韓白玉，李樂樂，王成芷，郭清華，呂朝暉，母義明，竇京濤

1中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100853　2中國(guó)人民解放軍264醫(yī)院內(nèi)分泌科，太原 030001

?

·論著·

垂體柄中斷綜合征與前動(dòng)力蛋白受體2和前動(dòng)力蛋白2基因突變的相關(guān)性分析

韓白玉1，2，李樂樂1，王成芷1，郭清華1，呂朝暉1，母義明1，竇京濤1

1中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 1008532中國(guó)人民解放軍264醫(yī)院內(nèi)分泌科，太原 030001

摘要：目的分析垂體柄中斷綜合征(PSIS)與前動(dòng)力蛋白受體2(PROKR2)和前動(dòng)力蛋白2(PROK2)基因突變的相關(guān)性。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)和基因測(cè)序方法對(duì)59例PSIS患者基因組DNA的PROKR2和PROK2基因外顯子分別進(jìn)行測(cè)序與突變分析。結(jié)果59例PSIS患者中，6例發(fā)現(xiàn)PROKR2基因突變，其中5例位于第2外顯子c.991G>A，1例位于第2外顯子c.1057C>T。未發(fā)現(xiàn)PROK2基因突變。結(jié)論P(yáng)ROKR2基因可能是PSIS患者的易感基因。

關(guān)鍵詞：垂體柄中斷綜合征；前動(dòng)力蛋白受體2；前動(dòng)力蛋白2

ActaAcadMedSin，2016,38(1)：37-41

垂體柄中斷綜合征(pituitary stalk interruption syndrome，PSIS)是指垂體柄缺如或纖細(xì)合并垂體后葉異位，下丘腦分泌的激素不能通過垂體柄輸送到垂體所致的臨床系列征候群[1]。癥狀從單一激素缺乏到全垂體功能低下輕重不一，其中以生長(zhǎng)激素缺乏伴其他垂體前葉激素缺乏最為常見。PSIS屬罕見病，發(fā)病率為0.5/100 000，發(fā)病機(jī)制尚不清楚，主流觀點(diǎn)認(rèn)為基因突變可能是該病的病因，目前已報(bào)道的基因突變僅能解釋部分患者。有研究顯示，前動(dòng)力蛋白受體2(prokineticin receptor 2，PROKR2)和前動(dòng)力蛋白2(prokineticin 2，PROK2)參與了下丘腦垂體的新生血管形成和遷移[2- 4]，PSIS可能與PROKR2和PROK2基因突變有關(guān)。本研究以中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院收治的59例PSIS患者為研究對(duì)象，分析了PSIS與PROKR2和PROK2基因突變的相關(guān)性。

對(duì)象和方法

對(duì)象2001年1月至2015年1月在中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院就診，通過垂體磁共振影像學(xué)檢查、垂體前葉功能評(píng)價(jià)及臨床特征相符并留取DNA樣本的PSIS患者59例，其中，男53例，女6例，平均年齡(20.6±5.86)歲(8～36歲)。所有患者染色體檢查均與性別符合，無異常發(fā)現(xiàn)，均無類似家族史。本研究經(jīng)中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所使用的血液DNA標(biāo)本均經(jīng)患者本人和/或患者家長(zhǎng)同意并簽字。

主要試劑和儀器全血基因組DNA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen Biosciences公司，多功能DNA純化回收試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，PCR儀購(gòu)自德國(guó)Sigma公司。測(cè)序工作由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司完成，所用測(cè)序儀器為ABI PRISM3730，測(cè)序試劑盒為BigDye terminator v3.1。

樣本采集取外周靜脈血3 ml，加入EDTA抗凝劑混勻后放于-80℃凍存?zhèn)溆?。采用美?guó)Axygen Biosciences公司全血基因組提取試劑盒提取所有研究對(duì)象的外周血白細(xì)胞微量基因組DNA，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

引物設(shè)計(jì)和合成采用Primer3在線引物設(shè)計(jì)軟件對(duì)基因外顯子上下游各100 bp序列區(qū)域分別設(shè)計(jì)上下游引物，以擴(kuò)增目的片段。為保證測(cè)序的準(zhǔn)確性，對(duì)大于1000 bp的外顯子采用分段設(shè)計(jì)引物、分段測(cè)序的方法，引物由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司合成，引物序列見表1。

表 1　人PROKR2、PROK2基因外顯子擴(kuò)增引物序列

外周血基因組DNA提取外周血室溫復(fù)融后，參照Axygen Biosciences公司提供的方法提取外周血白細(xì)胞基因組DNA。

目的基因片段PCR擴(kuò)增采用Biomltra梯度PCR儀對(duì)所有外周血基因組DNA標(biāo)本進(jìn)行目的基因片段擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μl體系：模板DNA 2.0 μl，濃度為100 μg/μl；去離子水14 μl；上、下游引物各為 1 μl，濃度10 μmol/L；Taq DNA 聚合酶0.5 μl；dNTP 4 μl；10×PCR緩沖液 2.5 μl。

瓊脂糖凝膠水平電泳PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠恒壓電泳，然后采用WD- 9403c型紫外透視儀觀察目的條帶并拍照存檔。

PCR產(chǎn)物純化回收采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司的凝膠試劑盒回收與提純PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到純化后的目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

目的片段測(cè)序純化后的目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果判讀采用Chromas 2軟件對(duì)測(cè)序圖進(jìn)行人工判讀，并利用Sequencher軟件將PCR產(chǎn)物序列與標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)，找出堿基改變的位點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)序列選取自NCBI genebank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez/)。

結(jié)果

PROKR2基因外顯子擴(kuò)增PROKR2第1外顯子PCR擴(kuò)增出大小接近750 bp的片段；第2外顯子堿基數(shù)大于1000 bp，為保證測(cè)序準(zhǔn)確性，將其設(shè)計(jì)成2段分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小均介于750～500 bp之間(圖1)。

PROK2外顯子擴(kuò)增PROK2第1、2、3外顯子分別PCR擴(kuò)增出大小介于500～250 bp間的片段；第4外顯子堿基數(shù)大于1000 bp，為保證測(cè)序準(zhǔn)確性，將其設(shè)計(jì)成3段分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小均介于750～500 bp間(圖2)。

M：DNA標(biāo)記(DL2000)；1～9：例1～9

M：DNA marker(DL2000)；1- 9：Case 1- 9

圖1PROKR2外顯子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖

Fig1Electrophoresis of PROKR2 PCR products

M：DNA標(biāo)記(DL2000)；1～9：例1～9

M：DNA marker(DL2000)；1- 9：Case 1- 9

圖2PROK2外顯子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖

Fig2Electrophoresis of PROK2 PCR products

PROKR2基因外顯子突變59例患者中，6例檢測(cè)出PROKR2 基因置換突變，其中5例突變發(fā)生在PROKR2基因第2外顯子991處，“G”置換成“A”(c.991G>A)，纈氨酸置換成甲硫氨酸(p.V331M)(圖3)；另1例突變也在PROKR2基因第2外顯子，發(fā)生在1057處，“C”置換成“T”(c.1057C>T)，精氨酸置換成甘氨酸(p.R353G)(圖4)。

PROK2基因外顯子突變?nèi)?9例患者PROK2基因3個(gè)外顯子均未檢測(cè)到突變。

討論

近年來隨著垂體MRI的應(yīng)用，PSIS的確診已不困難。但該病病因尚不明確，一部分學(xué)者認(rèn)為圍產(chǎn)期損傷是PSIS發(fā)病的主要原因，包括臀位、肩先露、足先露、產(chǎn)鉗助產(chǎn)、外傷和窒息史等。支持點(diǎn)是目前所有臨床研究都顯示PSIS患者圍產(chǎn)期事件發(fā)生率明顯高于正常，尤其臀位生產(chǎn)率遠(yuǎn)高于正常人群。Maghnie等[5]報(bào)道的22例PSIS患者中，81.81%有圍產(chǎn)期事件，其中61.18%為臀先露，而正常人群臀先露比例為3.4%。Wang等[6]觀察了59例PSIS患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)54例為臀先露，占91.5%。但隨著對(duì)PSIS病因的深入研究，有學(xué)者提出產(chǎn)前因素可能是導(dǎo)致PSIS發(fā)病的主要原因，理由如下：(1)一部分患者出生時(shí)并無圍產(chǎn)期事件。(2)PSIS患者男女發(fā)病率不均衡，男女比例接近10∶1。Guo等[7]觀察了55例PSIS患者，其中男性48例，占87.3%。(3)PSIS患者常合并其他先天異常，部分患者有家族性表現(xiàn)。Simon等[8]報(bào)道，60例PSIS患者中7例(12%)有家族史，31例(52%)存在垂體外異常，包括Fanconi貧血、Pallister-Hall綜合征、Currarino綜合征、Stilling-Duane綜合征、顱面結(jié)構(gòu)畸形等。Pham等[9]報(bào)道的53例PSIS患者中26例(49%)合并畸形。由此推測(cè)產(chǎn)前因素可能導(dǎo)致了PSIS和圍產(chǎn)期事件，基因突變可能是該病的病因，圍產(chǎn)期事件則可能是結(jié)果而非原因。因此，調(diào)控垂體生長(zhǎng)和分化的基因如果發(fā)生突變就有可能導(dǎo)致PSIS發(fā)病。

PROKR2基因定位于20p13，全基因長(zhǎng)約12 kb，包含2個(gè)編碼外顯子，編碼一種由384個(gè)氨基酸殘基組成的，含7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的G蛋白偶聯(lián)受體。PROK2基因定位于3p21.1，基因全長(zhǎng)約為13.4 kb，包含4個(gè)編碼外顯子(包括選擇性剪接外顯子3)，編碼由129個(gè)氨基酸殘基組成的分泌型蛋白。PROKR2、PROK2參與下丘腦垂體的新生血管形成和遷移，對(duì)垂體的形成起重要作用。本研究結(jié)果顯示，59例PSIS患者中，有6例檢測(cè)出PROKR2基因雜合突變，其中5例位于第2外顯子c.991G>A，1例位于第2外顯子c.1057C>T；其余53例PSIS患者未發(fā)現(xiàn)突變；全部59例患者均未發(fā)現(xiàn)PROK2基因突變。由此推測(cè)PROKR2可能是PSIS的易感基因之一。

A.突變基因峰圖，箭頭表示第2外顯子991處突變(c.991G>A)；B.正常峰圖

A. mutant gene sequencing peak, the arrow indicates the intragenic subsititution of exon 2(c.991G>A)；B. normal gene sequencing peak

圖35例PROKR2基因突變峰圖

Fig3PROKR2 gene sequencing peak in 5 cases

A.突變基因峰圖，箭頭表示第2外顯子1057處突變(c.1057C>T)；B.正常峰圖

A. mutant gene sequencing peak, the arrow indicates the intragenic subsititution of exon 2(c.1057C>T)；B. normal gene sequencing peak

圖41例PROKR2基因突變峰圖

Fig4PROKR2 gene sequencing peak in 1 case

目前的研究在PSIS患者中還檢測(cè)出POU1F1、PROP1、HESX1、LHX3、LHX4等參與垂體生長(zhǎng)分化的基因發(fā)生突變，但檢出率均不高。由此筆者推測(cè)PSIS的發(fā)生可能不是某一個(gè)基因突變導(dǎo)致的，有可能是影響垂體發(fā)育的信號(hào)通路中某些關(guān)鍵基因發(fā)生突變所致，這有待于以后的工作進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1]Vijayanand P，Mahadevan S，Shivbalan S，et al. Pituitary stalk interruption syndrome(PSIS)[J]. Indian J Pediatr，2007，74(9)：874- 875.

[2]Monnier J，Samson M. Prokineticins in angiogenesis and cancer[J]. Cancer Lett，2010，296(2)：144- 149.

[3]Martin C，Balasubramanian R，Dwyer AA，et al. The role of the prokineticin 2 pathway in human reproduction：evidence from the study of human and murine gene mutations[J]. Endocr Rev，2011，32(2)：225- 246.

[4]Lin DC，Bullock CM，Ehlert FJ，et al. Identification and molecular characterization of two closely related G protein-coupled receptors activated by prokineticins/endocrine gland vascular endothelial growth factor[J]. J Biol Chem，2002，277(22)：19276- 19280.

[5]Maghnie M，Larizza D，Triulzi F，et al. Hypopituitarism and stalk agenesis：a congenital syndrome worsened by breech delivery[J]. Horm Res，1991，35(3- 4)：104- 108.

[6]Wang Q，Hu Y，Li G，et al. Pituitary stalk interruption syndrome in 59 children：the value of MRI in assessment of pituitary functions[J]. Eur J Pediatr，2014，173(5)：589- 595.

[7]Guo Q，Yang Y，Mu Y，et al. Pituitary stalk interruption syndrome in Chinese people：clinical characteristic analysis of 55 cases[J]. PLoS One，2013，8(1)：e53579. DOI：10.1371/journal.pone.0053579.

[8]Simon D，Hadjiathanasiou C，Garel C，et al. Phenotypic variability in children with growth hormone deficiency associated with posterior pituitary ectopia[J]. Clin Endocrinol(Oxf)，2006，64(4)：416- 422.

[9]Pham LL，Lemaire P，Harroche A，et al. Pituitary stalk interruption syndrome in 53 postpubertal patients：factors influencing the heterogeneity of its presentation[J]. PLoS One，2013，8(1)：e53189. doi：10.1371/journal.pone. 0053189.

Correlation between Pituitary Stalk Interruption Syndrome and Prokineticin Receptor 2 and Prokineticin 2 Mutations

HAN Bai-yu1，2，LI Le-le1，WANG Cheng-zhi1，GUO Qing-hua1，LV Zhao-hui1，MU Yi-ming1，DOU Jing-tao1

1Department of Endocrinology，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China2Department of Endocrinology，the 264th Hospital of PLA，Taiyuan 030001，China Corresponding author：DOU Jing-taoTel：010- 55499301，E-mail：jingtaodou@sohu.com

ABSTRACT：ObjectiveTo analyze the correlation between pituitary stalk interruption syndrome(PSIS) and prokineticin receptor 2(PROKR2) and prokineticin 2(RROK2) mutations. MethodsPROKR2 and RROK2 genotypes were identified by multiplex polymerase chain reaction analysis with exon-flanking primers and by automated sequencing techniques with peripheral blood DNA samples from 59 patients with PSIS. ResultsOf these 59 PSIS patients，6 showed intragenic deletions at the PROKR2 locus. Of them，5 patients exhibited intragenic subsititution of exon 2(c.991G>A)，and the remaining one patient exhibited intragenic subsititution of exon 2(c.1057C>T). No PROK2 mutation was found in these PSIS patients. ConclusionPROKR2 may be the susceptibility gene of PSIS.

Key words：pituitary stalk interruption syndrome；prokineticin receptor 2；prokineticin 2

(收稿日期：2015- 03- 18)

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.01.007

中圖分類號(hào):R584

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào)：1000- 503X(2016)01- 0037- 05

通信作者：竇京濤電話：010- 55499301，電子郵件：jingtaodou@sohu.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81370871)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(81370871)；第一二位作者對(duì)本文貢獻(xiàn)一致The first two authors contributed equally to this article