劉　娣，王鑫鑫，別　墅，張冬杰，汪　亮，李　苓，曹　越（.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱　50030；.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱　50086）

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民豬NUMB基因克隆與組織表達(dá)分析

劉娣1,2，王鑫鑫1，別墅1，張冬杰2，汪亮2，李苓1，曹越1
（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱150086）

摘要：研究采用RT-PCR技術(shù)結(jié)合克隆測(cè)序方法，克隆出全長(zhǎng)2 004 bp NUMB基因序列，其中包括1 782 bp開(kāi)放讀碼框，該基因編碼592個(gè)氨基酸。利用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)該基因氨基酸序列預(yù)測(cè)與分析發(fā)現(xiàn)：NUMB蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中，轉(zhuǎn)角占很大比例，且蛋白親水性較強(qiáng)，結(jié)構(gòu)功能域分析發(fā)現(xiàn)該蛋白多肽鏈存在一個(gè)N端磷酸酪氨酸結(jié)構(gòu)域（PTB），位于第37~162氨基酸之間?；诓煌锓NNUMB蛋白序列所構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)表明，豬與牛、駱駝?dòng)H緣關(guān)系最近，而與斑馬魚(yú)最遠(yuǎn)。在mRNA水平上，NUMB基因肺中表達(dá)量最高，大腸中表達(dá)量最低。

關(guān)鍵詞：民豬；NUMB基因；反轉(zhuǎn)錄PCR；克??；生物信息學(xué)

劉娣,王鑫鑫,別墅,等.民豬NUMB基因克隆與組織表達(dá)分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 47(1): 51-57.

Liu Di, Wang Xinxin, Bie Shu, et al. Cloning and tissue expression analysis of Min pig NUMB gene[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2016, 47(1): 51-57. (in Chinese with English abstract)

細(xì)胞命運(yùn)決定因子NUMB是一種膜相關(guān)蛋白，在進(jìn)化上相對(duì)保守。最先在果蠅神經(jīng)系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)[1]，隨后在多個(gè)哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)該基因存在，并稱為mNUMB基因[2]。該基因一般具有兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)，一個(gè)是磷酸酪氨酸結(jié)構(gòu)（PTB），一個(gè)是羧基端結(jié)構(gòu)（PRR），這兩個(gè)結(jié)構(gòu)可分別與LDAP?NY、α銜接蛋白和E3泛素激酶等多種蛋白相互作用，行使不同生物學(xué)功能[3]。其在細(xì)胞不對(duì)稱分裂、內(nèi)吞、生長(zhǎng)、粘附、遷移等過(guò)程中發(fā)揮作用，并通過(guò)Notch和P53等信號(hào)途徑?jīng)Q定細(xì)胞命運(yùn)[4-6]。mNUMB蛋白在不同組織和細(xì)胞中均有表達(dá)，但其表達(dá)形式存在差異，這種差異不僅體現(xiàn)在表達(dá)水平不同，也體現(xiàn)在不同轉(zhuǎn)錄剪切變異體上。已知在小鼠、人中均發(fā)現(xiàn)4種剪切變異體，經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，不同剪切變異體間差異主要是由PTB和PRR結(jié)構(gòu)域內(nèi)發(fā)生小片段插入或缺失造成[7]，從而導(dǎo)致蛋白結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生變化，進(jìn)而使不同變異體行使不同生物學(xué)功能[8]。有報(bào)道稱，NUMB變異體1是一個(gè)可用于檢測(cè)早期食管癌的生物標(biāo)記基因[9]。Gho等認(rèn)為在果蠅中NUMB不對(duì)稱分布機(jī)制是保證感覺(jué)器官發(fā)育過(guò)程中各級(jí)細(xì)胞正確分裂和分化成熟的決定因素，其功能缺失或過(guò)表達(dá)均使細(xì)胞分裂和子細(xì)胞分化方向發(fā)生轉(zhuǎn)變，最終導(dǎo)致感覺(jué)器官發(fā)育異常[10]。Zilian等發(fā)現(xiàn)NUMB敲除使小鼠后腦神經(jīng)元分化推遲，而在前腦沒(méi)有出現(xiàn)神經(jīng)元早期分化[11]，因此NUMB具有促進(jìn)神經(jīng)元分化作用，NUMB基因缺失導(dǎo)致小鼠胚胎發(fā)生嚴(yán)重血管生成重建和神經(jīng)管閉合障礙，及某些神經(jīng)細(xì)胞系缺失，造成胚胎早期死亡。

本試驗(yàn)前期研究中發(fā)現(xiàn)，民豬肌肉組織在受到冷刺激后，NUMB基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著下降[12]，基于該基因在其他物種中已知的生物學(xué)功能，將其作為一個(gè)研究民豬耐寒特性的候選基因開(kāi)展系列遺傳學(xué)研究，為今后相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與樣品采集

75日齡民豬3頭，取自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所創(chuàng)新示范基地，屠宰后取大腸、背肌、肺、脂肪、心臟、脾、肝臟和腿肌組織塊，放于液氮中于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所綜合實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存。

1.2總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

嚴(yán)格按照TRLzol試劑盒（購(gòu)自Invitrogen）操作手冊(cè)分別提取各組織樣總RNA，用分光光度計(jì)檢測(cè)其260和280 nm處光吸收值，計(jì)算濃度和質(zhì)量，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，-80℃保存?zhèn)溆?。? μg總RNA使用Prime?Script?RT試劑盒合成cDNA第一條鏈。

1.3 NUMB基因克隆測(cè)序

以民豬肝臟cDNA為模板，根據(jù)芯片結(jié)果所提供EST序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中利用BLASTN程序開(kāi)展序列同源性比對(duì)，尋找其他物種已有NUMB基因序列。在保守區(qū)設(shè)計(jì)1對(duì)引物C1和C2（見(jiàn)表1），采用降落PCR方法擴(kuò)增該基因完整CDS區(qū)，PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中10×PCR buffer 2.5 μL，10 mmol·L-1dNTP Mix 2.0 μL，C1（10 pmol·μL-1）1.0 μL，C2（10 pmol·μL1）1.0 μL，rTaq 0.2 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 17.3 μL。反應(yīng)條件為94℃10 min，94℃30 s，64℃30 s，-1℃/cycle，72℃2 min，go to 2，16 cycles，94℃30 s，48℃30 s，72℃2 min，go to 6，15 cycles，72℃10 min。將擴(kuò)增出片段首先與DL2000 Marker比對(duì)，初步判斷其大小，進(jìn)而通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，連接Pmd18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆菌落，搖菌、提取質(zhì)粒后，XhoⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定無(wú)誤后，將質(zhì)粒送交北京華大公司測(cè)序。

表1引物序列信息Table 1 Information of primer sequences

1.4 NUMB基因序列分析

利用DNAStar軟件包中的EditSeq軟件對(duì)所獲NUMB基因核苷酸序列進(jìn)行5'-UTR、完整編碼區(qū)和3'-UTR劃分；利用Protean軟件預(yù)測(cè)NUMB基因氨基酸序列，并模擬其二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)PROSITE（http:// www. expasy. org/ prosite）預(yù)測(cè)民豬NUMB蛋白結(jié)構(gòu)功能域。

1.5構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)

使用BLASTp程序在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索與民豬NUMB基因同源的其他物種NUMB基因氨基酸序列（Blastp, TBlastX, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST），將所獲不同物種的NUMB氨基酸序列使用ClustalX1.83進(jìn)行序列比對(duì)，將比對(duì)結(jié)果導(dǎo)入MEGA6.0軟件，采用Neighbor-Joining算法構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap設(shè)為1 000。

1.6實(shí)時(shí)定量PCR鑒定NUMB基因不同組織轉(zhuǎn)錄水平

針對(duì)NUMB基因設(shè)計(jì)2條引物C3和C4，選擇GAPDH基因作為看家基因，設(shè)計(jì)引物C5和C6（見(jiàn)表1），分別以各組織cDNA為模板PCR擴(kuò)增，25 μL反應(yīng)體系中包含以下成分：SYBR Premix Ex Taq（2×）12.5 μL，C3（10 μmol·L-1）0.5 μL，C4 （10 μmol·L-1）0.5 μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）×3 0.5 μL，cDNA 2.0 μL，ddH2O 9.0 μL。反應(yīng)條件如下：95℃10 s，95℃5 s，60℃20 s，go to 2，40 cycles，最后采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組織間NUMB基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。

2結(jié)果與分析

2.1核酸和氨基酸序列分析結(jié)果

RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)2 004 bp，包括NUMB基因一個(gè)完整的開(kāi)放讀碼框1 782 bp，5'-UTR區(qū)100 bp和3'-UTR區(qū)121 bp（見(jiàn)圖1A），編碼592個(gè)氨基酸（見(jiàn)圖1B），多肽鏈含68個(gè)強(qiáng)堿性氨基酸殘基，60個(gè)強(qiáng)酸性氨基酸殘基，183個(gè)疏水性氨基酸殘基和168個(gè)極性氨基酸殘基，分子質(zhì)量為64.51 ku，等電點(diǎn)為8.56。

圖1民豬NUMB基因核苷酸序列(A)和氨基酸序列(B)Fig. 1 Nucleotide(A) and inferred amino acid(B) sequences of Min pig NUMB gene

2.2 NUMB蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域分析

利用Lasergene的protean軟件分析NUMB蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)（Alpha螺旋、Beta折疊、Turn轉(zhuǎn)角、Coil卷曲）、疏水性和表面抗原分布情況，結(jié)果如圖2所示?？煽闯鲈摰鞍子H水性較強(qiáng)、抗原結(jié)合區(qū)較多，其中二級(jí)結(jié)構(gòu)中螺旋（Helix）、折疊（Strand）、轉(zhuǎn)角（Loop）所占比例依次為：Helix= 6.9%、Strand=9.4%、Loop=83.6%，轉(zhuǎn)角所占比例最大。

利用蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)PROSITE分析民豬NUMB蛋白氨基酸序列結(jié)構(gòu)功能域，發(fā)現(xiàn)該蛋白多肽鏈存在一個(gè)N端磷酸酪氨酸結(jié)構(gòu)域（PTB），位于第37~162氨基酸之間。PTB結(jié)構(gòu)域有1個(gè)pH-like折疊結(jié)構(gòu)，能識(shí)別磷酸化酪氨酸殘基。而與此相對(duì)應(yīng)的SH2結(jié)構(gòu)域，能識(shí)別磷酸和鄰近羧基端殘基，PTB結(jié)構(gòu)域能特異性識(shí)別氨基酸末端并使其磷酸化。

2.3分子進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建結(jié)果

通過(guò)對(duì)32個(gè)不同物種NUMB氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，民豬NUMB基因與其他物種間具有很高同源性，如與牛、山羊、駱駝、兔子、人、鼠同源性分別為96.12%、94.04%、96.46%、85.45%、95.95%、94.10%（見(jiàn)表2）。所構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)如圖3所示。

圖2民豬NUMB蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig. 2 Secondary structure of Min pig NUMB

表2民豬NUMB基因與其他物種NUMB基因氨基酸序列比較結(jié)果Table 2 Nucleotide and amino acid similarities of Min pig NUMB with those of NUMB of other species

續(xù)表

圖3基于NUMB基因氨基酸序列分子進(jìn)化樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree based on the amino acid sequence of NUMB gene

2.4不同組織NUMB mRNA表達(dá)

通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)并分析NUMB mRNA在民豬大腸、背肌、肺、脂肪、心臟、脾、肝臟、腿肌組織中表達(dá)情況。結(jié)果表明，NUMB基因在肺中表達(dá)量最高，大腸中表達(dá)量最低。各組織相對(duì)表達(dá)量值和統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4民豬NUMB基因8個(gè)組織中相對(duì)定量表達(dá)情況Fig. 4 Expression of Min pig NUMB gene in eight tissue

3討　論

NUMB又稱細(xì)胞命運(yùn)決定因子，是與細(xì)胞內(nèi)膜相連的磷酸酪氨酸結(jié)合域（PTB）包含蛋白，是生物體內(nèi)最重要的細(xì)胞命運(yùn)決定因子之一。本試驗(yàn)通過(guò)RT-PCR方法，擴(kuò)增得到全長(zhǎng)2 004 bp產(chǎn)物。試驗(yàn)中采集8個(gè)組織中，在mRNA水平上均有NUMB基因表達(dá)，但相對(duì)表達(dá)量存在差異，肺中表達(dá)量最高，大腸中最低。NUMB基因在各種組織中表達(dá)水平高低與民豬健康狀況、采樣日齡及飼喂條件等諸多外在因素有關(guān)，同時(shí)也與各組織內(nèi)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有關(guān)，因此推測(cè)其各組織表達(dá)在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期內(nèi)是變化的。根據(jù)本試驗(yàn)測(cè)得序列，同時(shí)結(jié)合已有序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)表明，NUMB基因在進(jìn)化上比較保守，豬與牛、駱駝同源性最高，與斑馬魚(yú)同源性最低。同源性分析發(fā)現(xiàn)，各物種間NUMB蛋白保守性高，與魚(yú)和果蠅也有一定相似性，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中也起重要作用。NUMB表達(dá)量降低，一方面可能在寒冷刺激下肝細(xì)胞分化受抑制，另一方面拮抗Notch1通路，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分化，抑制B淋巴細(xì)胞分化，促進(jìn)體液免疫。

目前，NUMB基因抗病研究較深入，動(dòng)物抗寒研究處于初期階段。如王躍等利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)、免疫共沉淀技術(shù)及Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NUMB蛋白上調(diào)α-syn蛋白寡泛素化水平，并參與誘導(dǎo)α-syn包涵體形成，可能有助于尋找阻斷Lewy小體形成的新干預(yù)靶點(diǎn)，為帕金森病早期治療提供新手段[13]。洪健等通過(guò)免疫組化（IHC）方法，結(jié)果均表明NUMB基因可能在肝癌中發(fā)揮抑癌基因作用，其表達(dá)缺失可促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展，導(dǎo)致患者預(yù)后不良[14]。值得注意的是免疫系統(tǒng)與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)密切相關(guān)，NUMB在神經(jīng)發(fā)育中起重要作用，低溫可能阻止細(xì)胞內(nèi)分化而促進(jìn)神經(jīng)方向的分化。

北方民豬抗寒性表現(xiàn)與南方地方豬種具有多種不同生理生化反應(yīng)[15]。民豬作為我國(guó)地方優(yōu)質(zhì)豬種，經(jīng)多年繁衍，適應(yīng)我國(guó)北方地區(qū)寒冷氣候和生活環(huán)境，比外來(lái)豬種抗逆性強(qiáng)。另外，溫度降低可降低組織器官代謝率，對(duì)心、腦、肝臟等主要臟器功能產(chǎn)生明顯保護(hù)作用[16]。因此，民豬抗寒特性相關(guān)基因研究尤為重要。通過(guò)本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，民豬大腸預(yù)冷刺激，NUMB基因在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生顯著下降，推測(cè)NUMB基因在民豬抗寒特性方面具有重要作用。

4結(jié)論

本研究成功克隆民豬NUMB基因完整編碼區(qū)序列，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。研究發(fā)現(xiàn)，民豬大腸、背肌、肺、脂肪、心臟、脾、肝臟、腿肌組織中均有表達(dá)，但存在組織差異，肺中表達(dá)量最高，大腸中表達(dá)量最低。根據(jù)本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，民豬肌肉組織在受到冷刺激后，NUMB基因轉(zhuǎn)錄水平顯著下降，基于該基因在其他物種中已知生物學(xué)功能，驗(yàn)證NUMB基因作為研究民豬抗寒特性候選基因。同時(shí)也為日后深入研究NUMB基因抗寒特性奠定基礎(chǔ)。

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Cloning and tissue expression analysis of Min pig NUMB gene

LIU Di1,2, WANG Xinxin1, BIE Shu1, ZHANG Dongjie2, WANG Liang2, LI Ling1, CAO Yue1(1. School of Animal Sciences and Technology, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. Institute of Animal Husbandry of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086, China)

Abstract:In this study, RT-PCR technology combined with cloning and sequencing methods, cloned the full-length gene sequence NUMB 2 004 bp, including 1 782 bp open reading frame (ORF), which encodes 592 amino acids. Bioinformatics analysis software for prediction and analysis of the amino acid sequence of the gene discovery: NUMB protein secondary structure, a large proportion of the corner, and the proteins more hydrophilic, structural domains of the protein peptides found after analysis there was a chain of N-terminal tyrosine phosphatase domain (PTB), located between the first amino acid 37-162. Constructed based on different species NUMB protein sequence phylogenetic tree showed that kinship pigs with cattle and camels recently, with the zebra fish furthest. At the mRNA level, NUMB had highest gene expression in the lung, lowest expression in colon.

Key words:Min pig; NUMBgene; RT-PCR; cloning; bioinformatics

作者簡(jiǎn)介：劉娣（1963-），女，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖。E-mail：liudi1963@163.com

基金項(xiàng)目：黑龍江省科技廳攻關(guān)項(xiàng)目（GC12B311）；國(guó)家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系崗位科學(xué)家項(xiàng)目（CARS-36）

收稿日期：2015-11-26

中圖分類號(hào)：S858.28；Q785

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1005-9369（2016）01-0051-07