范　猛，姜文學(xué)，汪愛媛，彭　江，張　莉，許文靜，盧世璧

1天津市第一中心醫(yī)院骨科，天津 300192　2中國人民解放軍總醫(yī)院骨科研究所，北京 100853

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·論著·

鴯鹋股骨頭壞死兩種修復(fù)方式骨顯微結(jié)構(gòu)變化的比較

范猛1，2，姜文學(xué)1，汪愛媛2，彭江2，張莉2，許文靜2，盧世璧2

1天津市第一中心醫(yī)院骨科，天津 3001922中國人民解放軍總醫(yī)院骨科研究所，北京 100853

摘要：目的比較鴯鹋股骨頭壞死不同造模方式股骨頭骨顯微結(jié)構(gòu)的差異。方法成年鴯鹋15只，分為3組，每組5只，均以右側(cè)股骨頭為研究對象：第1組為正常組，不做處理；第2組為冷凍建立模型組，通過液氮和射頻冷熱交替的方式建立股骨頭壞死塌陷模型；第3組為乙醇建立模型組，通過局部注射無水乙醇的方式建立股骨頭壞死塌陷前模型。造模成功后分別取各個實驗動物右側(cè)股骨標本，股骨標本近端行顯微計算機斷層攝影掃描，并進行3組標本骨顯微結(jié)構(gòu)參數(shù)的比較和統(tǒng)計分析。結(jié)果所有鴯鹋術(shù)后無明顯感染征象，未發(fā)生實驗動物異常死亡。與正常組相比，冷凍建立模型組骨小梁改建后骨礦物量(P=0.015)和骨小梁間距(P=0.001)明顯減少，骨體積比(P=0.036)、骨表面積/體積比(P=0.032)和骨小梁數(shù)目明顯增加(P=0.002)，骨小梁厚度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.060)。與正常組相比，乙醇建立模型組骨小梁改建后骨礦物量明顯增高(P=0.001)、骨小梁厚度(P=0.003)和骨表面積/體積比(P=0.022)明顯增加，骨小梁間距(P=0.001)和骨體積比(P=0.001)明顯減少，骨小梁數(shù)目差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.143)。與乙醇建立模型組比較，冷凍建立模型組的骨礦物量(P=0.001)、骨小梁厚度(P=0.001)和骨體積比(P=0.001)明顯減低，骨表面積/體積比(P=0.022)和骨小梁數(shù)目(P=0.003)明顯增高，骨小梁間距差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.398)。結(jié)論不同修復(fù)方式可造成重建后股骨頭負重區(qū)骨小梁結(jié)構(gòu)及骨密度的不同，產(chǎn)生的重建骨小梁骨質(zhì)量也不同。

關(guān)鍵詞：股骨頭缺血性壞死；動物模型；骨小梁；鴯鹋；顯微結(jié)構(gòu)

ActaAcadMedSin，2016,38(1)：16-21

股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)是骨科常見的一種難治性疾病，好發(fā)于中青年，自然進展快，致殘率高[1]。本課題組前期研究通過液氮冷凍及局部注射無水乙醇的方式分別建立了鴯鹋的ONFH動物模型，發(fā)現(xiàn)鴯鹋在不同建模方法中體現(xiàn)了明顯不同的病理狀態(tài)，表現(xiàn)為不同的修復(fù)方式和截然不同的塌陷率[2- 3]。已有研究證實，不同修復(fù)方式會造成ONFH后的不同結(jié)局，并建議通過了解患者的修復(fù)方式采取個體化治療[4- 5]。但ONFH的標本獲取較為困難[5]，如果通過無創(chuàng)影像學(xué)檢查可以確認骨壞死的修復(fù)方式，則無疑有利于ONFH的個體化治療。本研究比較了鴯鹋股骨頭壞死不同造模方式股骨頭骨顯微結(jié)構(gòu)的差異，試圖發(fā)現(xiàn)不同修復(fù)方式的不同骨顯微結(jié)構(gòu)改建特點，以期更好地進行ONFH機制及治療個體化研究。

材料和方法

實驗動物及分組健康成年雄性鴯鹋15只，月齡>12個月，體重(50.0±4.6)kg，由中國人民解放軍總醫(yī)院動物實驗中心提供。分為3組，每組5只，均以右側(cè)股骨頭為研究對象：第1組為正常組，不做處理；第2組為冷凍建立模型組，通過液氮和射頻冷熱交替的方式建立ONFH塌陷模型[3]；第3組為乙醇建立模型組，通過局部注射無水乙醇的方式建立ONFH塌陷前模型[2]。

影像學(xué)檢查造模成功后分別取各個實驗動物右側(cè)股骨標本，股骨標本近端行顯微計算機斷層攝影(micro-computed tomography，Micro-CT)(explore Locus，美國GE公司)掃描，掃描分辨率為46 μm，單次掃描時間18 min。于中國人民解放軍總醫(yī)院骨組織庫采取1枚成人股骨頭壞死塌陷標本和1枚成人健康股骨頭標本掃描進行圖像對照。

計算方法以Micro-CT機器附帶的GE Microview軟件進行圖像后處理。在各組股骨頭軟骨下區(qū)域負重區(qū)選取4 mm×4 mm×4 mm范圍股骨頭作為研究興趣區(qū)，分別計算骨礦物量，骨小梁厚度、間距、數(shù)目，骨體積比，骨表面積/體積比。通過Miroview軟件功能獲取興趣區(qū)內(nèi)不同厚度骨小梁分布比例數(shù)據(jù)。

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，3組間及組內(nèi)數(shù)據(jù)差異比較采用單因素ANOVA分析，此后各組的兩兩比較采用LSD檢驗，數(shù)據(jù)方差齊性分析采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一般情況所有鴯鹋術(shù)后無明顯感染征象，未發(fā)生實驗動物異常死亡。與健康成人股骨頭比較，成年鴯鹋股骨頭的骨小梁明顯稀疏，但排列方式與人類類似，均表現(xiàn)為骨小梁方向多垂直于關(guān)節(jié)面，小梁寬度及間隙較為均勻，靠近關(guān)節(jié)面小梁較為細密(圖1)。

各組間骨顯微結(jié)構(gòu)參數(shù)的比較與正常組相比，冷凍建立模型組骨小梁改建后骨礦物量(P=0.015)和骨小梁間距(P=0.001)明顯減少，骨體積比(P=0.036)、骨表面積/體積比(P=0.032)和骨小梁數(shù)目明顯增加(P=0.002)，骨小梁厚度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.060)(圖2、表1)。在人類塌陷股骨頭中也可見類似改變(圖3)。

Micro-CT：顯微計算機斷層攝影

Micro-CT：micro-computed tomography

A.正常成人股骨頭結(jié)構(gòu)，小梁緊密，排列規(guī)則；B. 正常鴯鹋Micro-CT冠狀面圖，與人類相比，股骨頭內(nèi)小梁明顯稀疏，但排列方式與人類類似，骨小梁方向多垂直于關(guān)節(jié)面，間距及寬度較為均勻

A.normal femoral head bone structure of adult human，in which the trabecula ranged regularly and tightly；B.normal femoral head bone structure of adult emu，in which the trabecula ranged regularly as human’s，though much loosely；the trabecula is often vertical to the articular surface，with relatively even spacing and width

圖1正常人與正常鴯鹋股骨頭結(jié)構(gòu)的比較

Fig1Comparision of normal femoral head structure between human and emu

與正常組相比，乙醇建立模型組骨小梁改建后骨礦物量明顯增高(P=0.001)、骨小梁厚度(P=0.003)和骨表面積/體積比(P=0.022)明顯增加，骨小梁間距(P=0.001)和骨體積比(P=0.001)明顯減少，骨小梁數(shù)目差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.143)(圖4、表1)。

與乙醇建立模型組相比，冷凍建立模型組的骨礦物量(P=0.001)、骨小梁厚度(P=0.001)和骨體積比(P=0.001)明顯減低，骨表面積/體積比(P=0.022)和骨小梁數(shù)目(P=0.003)明顯增高，骨小梁間距差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.398)(表1)。

A. 2號鴯鹋16周(已明顯塌陷)；B. 3號鴯鹋16周圖像(已輕度塌陷)

A. emu 2# at week 16 (obvious collapse)；B. emu 3# at week 16 (mild collapse)

圖2冷凍建立模型組鴯鹋股骨頭Micro-CT冠狀位圖像，可見負重區(qū)關(guān)節(jié)面塌陷，塌陷區(qū)域骨小梁改建明顯，軟骨下骨表現(xiàn)為細小密集的骨小梁，更接近正常區(qū)的交界骨小梁表現(xiàn)為小梁寬度增粗

Fig2Coronal Micro-CT images of emu femoral head in cryogen group，showing collapse at weight-bearing area；the corresponding subcondral trabecula became samller and arraged more tightly，and the trabecula at connected transtitional area became thicker

表 1　3組骨顯微結(jié)構(gòu)參數(shù)的比較(n=5，x-±s)

BMD：骨礦物量；TbTh：骨小梁厚度；TbSp：骨小梁間距；BVF：骨體積比；BS/BV：骨表面積/體積比；TbN：骨小梁數(shù)目；與正常組比較，aP<0.05，bP<0.01；與冷凍建立模型組比較，cP<0.05，dP<0.01

BMD：bone mineral density；TbTh：trabecular thickness；TbSp：trabecular space；BVF：bone volume fraction；BS/BV：bone surface/volume fraction；TbN：trabecular numbers；aP<0.05，bP<0.01 compared with normal group；cP<0.05，dP<0.01 compared with cryogen group

各組間不同厚度骨小梁分布情況比較結(jié)果顯示，與正常組相比，冷凍建立模型組骨小梁寬度較小的骨小梁所占比率較高，而乙醇建立模型組則厚度較大的骨小梁所占比率較高(圖5)。與正常組相比，冷凍建立模型組負重區(qū)骨小梁改建后小梁厚度分布波峰左移，乙醇建立模型組骨小梁厚度分布波峰右移(圖6)。

A.鴯鹋；B.成人

A.emu；B.human

圖3鴯鹋與人類塌陷股骨頭標本可見類似改變：負重區(qū)關(guān)節(jié)面塌陷，塌陷區(qū)域骨小梁改建明顯，部分軟骨下骨表現(xiàn)為細小密集的骨小梁，頭內(nèi)接近正常區(qū)骨質(zhì)的交界區(qū)骨小梁表現(xiàn)為小梁寬度增粗

Fig3The collapsed femoral heads of emu and human show simialr changes：collapse occured at weight-bearing area,the trabecula at corresponding area remarkably changed,the subcondral trabecula became samller and arraged more tightly,and the trabecula at connected transtitional area became thicker

A.1號鴯鹋6月圖像(負重區(qū)骨小梁大部改建)；B.2號鴯鹋6月圖像(負重區(qū)骨小梁基本完全改建)

A.emu 1# at month 6 (most trabecula in weight-bearing area has been repaired)；B.emu 2# at month 6 (nearly all trabecula in weight-bearing area has been repaired)

圖4乙醇建立模型組鴯鹋股骨頭Micro-CT冠狀位圖像，可見大片骨質(zhì)出現(xiàn)小梁增粗，但骨小梁排列仍整齊

Fig4Coronal Micro-CT images of emu femoral head in ethanol group，showing a lot of trabecula becoming thicker but still arranged regularly

與正常組比較，aP<0.05；與冷凍建立模型組比較，bP<0.05

aP<0.05 compared with normal group；bP<0.05 compared with cryogen group

圖5各組鴯鹋股骨頭負重區(qū)不同寬度骨小梁厚度分布比率比較

Fig5Comparison of the trabecular thickness ratio at weight-bearing area among all groups

圖6骨小梁厚度分布曲線

Fig6Distribution curve of trabecular thickness ratio

討論

ONFH后修復(fù)方式不同可造成ONFH不同進程和結(jié)局的理論由來已久[6]。破壞性修復(fù)被認為是造成股骨頭軟骨下骨骨折塌陷的主要原因，最終通常會因股骨頭塌陷而需進行髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)治療[7- 8]。雖然有多種的保頭治療措施可以改善ONFH的臨床癥狀，或者采用干細胞等方式來改善股骨頭的修復(fù)，但對于破壞性修復(fù)的ONFH而言，其結(jié)果往往仍然是股骨頭的塌陷[4，8]，而非破壞性修復(fù)的修復(fù)方式則通常不會出現(xiàn)股骨頭塌陷[7，9- 12]，應(yīng)根據(jù)ONFH的修復(fù)方式選擇個體化治療措施[5]。

本課題組以往通過局部注射的方法成功建立了鴯鹋的ONFH模型[2]，實驗動物均有不同程度的骨壞死表現(xiàn)，伴有骨修復(fù)反應(yīng)，已經(jīng)通過對模型的組織學(xué)評價證實其修復(fù)方式為重建性修復(fù)[2，13- 14]。本課題組還采用冷熱交替的方法建立了鴯鹋的股骨頭缺血性壞死塌陷模型[3]，實驗動物表現(xiàn)為較高的塌陷率，在前期模型組織學(xué)評價中發(fā)現(xiàn)修復(fù)方式表現(xiàn)為破壞性修復(fù)[3- 4]。本研究比較了不同骨壞死修復(fù)方式下的骨顯微結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同修復(fù)方式下骨改建的形式也具有明顯差異，兩者之間的骨顯微結(jié)構(gòu)也存在明顯差異。破壞性修復(fù)形成的小梁較細小密集，骨密度低，骨小梁的顯微結(jié)構(gòu)中以較小厚度的為主，從而易于塌陷；重建性修復(fù)修復(fù)改建后的骨質(zhì)小梁較粗，且密集，而且保持著原有的排列，骨小梁顯微結(jié)構(gòu)中以較高厚度的為主，具有較好的力學(xué)性能。

國內(nèi)外研究顯示，在破壞性修復(fù)，修復(fù)快速，病程短，成骨明顯滯后于破骨，纖維組織填充，形成囊性變，影響股骨頭力學(xué)強度；而在重建性修復(fù)，則可能表現(xiàn)為成骨與破骨的相對同步，實現(xiàn)死骨的爬行替代，對股骨頭的力學(xué)強度影響較小[4- 5]。本研究結(jié)果顯示，破壞性修復(fù)所造成的股骨頭力學(xué)強度減低，不僅僅局限于成骨滯后于破骨纖維填充出現(xiàn)囊性變，而且其成骨后形成的新的小梁結(jié)構(gòu)相對于健康骨小梁的強度也不足，可能是引發(fā)股骨頭的塌陷力學(xué)原因。本研究還發(fā)現(xiàn)有的鴯鹋并沒有出現(xiàn)明顯的囊性變，也出現(xiàn)了塌陷，這也很好的驗證了這一點。而引發(fā)這種小梁形式的差異，筆者考慮與快速破骨后成骨過程無原有框架，且在破壞性修復(fù)過程中血供豐富，新骨間廣泛分布髓腔多個成骨中心有關(guān)。

本研究中，冷凍建立模型組與正常股骨頭在負重區(qū)骨小梁厚度平均值并沒有顯著差異，但通過對不同厚度骨小梁分布情況研究發(fā)現(xiàn)，冷凍建立模型組骨小梁厚度分布峰值明顯左移，顯示其改建后小梁厚度出現(xiàn)了減小。雖然冷凍造模組骨小梁分布曲線未表現(xiàn)出波峰頂點位置，但已明顯左移，推測未出現(xiàn)頂點確切位置與本研究中所采用的Micro-CT掃描精度有關(guān)，本研究采用了45 μm精度進行掃描，不能分析更細的小梁結(jié)構(gòu)。本課題組將在后期研究中采用更高的精度進行分析，以進一步明確冷凍后改建小梁的厚度分布。

通過統(tǒng)計學(xué)的對照分析，本研究證實兩種不同修復(fù)方式下存在著骨小梁顯微參數(shù)的明顯區(qū)別，同時均與正常的股骨頭結(jié)構(gòu)存在明顯差別，由此進一步驗證了不同修復(fù)方式會影響骨壞死不同的修復(fù)進程和骨壞死最終的結(jié)局。后期治療中，有望通過改變修復(fù)方式，進而改變骨重建方式而改變骨的顯微結(jié)構(gòu)，改善其力學(xué)性能而預(yù)防股骨頭塌陷。反之，也可能通過對于股骨頭進行高精度CT檢查，觀察骨小梁改建形態(tài)，來早期推斷ONFH的修復(fù)類型，在早期就進行針對性治療，包括影響ONFH的修復(fù)方式來保存股骨頭[15- 16]。

本研究存在以下不足：(1)樣本量較小。(2)測量過程中Micro-CT測量精度的選擇可影響結(jié)果的準確性。(3)未進行股骨頭造模后的力學(xué)測試，僅從骨小梁結(jié)構(gòu)與骨密度改變及不同病程推測股骨頭力學(xué)狀態(tài)改變。在后期的研究中，本課題組將結(jié)合生物力學(xué)測試進一步進行驗證。

綜上，本研究結(jié)果顯示，不同修復(fù)方式可造成重建后股骨頭負重區(qū)不同的骨小梁結(jié)構(gòu)及骨密度，產(chǎn)生股骨頭壞死病程中不同的骨質(zhì)量，從而影響股骨頭壞死的結(jié)局。破壞性修復(fù)形成的小梁較細小密集，骨密度低，易于塌陷；重建性修復(fù)則修復(fù)改建后骨質(zhì)小梁較粗，且密集，而且保持著原有的排列，具有較好的力學(xué)性能。本研究有利于加深對于ONFH塌陷機制的認識，指導(dǎo)治療措施。而且可能通過對股骨頭骨小梁結(jié)構(gòu)改變方式的研究從而以無創(chuàng)的方式確定其修復(fù)方式，進而實現(xiàn)ONFH的個體化治療。

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Comparisons of Emu Necrotic Femoral Head Micro Structure Repaired in Two Different Methods

FAN Meng1，2，JIANG Wen-xue1，WANG Ai-yuan2，PENG Jiang2，ZHANG Li2，XU Wen-jing2，LU Shi-bi2

1Department of Orthopeadics，Tianjin First Center Hospital，Tianjin 300192，China2Institute of Orthopeadics，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China Corresponding author：PENG JiangTel：010- 66939202，E-mail：pengjiang301@126.com

ABSTRACT：ObjectiveTo compare emu necrotic femoral head micro structure repaired in two different methods.MethodsFifteen adult emus were divided into 3 groups(all n=5)，and the right femoral head was selected to research. The first group was the control group；in the second group，femoral head necrosis was made by cryogen with liquid nitrogen；and in the third group，femoral head necrosis was made by local pure ethanol injection. Right femurs were taken for micro CT examination，then femoral head micro structures were compared among these three groups. ResultsNo infection or unexpected death was found in all groups. Compared with normal group，necrotic femoral heads in cryogen group showed that bone mineral density significantly reduced after repaire (P=0.015)，trabecular space significantly reduced (P=0.001)，bone volume fraction significantly enlarged (P=0.036)，bone surface/volume fraction (P=0.032) and trabecular numbers (P=0.002)significantly enlarged；trabecular thickness showed no significant difference (P=0.060). Compared with control group，necrotic femoral heads in ethanol group showed that bone mineral density significantly enlarged after repaire (P=0.001)，trabecular thickness (P=0.003) and bone surface/volume fraction (P=0.022) significantly enlarged，trabecular space (P=0.001) and bone volume fraction (P=0.001) significantly reduced；the trabecular numbers showed no significant difference (P=0.143). Compared with ethanol group，necrotic femoral heads in cryogen group showed significant lower bone mineral density after repair (P=0.001)，significantly lower bone volume fraction (P=0.001)，significantly lower trabecular thickness (P=0.001)，significantly higher bone surface/volume fraction (P=0.022) and higher trabecular numbers (P=0.003)；the trabecular space showed no significant difference (P=0.398). ConclusionDifferent repair methods make reconstructed femoral head weight bearing area have different bone structure and bone mineral density，along with different bone trabecular quality.

Key words：femoral head necrosis；animal model；trabecula；emu；micro structure

(收稿日期：2015- 04- 17)

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.01.003

中圖分類號:R68

文獻標志碼:A

文章編號：1000- 503X(2016)01- 0016- 06

通信作者：彭江電話：010- 66939202，電子郵件：pengjiang301@126.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金重點項目(30930092)和天津市衛(wèi)生局科技基金(2012KY09)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China (30930092)and the Tianjin Health Bureau Technology Fund(2012KY09)