鄒樹平,廖思行,?！±?鄭裕國(guó),沈寅初

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

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棘白菌素B脫?；腹こ叹臉?gòu)建及酶學(xué)性質(zhì)研究

鄒樹平,廖思行,牛坤,鄭裕國(guó),沈寅初

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

摘要：棘白菌素B(ECB)脫?；改苓x擇性催化水解脫去ECB?；鶄?cè)鏈，得到ECB母核，可用于合成新型抗真菌藥物阿尼芬凈.從實(shí)驗(yàn)室保藏的猶他游動(dòng)放線菌(Actinoplanes utahensis)ZJB-0801基因組中克隆到ECB脫?；富颍⑵錁?gòu)建入表達(dá)質(zhì)粒pSET152，通過接合轉(zhuǎn)移的方法將表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入到天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)A3中，構(gòu)建可以高效表達(dá)ECB脫?；傅墓こ叹?對(duì)重組ECB脫?；傅拿笇W(xué)性質(zhì)進(jìn)行了考察，結(jié)果表明：重組酶的最適反應(yīng)溫度為45 ℃，最適pH為7.5.Zn2+，Mg2+，Mn2+，F(xiàn)e2+對(duì)重組酶有顯著的激活作用，而Cu2+，Co2+具有顯著地抑制作用.動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析表明：該酶對(duì)底物ECB的Km和Vmax分別為0.356 mmol/L和397 μmol/(min·mg).

關(guān)鍵詞：棘白菌素B脫?；?；天藍(lán)色鏈霉菌；重組表達(dá)；酶學(xué)性質(zhì)

近年來，由于免疫低下患者逐年增多，真菌感染發(fā)病率明顯升高，尤其是深部真菌感染的發(fā)病率和病死率顯著增加[1-2].棘白菌素(Echinocandins)類抗真菌藥物能夠非競(jìng)爭(zhēng)性地抑制真菌細(xì)胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶的活性，是臨床治療系統(tǒng)性真菌感染的新一代抗真菌藥物[3].與傳統(tǒng)抗真菌藥物相比，該類藥物具有作用機(jī)制獨(dú)特，毒副作用低，且對(duì)一些唑類和兩性霉素B耐藥的真菌具有很強(qiáng)的抗菌活性，是目前臨床治療深部真菌感染的“王牌抗生素”[4].目前，F(xiàn)DA已批準(zhǔn)的棘白菌素類新藥有卡泊芬凈(默沙東，2001年)、米卡芬凈(藤澤藥業(yè)，2005年)和阿尼芬凈(輝瑞，2006年)[5].

棘白菌素B(Echinocandins B, ECB)是由構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)發(fā)酵產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，是合成抗真菌藥物阿尼芬凈的前體化合物.ECB脫?；改苓x擇性催化水解ECB側(cè)鏈酰胺鍵生成ECB母核，是阿尼芬凈合成過程的關(guān)鍵酶[6].目前，已報(bào)道的ECB脫?；钢饕獊碓从讵q他游動(dòng)放線菌及鏈霉菌屬[7-10]，但野生酶普遍存在表達(dá)產(chǎn)量低，活性不高的問題.為了滿足日益增長(zhǎng)的生產(chǎn)需求，有關(guān)ECB脫?；父咝П磉_(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建逐漸引起了人們的關(guān)注.Kreuzman等[11]將源于游動(dòng)猶他放線菌的ECB脫酰基酶基因在S.lividansTK24中重組表達(dá)，獲得的重組酶活性比野生酶提高了4.1倍；Satoshi等[12]將FR901379脫?；富蛟赟.lividans1236中重組表達(dá)后，酶活提高了250倍；Inokoshi等[13]比較了不同的鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)ECB脫酰基酶表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)不同表達(dá)系統(tǒng)中酶的表達(dá)量及活性均存在顯著差異.天藍(lán)色鏈霉菌作為鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)中現(xiàn)已研究最完善的宿主菌之一，具有遺傳穩(wěn)定性高，胞外分泌能力強(qiáng)，能夠正確表達(dá)高GC%的基因片段等優(yōu)點(diǎn)，是理想的鏈霉菌表達(dá)宿主[14].根據(jù)數(shù)據(jù)庫序列設(shè)計(jì)引物，從實(shí)驗(yàn)室保存的猶他游動(dòng)放線菌基因組DNA中克隆獲得了ECB脫?；富?，構(gòu)建了該酶的天藍(lán)色鏈霉菌工程菌，并進(jìn)一步分析了其酶學(xué)性質(zhì)，旨在為ECB脫?；父咝П磉_(dá)及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo).

1材料與方法

1.1　材　料

游動(dòng)猶他放線菌ActinoplanesutahensisZJB-0801，天藍(lán)色鏈霉菌StreptomycescoelicolorA3，鏈霉菌質(zhì)粒pSET152菌來自于實(shí)驗(yàn)室保藏.Primix和DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量為Takara公司產(chǎn)品，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ，XbaⅠ，T4DNA連接酶均為Thermo公司產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒為大連寶生工生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，基因組提取試劑盒為MP公司產(chǎn)品.BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒為北京康為生物科技有限公司產(chǎn)品.PCR儀(Techne公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)分子儀器公司)；高效液相色譜儀LC-10TSPD-10A(日本島津公司生產(chǎn)).

1.2　重組質(zhì)粒pSET152-ecbD的構(gòu)建

編碼ECB脫?；富蚱瓮ㄟ^下列引物由猶他游動(dòng)放線菌中擴(kuò)增獲得.正向引物為5′-AAAACTAGATCTTGTTGGTCGAGAGGAAAG

ATC-3′；反向引物為5′-AAACCGCGGTGGCAGGTCCATGGGC-3′(Xha Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)用下劃線標(biāo)注).50 μL反應(yīng)體系中含有50 ng猶他游動(dòng)放線菌A.utahensisZJB-0801基因組，引物各200 ng，Primix 25 μL.PCR擴(kuò)增程序如下：98 ℃預(yù)變性5 min，30次擴(kuò)增循環(huán)(98 ℃×15 s，58 ℃×30 s，72 ℃×5 min)，72 ℃延伸10 min.瓊脂糖凝膠電泳回收擴(kuò)增片段，用XhaⅠ和EcoRⅠ雙酶切.酶切產(chǎn)物與雙酶切的pSET152載體通過T4連接酶進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中，陽性克隆序列分析由上海桑尼生物科技有限公司完成.序列正確的質(zhì)粒即獲得表達(dá)質(zhì)粒pSET152-ecbD.

1.3　重組S. coelicolorA3/pSET152-ecbD的構(gòu)建

將重組表達(dá)質(zhì)粒pSET152-ecbD導(dǎo)入E.coliET12567/pUZ8002，E.coliET12567/pUZ8002/pSET152-ecbD作為供體菌，培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6，離心收集菌體，用新鮮的2×YT培養(yǎng)基懸浮備用.刮取新鮮的S.coelicolorA3孢子，用2×YT打散懸浮，50 ℃水浴熱激處理10 min，置于37 ℃的搖床，預(yù)萌發(fā)3 h直至長(zhǎng)出芽管(或不處理)，將處理好的大腸桿菌和孢子懸液混合，稀釋100倍后涂布于含有10 mmol/L的MgCl2的MS平板，28 ℃培養(yǎng)，待培養(yǎng)至24 h，用含有50 μg/mL萘啶酮酸和安普霉素的1 mL水溶液均勻覆蓋平板表面進(jìn)行抗生素覆蓋.將平板繼續(xù)置于28 ℃培養(yǎng)7～10 d，直至菌落面積穩(wěn)定.

1.4　重組S.coelicolorA3/pSET152-ecbD的復(fù)選

用切割器將選擇性平板上的轉(zhuǎn)化子菌落切成直徑為1 cm的菌塊，轉(zhuǎn)接到帶抗性的MS平板上，30 ℃培養(yǎng)7～10 d，定時(shí)觀察并記錄生長(zhǎng)直徑.從中選出生長(zhǎng)速率快、菌落直徑大的單菌落轉(zhuǎn)化子.篩選得到的陽性接合轉(zhuǎn)移子接種于含有抗生素的液體TSBY培養(yǎng)基(TSB質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，酵母提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%，蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37%)中培養(yǎng)48 h，收集菌絲體，提取總DNA作為模板，以pSET152-ecbD質(zhì)粒為陽性對(duì)照，以S.coelicolorA3的總DNA為陰性對(duì)照，利用1.2的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證.PCR條件反應(yīng)程序?yàn)?8 ℃預(yù)變性5 min，30次擴(kuò)增循環(huán)(98 ℃×15 s，58 ℃×30 s，72 ℃×255 s)，72 ℃延伸10 min.

1.5　重組ECB脫酰基酶在S. coelicolorA3中表達(dá)

將重組菌株S.coelicolorA3/pSET152-ecbD鏈霉菌孢子接種于50 mL含有安普霉素(50 μg/mL)的種子培養(yǎng)基TSBY中，于30 ℃搖床(轉(zhuǎn)速200 r/min)培養(yǎng)24 h后，按5%的接種量轉(zhuǎn)接50 mL鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2.5%，黃豆餅粉1%，CaCO30.3%，NaCl 0.3%，(50 μg/mL安普霉素)，30 ℃搖床(轉(zhuǎn)速200 r/min)，培養(yǎng)3 d.

1.6　ECB脫?；该富顧z測(cè)

離心取發(fā)酵上清液，加入ECB(200 μg/mL)，KH2PO4(0.05 mol/L，pH=6.5)，助溶劑乙醇(體積比為5%)，35 ℃，200 r/min反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后加入乙酸(體積比2%)終止反應(yīng).取樣1 mL，HPLC檢測(cè)產(chǎn)物ECB母核生成量.酶活的定義為一個(gè)酶活力單位為在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下每分鐘內(nèi)由底物ECB生成1 μmol產(chǎn)物ECB母核所需的酶量.用BAC總蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù).

1.7　HPLC檢測(cè)條件

采用高效液相色譜儀LC-10TSPD-10A(日本島津公司生產(chǎn))，依利特C18柱Hypersil ODS2 5 μm(4.6 mm×250 mm)；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，流速1 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量：20 μL，流動(dòng)相：V(乙腈)∶V(質(zhì)量比0.2%的乙酸銨水溶液)=5∶95，出峰時(shí)間：10.7 min.

2結(jié)果與分析

2.1　重組S. coelicolorA3/pSET152-ecbD的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pSET152-ecbD大小共9.8 kb，含有大小4.3 kb的ECB脫?；富颍渲邪珹n抗性基因，促進(jìn)異源基因在鏈霉菌中表達(dá)的ABC-轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因和ermE*P強(qiáng)啟動(dòng)子(圖1).該重組質(zhì)粒通過大腸桿菌-鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移，導(dǎo)入S.coelicolorA3中.按照1.3的方法進(jìn)行E.coliET12567/pUZ8002接合轉(zhuǎn)移S.coelicolorA3，鏈霉菌孢子作為宿主.孢子經(jīng)50 ℃萌發(fā)處理后，大腸桿菌和鏈霉菌孢子混合液涂布的MS平板上，菌落長(zhǎng)出較為密集，在稀釋100倍的平板上長(zhǎng)出的菌落個(gè)數(shù)為257個(gè)，且生長(zhǎng)速度較快，在培養(yǎng)2 d后有菌落長(zhǎng)出，待培養(yǎng)8 d，菌落大小基本不變；而未經(jīng)萌發(fā)處理的孢子，在稀釋100倍的MS平板上長(zhǎng)出的菌落為46個(gè)，在培養(yǎng)13 d后菌落生長(zhǎng)緩慢，大小基本不變，說明雖然萌發(fā)處理孢子并非必須步驟，但是能夠節(jié)省約5 d的培養(yǎng)時(shí)間，并提將轉(zhuǎn)化效率提高5倍左右.

圖1　含有ECB脫酰基酶基因的pSET152-ecbD質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1　Construction of expression plasmid pSET152-ecbD

2.2　轉(zhuǎn)化子復(fù)篩

參照1.4實(shí)驗(yàn)方法，在MS培養(yǎng)基上對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行復(fù)篩，從中篩選出4株生長(zhǎng)速度較快，菌落直徑較大，均在0.5 cm以上的菌落(表1).依次編號(hào)為1～4.經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證，從4株轉(zhuǎn)化子的基因組中均可以擴(kuò)增得到大小約4.3 kb的條帶(圖2)，說明目的基因已經(jīng)導(dǎo)入鏈霉菌宿主細(xì)胞中.

表1天藍(lán)色鏈霉菌轉(zhuǎn)化子在MS培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

Table 1The growth of S. coelicolortransformants on MS screening media

轉(zhuǎn)化子參數(shù)MS平板上的生長(zhǎng)情況1)平均直徑2)/cm0.1~0.30.3~0.50.5~0.8菌落數(shù)量/個(gè)102514比例/%39.719.81.6

注：1) 以黃豆餅粉為唯一碳源的制備培養(yǎng)基；2) 測(cè)量菌落直徑，重復(fù)三次取平均值.

M—marker；1～4—轉(zhuǎn)化子基因組中PCR獲得的條帶；5—質(zhì)粒pSET152-ecbD中PCR獲得的條帶；6—S. coelicolor基因組中PCR獲得的條帶圖2　天藍(lán)色鏈霉菌中ECB脫?；富騌CB檢測(cè)Fig.2　Electrophoresis of ECB deacylase gene with 4.3 kb obtained by PCR from the chromosomal DNA of recombinant S.coelicolor

2.3　ECB脫?；富蛟谔焖{(lán)色鏈霉菌中的表達(dá)

將復(fù)篩得到的4株轉(zhuǎn)化子經(jīng)種子培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng).根據(jù)1.6的方法檢測(cè)發(fā)酵液上清液酶活(圖3).結(jié)果顯示：篩選得到的4株轉(zhuǎn)化子菌株顯示了不同的ECB脫酰基酶活性，其中編號(hào)3菌株的酶活最高，酶活為336 mU/mL，與原始菌株相比，活性提高了2.8倍.Inokoshi等[10]將游動(dòng)放線菌ECB脫?；冈赟.lividansJT46中表達(dá)后，重組酶酶活力僅為31 mU/mL；Kreuzman等[11]構(gòu)建的S.lividansTK24重組菌的酶活為360 mU/mL；Ueda等[13]將鏈霉菌來源的FR901379脫?；富蛟赟.lividans1236中重組表達(dá)，酶活為14.7 U/mL.可以看出：S.coelicolorA3作為宿主菌，表達(dá)的ECB脫酰基酶是不同于其他宿主菌的.異源表達(dá)的重組蛋白活性往往受到多種因素的影響[15-17].

圖3　不同天藍(lán)色鏈霉菌轉(zhuǎn)化子產(chǎn)重組ECB脫?；富盍Ρ容^Fig.3　Echinocandins B deacylase activity of different transformants

2.4　重組ECB脫?；该笇W(xué)性質(zhì)研究

2.4.1重組ECB脫?；傅淖钸m溫度

在酶促反應(yīng)中，溫度對(duì)催化劑的活性和穩(wěn)定性都會(huì)產(chǎn)生影響，同時(shí)溫度還會(huì)對(duì)反應(yīng)的平衡產(chǎn)生影響.測(cè)定了ECB脫?；冈?0～70 ℃下轉(zhuǎn)化ECB的活力.由圖4可知：隨著溫度的升高，ECB脫酰基酶酶活逐漸升高，當(dāng)溫度達(dá)到45 ℃時(shí)，顯示了最高酶活力，繼續(xù)升高溫度，酶活迅速降低，因此，確定其最適反應(yīng)溫度為45 ℃.Inokoshi等[13]將猶他游動(dòng)放線菌來源的ECB脫?；富蛟赟.lividansJT46中重組表達(dá)后，重組酶最適溫度為60 ℃，Kreuzman等[11]構(gòu)建的S.lividansTK24重組菌酶催化反應(yīng)的最適溫度為65 ℃；常青等[5]構(gòu)建的S.lividans重組菌產(chǎn)ECB脫?；?，催化反應(yīng)所選的溫度為30 ℃；Satoshi等[12]將FR901379脫?；富蛟赟.lividans1236中重組表達(dá)，催化反應(yīng)所選的最適溫度為50 ℃，說明不同宿主菌對(duì)表達(dá)ECB脫酰基酶有重要的影響.

圖4　ECB脫?；傅淖钸m溫度和溫度穩(wěn)定性Fig.4　Optimal reaction temperature of echinocandins B deacylase

2.4.2重組ECB脫酰基酶的最適pH

在酶促反應(yīng)中，相緩沖液的pH值不僅改變了反應(yīng)中底物和帶有電荷的酶的離子狀態(tài)，還會(huì)對(duì)酶的催化活性產(chǎn)生影響[10].在pH為4.5～10.0的緩沖液中反應(yīng)，測(cè)ECB脫酰基酶在不同pH下反應(yīng)的酶活.由圖5可知：隨著pH的升高，ECB脫?；该富钪饾u升高，當(dāng)pH=7.5時(shí)，顯示了最高酶活力，繼續(xù)升高pH，酶活迅速降低，因此，該酶最適反應(yīng)pH=7.5，Kreuzman等[11]報(bào)道的重組ECB脫?；缸钸m為pH=6.5；Satoshi等[12]報(bào)道的鏈霉菌來源的FR901379脫?；缸钸mpH為8～9；Inokoshi等[13]構(gòu)建的重組S.lividansJT46，酶催化反應(yīng)時(shí)的pH=7.通過比較可以發(fā)現(xiàn)：S.coelicolorA3-ecbD產(chǎn)的ECB脫?；缸钸mpH與現(xiàn)已報(bào)道的重組菌最適pH均不同.

圖5　ECB脫?；傅淖钸mpHFig.5　Optimal reaction pH of echinocandins B deacylase

2.4.3金屬離子對(duì)重組ECB脫?；富盍Φ挠绊?/p>

據(jù)報(bào)道，某些一價(jià)、二價(jià)的金屬離子對(duì)重組ECB脫?；复呋磻?yīng)有促進(jìn)作用[11].在1.5的反應(yīng)體系中，加入常見的Ca2+，Mg2+，K+，Mn2+，F(xiàn)e2+，Cu2+，Co2+，使其終濃度為0.25～0.5 mol/L，反應(yīng)體系pH=7.5，在45 ℃，200 r/min轉(zhuǎn)化1 h，反應(yīng)結(jié)束后加入2%乙酸終止反應(yīng)，測(cè)定不同金屬離子作用下催化反應(yīng)的酶活.結(jié)果表明(表2)：Ca2+，Mg2+，K+，Mn2+，F(xiàn)e2+對(duì)催化反應(yīng)均有不同程度的促進(jìn)作用，分別提高了36.2%，21.1%，43.6%，2.4%，31.9%，K+的促進(jìn)作用最強(qiáng)；而Cu2+和Co2+對(duì)該酶有抑制作用，其中Co2+的抑制最強(qiáng)，相對(duì)酶活下降到了15.8%.Kreuzman等[11]研究也發(fā)現(xiàn)：K+對(duì)ECB脫?；复呋钚杂酗@著的激活作用，當(dāng)添加0.6 mol/L的K+時(shí)，其酶活提高約1.5倍.

表2　不同金屬離子對(duì)催化反應(yīng)的影響

2.4.4重組ECB脫?；复呋疎CB水解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

以ECB為底物，緩沖液為磷酸鈉緩沖液(pH=7.5，0.05 mol/L)，底物濃度分別為0.25，0.050，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00，3.50，4.00，4.50，5.00 g/L.總反應(yīng)體積都為20 mL.在45 ℃下反應(yīng)60 min，加入200 μL乙酸溶液(0. 5 mol /L)終止反應(yīng)，測(cè)定酶活.求得ECB脫?；复呋疎CB水解的Km和Vmax分別為0.356 mmol/L和397 μmol/(min·mg).

3結(jié)論

從A.utahensisZJB-0801從克隆到ECB脫?；富颍詐SET152作為表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建重組天藍(lán)色鏈霉菌基因工程菌，能夠高效表達(dá)ECB脫酰基酶，酶活330 mU/mL，是目前已報(bào)道ECB脫?；富钚缘妮^高水平.重組酶催化反應(yīng)的最適溫度為45 ℃，最適pH=7.5.Zn2+，Mg2+，Mn2+和Fe2+對(duì)ECB脫?；赣屑せ钭饔?，而Cu2+和Co2+對(duì)其有抑制作用.催化動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析表明：該酶對(duì)底物ECB的Km和Vmax分別為0.356 mmol/L和397 μmol/(min·mg).

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(責(zé)任編輯：陳石平)

Heterologous expression and enzymatic properties of echinocandins B deacylase inStreptomycescoelicolor

ZOU Shuping, LIAO Sixing, NIU Kun, ZHENG Yuguo, SHEN Yinchu

(College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Abstract:Echinocandin B (ECB) deacylase can catalyze echinocandin B. The side chain amide bond was removed. In this way, ECB nucleus was acquired. In the new antifungal, the chemical-enzymatic synthesis has important applications in the preparation of anidulafungin. Clone of ECB dealyse gene from Actinoplanes utahensis ZJB-0801, and linked into the overexpression vector pSET152．Then the plasmid was transformed into Streptomyces coelicolorA3．This genetically engineered strain could transform ECB into ECB nucleusand. Investigating its enzymatic properties, the results showed that the optimum temperature for the recombinant enzyme is 45 ℃, the optimum pH is 7.5. Zn2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+are activated on the recombinant enzyme. The Cu2+and Co2+are inhibition on the recombinant enzyme. Enzyme kinetic parameters Kmand Vmaxare 0.183 mmol / L and 0.085 μmol / min·mg, respectively.

Keywords:echinocandin B deacylase; Streptomyces coelicolor; recombinantion and expression; enzymatic properties

中圖分類號(hào)：Q814

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1006-4303(2016)01-0099-05

作者簡(jiǎn)介：鄒樹平(1980—)，男，湖南常德人，副教授，主要從事生物催化與微生物發(fā)酵制藥研究，E-mail：zousp@zjut.edu.cn.

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21176224)；教育部博士點(diǎn)新教師基金資助項(xiàng)目(2012331712004)

收稿日期：2015-04-01