趙　娜，申　樂(lè)，姜浩武，馬　超，黃宇光

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院　北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院　北京協(xié)和醫(yī)院麻醉科，北京 100730　2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院　北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院　基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所人體解剖與組織胚胎學(xué)系，北京 100005

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·論著·

MiR- 146a高表達(dá)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞BV2炎性反應(yīng)的影響

趙娜1，申樂(lè)1，姜浩武2，馬超2，黃宇光1

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院麻醉科，北京 1007302中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所人體解剖與組織胚胎學(xué)系，北京 100005

摘要：目的觀察高表達(dá)MiR- 146a對(duì)細(xì)菌脂多糖(LPS)誘導(dǎo)后神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞BV2炎性反應(yīng)的影響。方法采用LPS刺激接受MiR- 146a 模擬物轉(zhuǎn)染后的BV2細(xì)胞，Real-time PCR檢測(cè)MiR- 146a轉(zhuǎn)染效率，ELISA檢測(cè)促炎癥因子白細(xì)胞介素- 6(IL- 6)和腫瘤壞死因子α(TNFα)的表達(dá)水平，Real-time PCR和Western blot法檢測(cè)TLR4信號(hào)通路上腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)和白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶1(IRAK1)的表達(dá)水平。結(jié)果與正常組比較，采用50 nmol/L的轉(zhuǎn)染濃度對(duì)BV2細(xì)胞進(jìn)行MiR- 146a模擬物轉(zhuǎn)染，可明顯增加細(xì)胞內(nèi)MiR- 146a含量(t=5.846，P=0.0021)；LPS刺激導(dǎo)致BV2細(xì)胞激活，可明顯增加細(xì)胞內(nèi)IRAK1和TRAF6表達(dá)，也可明顯誘發(fā)細(xì)胞分泌更多的IL- 6和TNFα；而與單純采用LPS刺激相比，用MiR- 146a模擬物轉(zhuǎn)染后再接受LPS刺激作用可明顯降低IL- 6(t=5.200，P=0.0003)和TNFα(t=9.812，P<0.0001)的表達(dá)水平，同時(shí)明顯降低細(xì)胞內(nèi)TRAF6分子在基因(t=5.353，P=0.0007)和蛋白(t=6.980，P=0.0009)水平的表達(dá)，而非IRAK1的表達(dá)。結(jié)論MiR- 146a可能是通過(guò)調(diào)控TLR4信號(hào)通路中TRAF6分子的表達(dá)，負(fù)反饋抑制BV2細(xì)胞的炎性反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：MiR- 146a；小膠質(zhì)細(xì)胞；神經(jīng)病理性疼痛；促炎癥因子

ActaAcadMedSin，2016,38(1)：27-32

微小RNA(microRNA，miRNA，MiR)是近年來(lái)生命研究的熱點(diǎn)，其可通過(guò)抑制mRNA翻譯或促進(jìn)mRNA降解，影響mRNA壽命，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，最終影響下游蛋白質(zhì)分子(如細(xì)胞因子等)的表達(dá)；絕大多數(shù)miRNA主要是抑制基因表達(dá)，發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用[1- 4]。MiR- 146是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)在免疫應(yīng)答中具有調(diào)節(jié)作用的miRNA，包括MiR- 146a 和MiR- 146b兩個(gè)成員[5]。體外研究顯示，MiR- 146a可通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)亞型TLR4信號(hào)通路上的白細(xì)胞介素- 1受體相關(guān)激酶1 (interleukin- 1 receptor-associated kinase 1，IRAK- 1)及腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)，損害核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)活性，降低NF-κB靶基因的表達(dá)[6- 8]，從而進(jìn)一步降低信號(hào)通路下游的促炎癥因子，如白細(xì)胞介素(interleukin，IL)- 6、IL- 8、IL- 1β和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNFα)表達(dá)。本課題組以往采用大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)慢性結(jié)扎損傷(chronic constriction injury，CCI)模型，通過(guò)篩查其脊髓標(biāo)本的基因芯片，發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)異常表達(dá)的miRNA，其中，MiR- 146a在該模型誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛中出現(xiàn)了低表達(dá)[9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生與維持有著密切的關(guān)系。本研究觀察了細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(小膠質(zhì)細(xì)胞)導(dǎo)致TLR4信號(hào)通路激活后，外源性干預(yù)高表達(dá)MiR- 146a對(duì)調(diào)控TLR4信號(hào)通路下游促炎癥因子表達(dá)的影響。

材料和方法

材料和儀器BV2細(xì)胞(小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞)、無(wú)菌PBS、DMEM高糖培養(yǎng)基、進(jìn)口胎牛血清、雙抗(青霉素+鏈霉素)、0.05%胰蛋白酶消化液均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心，LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?RNAiMAX購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司，MiR- 146a模擬物及陰性對(duì)照錯(cuò)義鏈購(gòu)自上海吉瑪生物公司；RNA提取試劑Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及Real-time PCR試劑盒購(gòu)自日本TAKARA公司；MiR- 146a及內(nèi)參U6的引物由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成(莖環(huán)法)，TRAF6、IRAK1及β-actin引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成；蛋白質(zhì)提取試劑及定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；Western blot相關(guān)試劑(如電泳液、轉(zhuǎn)膜液及抗體稀釋液等)購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；小鼠TRAF6、IRAK1及β-actin一抗及相應(yīng)二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；小鼠IL- 6和TNFα的ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海依科賽生物制品有限公司。PCR儀為Bio-Rad CFX96 (美國(guó)BioBad公司)，Western blot電泳儀為BIO-RAD Mini-PROTEAN?Tetra System(美國(guó)BioBad公司)，蛋白質(zhì)定量及ELISA檢測(cè)所用酶標(biāo)儀為BIO-RAD iMARKTM Microplate Reader(美國(guó)BioBad公司)，RNA濃度測(cè)定所用的超微量分光光度計(jì)為Nanodrop 2000(美國(guó)Thermo scientific公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱為Thermo HERAcell 150i(美國(guó)Thermo Scientific公司)。

細(xì)胞培養(yǎng)及分組將BV2細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于環(huán)境為37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d傳代1次，傳代3次后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為4組，分別是正常組(N組)、LPS組(L組)、MiR- 146a模擬物轉(zhuǎn)染后LPS刺激組(M+L組)及陰性對(duì)照錯(cuò)義鏈轉(zhuǎn)染后LPS刺激組(NC+L組)。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染并上調(diào)MiR- 146a表達(dá)水平取傳代3次后的細(xì)胞，按照2×105/孔接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞密度大約為50%。按操作說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，MiR- 146a 模擬物和錯(cuò)義鏈轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmol/L，轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MiR- 146a模擬物的序列為：上游：UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU；下游：CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU。陰性對(duì)照錯(cuò)義鏈的序列為：上游：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT；下游：ACGUGACACGUUCGGAGAATT。

LPS刺激轉(zhuǎn)染48 h后更換培養(yǎng)基，加入用基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶解的LPS，每孔中的終濃度為5 μg/ml，作用4 h后收集標(biāo)本。

ELISA檢測(cè)IL- 6和TNFα表達(dá)水平收集六孔板中細(xì)胞培養(yǎng)基，4℃ 3000 r/min(r=15 cm)離心15 min，取上清液按照ELISA試劑盒操作說(shuō)明書檢測(cè)各組IL- 6和TNFα表達(dá)水平，顯色后在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算IL- 6和TNFα濃度數(shù)值。

Real-time PCR檢測(cè)MiR- 146a、TRAF6和IRAK1基因表達(dá)水平采用TRIZOL法提取各組細(xì)胞總RNA，用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及其質(zhì)量，然后按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)采用25 μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件參照說(shuō)明書設(shè)置，檢測(cè)MiR- 146a、TRAF6和IRAK1基因表達(dá)水平，其中MiR- 146a以U6作為內(nèi)參對(duì)照，TRAF6和IRAK1以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照，TRAF6引物序列為：上游：AGTTCCAGGGCATCTGACAC；下游：GTCCACACAACCGTGATAGC。IRAK1引物序列為：上游：CATTCCTGGCACTTGACTCC；下游：C CTGGGCTACTCCTCACACT。β-actin引物序列為：上游：GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG；下游：ATGCCACAG ATTCCATACC。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；相對(duì)定量分析采用2-ΔΔCt法。

Western blot法檢測(cè)TRAF6和IRAK1蛋白表達(dá)水平在LPS刺激作用后，常規(guī)提取各組蛋白質(zhì)并測(cè)定濃度。在10%的SDS-PAGE中進(jìn)行電泳，條件為80V，30 min及110V，75 min，蛋白上樣量為40 μg；采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)入PVDF膜中，轉(zhuǎn)膜條件為恒流，300 mA，75 min；5%牛奶封閉1 h；加入一抗(濃度為1∶1000)4℃搖床孵育過(guò)夜；常規(guī)洗滌，加入相應(yīng)二抗(1∶2000)孵育1 h后常規(guī)洗滌；后加入適量ECL發(fā)光液在成像系統(tǒng)中顯影，并采用軟件Image J進(jìn)行圖像分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 6統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩兩比較采用Student’st檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

MiR- 146a轉(zhuǎn)染效率采用帶有綠色熒光標(biāo)記的MiR- 146a模擬物進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察，可清晰看到單個(gè)細(xì)胞被轉(zhuǎn)染后，發(fā)出綠色熒光的圖像(圖1A)。轉(zhuǎn)染48 h后Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，MiR- 146a模擬物轉(zhuǎn)染后BV2細(xì)胞內(nèi)的MiR- 146a表達(dá)水平與其他3組相比明顯增高；當(dāng)與N組比較時(shí)，M+L組的MiR- 146a表達(dá)量是其31.4倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.846，P=0.0021)(圖1B)。

MiR- 146a模擬物轉(zhuǎn)染對(duì)LPS刺激后BV2細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL- 6和TNFα的影響L組的IL- 6和TNFα水平分別為(637.292±199.350)和(1417.485±256.599)pg/ml，明顯高于N組的(50.107±23.990)(t=10.47，P<0.0001)和(107.302±20.96)pg/ml (t=17.55，P<0.0001)；M+L組的IL- 6和TNFα水平分別為(323.994±63.153)和(804.840±82.095)pg/ml，明顯低于L組(t=5.200，P=0.0003；t=9.812，P<0.0001)；NC+L組的IL- 6和TNFα水平分別為(645.389±180.991) 和(1300.397±308.576)pg/ml，與L組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.1140，P=0.9113；t=1.341，P=0.2071)。

a：t=5.846，P=0.0021

A.采用帶熒光標(biāo)記的MiR- 146a模擬物轉(zhuǎn)染6 h后，被成功轉(zhuǎn)染的BV2細(xì)胞在激光共聚焦顯微鏡下發(fā)出綠色熒光(×100)；B. MiR- 146a模擬物轉(zhuǎn)染48 h后，采用PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中MiR- 146a的相對(duì)表達(dá)量

A.the BV2 cells were shown in green when transfected 6 h by MiR- 146a mimics under laser scanning confocal microscope(×100)；B.the MiR- 146a relative expression in BV2 cells after transfected 48 h by MiR- 146a mimics

圖1MiR- 146a轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

Fig1The transfection of MiR- 146a mimics

MiR- 146a模擬物轉(zhuǎn)染對(duì)LPS刺激后BV2細(xì)胞TLR4通路上TRAF6和IRAK1基因及蛋白表達(dá)水平的影響M+L組的TRAF6分子在基因水平(t=5.353，P=0.0007)和蛋白水平(t=6.980，P=0.0009)表達(dá)較L組明顯降低，IRAK1分子在基因(t=1.068，P=0.3166)和蛋白水平(t=2.168，P=0.0824)表達(dá)與L組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2、3)。

討論

神經(jīng)病理性疼痛是一種頑固性的慢性疼痛，傳統(tǒng)觀念認(rèn)為其主要是由神經(jīng)元功能改變所引起的，目前對(duì)其機(jī)制研究主要集中于神經(jīng)元，而絕大多數(shù)治療藥物也是針對(duì)神經(jīng)元中的分子機(jī)制，但并沒(méi)有取得良好的控制疼痛效果。隨著對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)研究的深入，膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)病理性疼痛中的作用得到關(guān)注，不少研究都揭示膠質(zhì)細(xì)胞參與了神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生及長(zhǎng)期維持過(guò)程[10- 14]。當(dāng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞被激活后，釋放出大量神經(jīng)活性物質(zhì)、細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，這些物質(zhì)的釋放會(huì)引起神經(jīng)炎癥和免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能紊亂。所以，盡管目前神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，但許多學(xué)者認(rèn)為，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生有著密切的關(guān)系[15]。

a：t=5.353，P=0.0007

TRAF6：腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6；IRAK1：白細(xì)胞介素- 1受體相關(guān)激酶1

TRAF6：tumor necrosis factor receptor-associated factor 6；IRAK1：interleukin- 1 receptor-associated kinase 1

圖2各組TRAF6和IRAK1 mRNA相對(duì)表達(dá)結(jié)果的比較

Fig2Comparison of relative mRNA expression levels of TRAF6 and IRAK1 among all groups

a：t=6.980，P=0.0009

圖3各組TRAF6和IRAK1蛋白分子相對(duì)表達(dá)水平的比較

Fig3Comparison of relative protein expression levels of TRAF6 and IRAK1 among all groups

小膠質(zhì)細(xì)胞約占中樞神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的5%～10%[16]。近年有研究證實(shí)，各種神經(jīng)病理情況導(dǎo)致的小膠質(zhì)細(xì)胞激活，可以產(chǎn)生多種促炎癥因子，如IL- 1β、IL- 6和TNFα等，進(jìn)而參與到神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生與發(fā)展[17- 19]。同時(shí)也有研究證實(shí)，在神經(jīng)病理性疼痛中，這些細(xì)胞因子出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，而針對(duì)這些細(xì)胞因子所進(jìn)行的干預(yù)治療措施，可以改變神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生與維持[20- 25]。

MiR- 146a在疼痛研究領(lǐng)域目前尚未得到廣泛關(guān)注，針對(duì)性研究不多，主要是在關(guān)節(jié)炎性疼痛患者和動(dòng)物模型中探討MiR- 146a的作用機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了MiR- 146a的異常表達(dá)與有效干預(yù)疼痛的效果[26- 28]。本課題組前期研究顯示，神經(jīng)病理性疼痛動(dòng)物模型中出現(xiàn)了MiR- 146a的異常表達(dá)[9]。本研究首先采用合成的MiR- 146a模擬物對(duì)BV2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后BV2細(xì)胞內(nèi)的MiR- 146a表達(dá)水平顯著提高。隨后利用LPS去刺激BV2細(xì)胞，結(jié)果證實(shí)MiR- 146a可明顯下調(diào)IL- 6和TNFα這兩種炎癥介質(zhì)的表達(dá)水平。為進(jìn)一步證實(shí)MiR- 146a這一負(fù)反饋機(jī)制的作用環(huán)節(jié)，本研究還檢測(cè)了TLR4信號(hào)通路TRAF6和IRAK1分子的表達(dá)水平，結(jié)果顯示在MiR- 146a轉(zhuǎn)染后，TRAF6基因和蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)，提示MiR- 146a在BV2細(xì)胞中的這一負(fù)反饋機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控TLR4信號(hào)通路中的TRAF6分子達(dá)到目的。

綜上，本研究結(jié)果顯示，上調(diào)MiR- 146a表達(dá)水平可以降低BV2細(xì)胞激活后的IL- 6和TNFα表達(dá)水平，該作用可能是通過(guò)靶向分子TRAF6得以實(shí)現(xiàn)，MiR- 146a有望成為治療神經(jīng)病理性疼痛的一個(gè)新靶點(diǎn)。

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Effect of High MiR- 146a Expression on the Inflammatory Reaction in BV2 Cells

ZHAO Na1，SHEN Le1，JIANG Hao-wu2，MA Chao2，HUANG Yu-guang1

1Department of Anesthesiology，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China2Department of Anatomy，Histology and Embryology，Institute of Basic Medical Sciences， CAMS and PUMC，Beijing 100005，China Corresponding author：HUANG Yu-guangTel：010- 69152058，E-mail：garybeijing@163.com

ABSTRACT：ObjectiveTo explore the effect of MiR- 146a regulator function on the inflammatory response in neuroglia cell (microglia).MethodsBV2 cells were transfected by MiR- 146a mimics，and then stimulated by lipopolysaccharide (LPS). MiR- 146a expression was measured by real-time polymerase chain reaction (real-time PCR). Interleukin (IL)- 6 and tumor necrosis factor α (TNFα) were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore，IL- 1 receptor-associated kinase 1 (IRAK1) and TNF receptor-associated factor 6 (TRAF6) were detected by PCR and Western blotting. ResultsCompared to the normal control group，MiR- 146a expression was significantly elevated by transfection with MiR- 146a mimics (t=5.846，P=0.0021). The expression levels of IRAK1，TRAF6，TNFα，and IL- 6 significantly increased in the LPS-stimulated BV2 cells compared to the non-stimulated BV2. The enhancement of MiR- 146a resulted in significantly decreased IL- 6 (t=5.200，P=0.0003) and TNFα (t=9.812，P<0.0001) secretion. The mRNA (t=5.353，P=0.0007) and protein (t=6.980，P=0.0009) levels of TRAF6，but not IRAK1，also significantly decreased. ConclusionMiR- 146a may negatively suppress the inflammatory response of BV2 cells by regulating the expression of IRAF6 molecules in the TLR4 signaling pathway.

Key words：MiR- 146a；microglia；neuropathic pain；pro-inflammatory cytokines

(收稿日期：2015- 02- 12)

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.01.005

中圖分類號(hào):R4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào)：1000- 503X(2016)01- 0027- 06

通信作者：黃宇光電話：010- 69152058，電子郵件：garybeijing@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31070930、81200869)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(31070930，81200869)