮失代償?shù)牟±砩磉^程，在超聲乳化后主要變化是內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接受到破壞、細(xì)胞水腫，逐漸引起基質(zhì)層水腫、基底膜下神經(jīng)纖維減少和免疫及炎癥反應(yīng)，最終引發(fā)角膜完全混濁水腫。對(duì)于應(yīng)用來源有限、成本較高的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究時(shí)，IVCM可實(shí)現(xiàn)對(duì)同一實(shí)驗(yàn)個(gè)體角膜的動(dòng)態(tài)連續(xù)觀察和相關(guān)生物學(xué)參數(shù)測(cè)量分析，是一種經(jīng)濟(jì)有效的方法。隨著IVCM影像技術(shù)的不斷發(fā)展，圖像精度、分辨率和可分析參數(shù)進(jìn)一步增加，IVCM將有望部分替代角膜病理組織檢查和電鏡檢查的作用。

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In Vivo Confocal Microscopic Evaluation of Corneal Endothelial Dysfunction Induced by Phacoemulcification in Rhesus Monkey Models

WU Min1，HU Zhu-lin1，SUN Xiao-mei2，DAI Jie-jie2

1Department of Ophthalmology，the 4th Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650021，China2Tree Shrew Species Resource Center，Institute of Medical Biology，CAMS and PUMC，Kunming 650118，China Corresponding author：HU Zhu-linTel：0871- 65156650- 2880，E-mail：hzl77@263.net

ABSTRACT：ObjectiveTo observe the characteristic morphological changes of corneal endothelial dysfunction induced by phacoemulcification in rhesus monkey models under confocal microscope. MethodsThe corneal endothelial dysfunction models were established by phacoemulcification power on the central corneal of 7 to 9 mm diameter in the right eyes of 4 rhesus monkeys(the modeling group). The left eyes of 4 rhesus monkeys were set as blank control group. The structural changes in different corneal layers were evaluated by slit lamp microscope and in vivo confocal microscope before surgery and 1，2，3，and 4 weeks after surgery. SPSS 19.0 software was applied to analyze data. Paired-t test was used to compare the number of nerve plexus in Bowman’s layer and corneal endothelial cell density. Analysis of variance(ANOVA) was used to analyze corneal thickness. ResultsAfter phacoemulcification，the changes of cornea occurred gradually in the endothelial layer，stroma，Bowman’s membrane，and basal epithelial layer. In the early stage，the interspace of corneal endothelial cells enlarged and few activated stromal cells were detected in the stroma. The cell morphology of stroma altered. The thickness of stroma increased. Two weeks after surgery，the nerve plexus in Bowman’s layer decreased and edema of stroma and endothelial layer increased. Three weeks after surgery，the interspace of basal epithelial cells increased with a few Langerhans’ cells infiltration and edema of stroma and endothelial layer increased. Four weeks after the surgery，a large amount of Langerhans’ cells presented in basal epithelial layer. Only a few nerve lexus could be seen in Bowman’s layer. The stroma and endothelial cells had severe edema. A large number of activated stromal cells could be found in stromal layer. Two weeks after the surgery，the number of nerve plexus in Bowman’s layer(t=6.9192，P=0.002) and corneal endothelial cell density(t=7.8936，P<0.0001)in the modeling group were significantly lower than that in control group. Compared with corneal thickness in control group，it was significantly larger in the modeling group at 1(t=28.31，P<0.0001)，2(t=63.56，P<0.0001)，3(t=123.22，P<0.0001)，and 4 weeks(t=180.80，P<0.0001) after the surgery. ConclusionsThe changes in corneal endothelial dysfunction induced by phacoemulcification in rhesus monkey models can be clearly shown under in vivo confocal microscope. Gradual increase of endothelial cells interspace，activated stromal cells，increase of Langerhans’ cells，and decrease of plexus in Bowman’s layer are the main changes.

Key words：rhesus monkey；corneal endothelial dysfunction；in vivo confocal microscope；animal model

(收稿日期：2015- 07- 10)

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.01.008

中圖分類號(hào):R770.43

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào)：1000- 503X(2016)01- 0042- 07

通信作者：胡竹林電話：0871- 65156650- 2880，電子郵件：hzl77@263.net

基金項(xiàng)目：云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(昆醫(yī)聯(lián)合專項(xiàng))(2013FB109、2014FB074)Supported by the Applied Basic Research Programs of Science and Technology Commission Foundation of Yunnan Province(Kunming Medical University Special Program)(2013FB109，2014FB074)