陳慶山，于仁敬，辛大偉，孟　輝，鄒佳男，魏　巍，林美靜，付　營，劉　洋，劉麗敏，劉春燕，蔣洪蔚（.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱　50030；.黑龍江省農(nóng)墾科研育種中心，哈爾濱　50090）

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大豆細(xì)菌性斑點病抗性品種和種質(zhì)資源篩選

陳慶山1，于仁敬1，辛大偉1，孟輝1，鄒佳男1，魏巍1，林美靜1，付營1，劉洋1，劉麗敏1，劉春燕2，蔣洪蔚2
（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱150030；2.黑龍江省農(nóng)墾科研育種中心，哈爾濱150090）

摘要：近年我國東北大豆產(chǎn)區(qū)細(xì)菌性斑點病發(fā)生嚴(yán)重，影響大豆品質(zhì)和產(chǎn)量。采用室內(nèi)高壓噴霧接種法，利用分離的假單胞桿菌Psgneau001菌株接種黑龍江省主栽品種211份和東北大豆核心種質(zhì)192份材料，進(jìn)行抗性鑒定。結(jié)果表明，黑龍江省主栽品種抗性材料占34%，感病材料占51%，中間材料占15%；東北大豆核心種質(zhì)抗性材料占57%，感病材料占26%，中間材料占17%。試驗所獲抗病種質(zhì)資源可為大豆抗病育種提供優(yōu)質(zhì)候選材料。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌性斑點?。淮蠖?；抗性鑒定；種質(zhì)資源

陳慶山,于仁敬,辛大偉,等.大豆細(xì)菌性斑點病抗性品種和種質(zhì)資源篩選[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2016, 47(1): 1-8.

Chen Qingshan, Yu Renjing, Xin Dawei, et al. Identification of soybean cultivars and lines for resistance and germplasm screening to bacterial blight[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2016, 47(1): 1-8. (in Chinese with English abstract)

大豆是一年生草本豆科植物，喜溫、耐陰，是我國重要糧油兼用作物[1]。大豆細(xì)菌性斑點病由丁香假單胞菌大豆致病變種（Pseudomonas syringae pv. glycinea (Psg)引起[2]，是一種大豆常見細(xì)菌性病害。大豆細(xì)菌性斑點病，可侵染大豆葉片、葉柄、莖和豆莢，但主要使葉片受損。早期呈現(xiàn)多邊形透明水漬病斑，后期黃色至淡黃色斑，褐斑在中間，由褪綠斑暈圈環(huán)繞，病葉易脫落。美國因細(xì)菌性病害造成的大豆減產(chǎn)可達(dá)4%~40%[3-4]。我國病害主要分布于東北、黃淮流域各大豆主產(chǎn)區(qū)，北方大豆種植區(qū)域病害重于南方。目前全基因組測序的丁香假單胞菌大豆致病變種有Psg race 4、Psg B076[5]。近年來隨大豆細(xì)菌性斑點病加劇，越來越多的假單胞菌被分離鑒定，其致病機(jī)理研究也在逐步深入。

國外抗病大豆品種有P.I.68708，F(xiàn)lambeau，Norchief，P.I.189968[6]，Avery[7]，耐病品種有Williams79，感病品種有Harosoy、Acme、P. I. 132207、Pershing[2]。國內(nèi)張佳環(huán)等認(rèn)為綏農(nóng)7號、合豐31、黑農(nóng)31、吉農(nóng)1號、吉農(nóng)4號表現(xiàn)為抗病[8]。孫永吉等認(rèn)為吉林2號、吉林7號、延農(nóng)7號、黑農(nóng)9號、黑農(nóng)25、東農(nóng)5號、合豐15、合豐18、鐵豐18、鐵豐20表現(xiàn)為抗病[9]。張淑珍等認(rèn)為吉林2號、吉林7號、吉林35、黑農(nóng)25、鐵豐18、鐵豐20、九豐4號、九豐5號、黑河9號、合豐15、東農(nóng)42表現(xiàn)為抗病[10]。目前研究者鑒定結(jié)果差異較大，大豆品種表現(xiàn)為抗病或感病是病原菌與大豆相互作用的結(jié)果。如果來自于病原物的無毒基因（Avr gene）編碼與大豆特異性相互作用的激發(fā)子，被相應(yīng)R基因產(chǎn)物識別并誘導(dǎo)寄主防衛(wèi)反應(yīng)，使大豆產(chǎn)生對病原物侵染抗性，表現(xiàn)小種與品種特異互作的不親和性（抗?。?。Avr基因失活或缺乏，則表現(xiàn)小種與品種互作親和性（感?。11]。丁香假單胞菌HopZ能抑制擬南芥免疫反應(yīng)，引起植株感病[12]；菜豆中將抗細(xì)菌性斑點病基因定位在Psy1和Psy2上[13]。

目前大豆細(xì)菌性斑點病抗病性評價接種方法主要有高壓噴霧法[8-9]、針刺法[14]、高壓噴霧-涂板調(diào)查法[15]。我國細(xì)菌性斑點病抗性鑒定方法及抗性資源篩選結(jié)果尚無系統(tǒng)報道，抗病資源不足，因此種質(zhì)資源抗細(xì)菌性斑點病研究，對大豆抗病育種具有重要意義。本試驗采用涂板調(diào)查法，鑒定東北地區(qū)403份大豆品種，以期為抗病育種及分子生物學(xué)試驗提供可靠理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株

供試菌株采自佳木斯大豆發(fā)病葉片，經(jīng)分離、純化和柯赫氏法則[16]鑒定菌株為Psgneau001。

1.1.2供試大豆品種

目前國內(nèi)外尚無標(biāo)準(zhǔn)的大豆細(xì)菌性斑點病抗性鑒定的抗感品種對照，因此抗性鑒定選用的對照品種為黑龍江省農(nóng)墾科研育種中心篩選的抗病品種野生豆ZYD00006和感病品種綏農(nóng)14。鑒定的種質(zhì)資源分別為東北大豆核心種質(zhì)192份材料及黑龍江省主栽品種211份材料。

1.2方法

1.2.1接種方法

將病原菌Psgneau001置于KB液體培養(yǎng)基220 r·min-1，28℃培養(yǎng)過夜。3 000 r·min-1室溫離心10 min，去除上清，10 mmol·L-1MgCl2重懸菌體，并檢測OD600吸光值（1 OD約為5×108cfu·mL-1），計算細(xì)菌濃度，將菌液稀釋至1×105cfu·mL-1，加入Silwet L-77至終濃度為0.05%，混勻，準(zhǔn)備高壓噴射侵染。

每個品種設(shè)置5次重復(fù)，播種于育苗缽中，放置光照培養(yǎng)箱內(nèi)，16 h光照，8 h黑暗，24℃培養(yǎng)18 d，至第1片三出復(fù)葉完全展開。同時種植感病對照綏農(nóng)14和抗病對照野生豆ZYD00006。取長勢相近第1片三出復(fù)葉，利用電動高壓噴槍，從葉片背面，避開主葉脈，將菌液噴射入葉片中，以接種處葉片區(qū)域濕潤為標(biāo)準(zhǔn)，呈水漬狀。避免過度接種，損傷葉片。

1.2.2病情統(tǒng)計方法

接種后4 d，用打孔器取等量三片葉碟，300 μL 10 mmol·L-1MgCl2中充分研磨，稀釋適當(dāng)倍數(shù)，涂布于50 μg·mL-1羧芐青霉素KB固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 d后，統(tǒng)計平板細(xì)菌數(shù)量，比較細(xì)菌生長情況。以野生豆ZYD00006和綏農(nóng)14平均菌落個數(shù)為對照，進(jìn)行成對t測驗。

接種后12 d，統(tǒng)計葉片發(fā)病情況。以葉片為單位按0~4級調(diào)查發(fā)病情況：0級-全株無病斑；1 級-接菌植株與正常植株無異，褐色斑點和褪綠面積占葉片總面積10%以下；2級-接菌葉片明顯出現(xiàn)褪綠和褐色斑點，發(fā)病面積占葉片總面積10%~25%；3級-病斑面積占葉片總面積25%~ 60%；4級-病斑面積占葉片總面積60%~80%，葉片枯黃脫落。結(jié)合菌落個數(shù)和接種12 d后葉片發(fā)病情況，判斷大豆品種抗感情況。

1.2.3數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1高壓噴霧-涂板調(diào)查法與葉片發(fā)病情況比較分析

利用高壓噴霧法接種不同大豆品種，4 d后涂板調(diào)查，統(tǒng)計平均菌落個數(shù)，12 d后觀察葉片發(fā)病情況。

圖1為抗病品種抗線4號、感病品種綏農(nóng)32、中間材料吉農(nóng)22、綏農(nóng)14以及ZYD00006平板菌落個數(shù)對比，綏農(nóng)32菌落數(shù)明顯多于感病對照綏農(nóng)14、抗病對照ZYD00006、抗病品種抗線4號以及中間材料吉農(nóng)22。圖2為接種12 d后葉片發(fā)病情況對比，12 d后綏農(nóng)32葉片發(fā)病明顯重于其他4份材料，抗病品種抗線4號和ZYD00006三出復(fù)葉無明顯病斑，平均菌落個數(shù)與大豆葉片發(fā)病情況緊密相關(guān)。

2.2黑龍江省主栽品種抗性篩選

黑龍江省主栽品種抗病材料共72份見表1，主要有黑河15、合豐50、嫩豐15、東農(nóng)48、綏農(nóng)8號、東農(nóng)42、抗線4號、綏農(nóng)2號、東農(nóng)45、吉育97等。中間材料共31份，主要有吉農(nóng)22、黑農(nóng)52、墾農(nóng)2號、黑河23和32等。感病材料共有108份，主要有綏農(nóng)30、北豆16、合豐54、合豐40、綏農(nóng)32、綏農(nóng)28、墾農(nóng)28、北豆3號、墾豆28、綏農(nóng)22等。

圖1不同品種接菌4 d后取樣涂板菌落個數(shù)對比Fig. 1 Comparison of colony number on plate culture among different varieties after inoculated 4 d

圖2接種Psgneau001 0和12 d葉片發(fā)病情況Fig. 2 Leaf symptom after inoculated Psgneau001 0 and 12 d

表1黑龍江省大豆主栽品種抗性材料Table 1 Resistant materials of Heilongjiang Province soybean main varieties

抗感品種間菌落個數(shù)差異較大，圖3為不同品種平均菌落數(shù)散點圖，平均菌落數(shù)最大值為4 000個，最小值為1個，菌落數(shù)主要分布在0~1 000個區(qū)間內(nèi)。

圖4為黑龍江省主栽品種抗感比例，抗性材料占34%，感病材料占51%，中間材料占15%。

圖3黑龍江省大豆主栽品種平均菌落數(shù)散點圖Fig. 3 Scatter diagram with colonies number of Heilongjiang Province soybean main varieties

圖4黑龍江省大豆主栽品種抗性比例Fig. 4 Resistant ratio of Heilongjiang Province soybean main varieties to soybean bacterial spot disease

2.2東北大豆核心種質(zhì)抗性篩選

東北大豆核心種質(zhì)抗病材料共110份見表2，主要有黑河27、黑河19、綏農(nóng)1號、大粒黑豆、黑交01-1778、Hodgson、抗線2號、黃寶珠、嘟嚕豆、L68-560。中間材料共33份，主要有黑河13、黑河29、北豐9號、黑河11和六十天還倉等。感病材料共49份，主要有黑農(nóng)37、石大1號、薄地高、吉育93、吉育57、T295H、L65-237、L61-1069、L67-225、Nattosan等?？垢衅贩N間菌落個數(shù)差異較大，圖5為不同品種平均菌落數(shù)散點圖，平均菌落數(shù)最大值為4 189個，最小值為1個，菌落數(shù)主要分布在0~1 000個區(qū)間內(nèi)。東北大豆核心種質(zhì)抗感比例見圖6，抗性材料占57%，感病材料占26%，中間材料占17%。

表2東北大豆核心種質(zhì)抗性材料Table 2 Resistant variety of Northeast soybean core collection

圖5東北大豆核心種質(zhì)平均菌落數(shù)散點圖Fig. 5 Scatter diagram with colonies number of Northeast soybean core collection

圖6東北大豆核心種質(zhì)抗性比例Fig. 6 Resistant ratio of Northeast soybean core collection to soybean bacterial spot disease

3討論與結(jié)論

目前細(xì)菌性斑點病抗性鑒定方法主要有高壓噴霧法[8-9]、針刺法[14]、高壓噴霧-涂板調(diào)查法[15]。針刺法和室內(nèi)高壓噴霧法是相對簡單快速的室內(nèi)鑒定幼苗接菌方法，但無法量化確定大豆品種是否抗病，僅以視覺分類標(biāo)準(zhǔn)判斷。室外高壓噴霧法是在病害流行年份，大面積初篩的簡單便捷方法，可作為室內(nèi)精確鑒定的初期準(zhǔn)備，但無法準(zhǔn)確判斷抗感品種，因田間環(huán)境條件變化較大，氣象溫度等均不穩(wěn)定，可能因年份、生態(tài)地區(qū)不同存在較大差異。高壓噴霧-涂板調(diào)查法可通過接菌4 d后單位面積內(nèi)病原菌數(shù)目，再結(jié)合12 d后葉片發(fā)病情況判斷大豆品種抗感情況，相對于其他方法更準(zhǔn)確、可靠。

不同品種資源對接種假單胞菌后的反應(yīng)表型區(qū)別明顯，一方面可能是假單胞菌遺傳背景影響宿主專一性，如III型效應(yīng)因子等信號分子；另一方面可能是不同大豆品種間遺傳背景不同，對假單胞菌選擇性不同，如存在不同識別基因和抗性基因等。

通過黑龍江省主栽品種和東北大豆核心種質(zhì)抗性鑒定發(fā)現(xiàn)，我國東北地區(qū)存在豐富抗性資源。東北大豆核心種質(zhì)內(nèi)抗性材料比例高于黑龍江省主栽品種，感病資源比例明顯少于黑龍江省主栽品種，可能由于東北大豆核心種質(zhì)具有廣泛遺傳基礎(chǔ)，包含一些野生資源和國外資源。大豆核心種質(zhì)是以最小樣本代表資源的最大遺傳多樣性，為種質(zhì)資源研究利用提供便利，因此評價核心種質(zhì)在各類性狀上的遺傳多樣性對明確其遺傳變異代表性和應(yīng)用潛力具有重要意義。東北大豆核心種質(zhì)中綏農(nóng)14、綏農(nóng)10、吉林30、北豐11、黑河18等常用作親本材料，其中綏農(nóng)14為感病材料，綏農(nóng)10、北豐11為中間材料，吉林30、黑河18為抗病材料。利用抗性品種不斷回交，改良現(xiàn)有農(nóng)藝性狀優(yōu)良的感病品種，根據(jù)與目標(biāo)性狀緊密連鎖的DNA分子標(biāo)記對目標(biāo)性狀間接選擇，在早期世代即能對目標(biāo)基因轉(zhuǎn)移準(zhǔn)確、穩(wěn)定選擇，克服隱性基因再利用時識別困難，提高育種效率，獲得農(nóng)藝性狀優(yōu)良的抗病品種[17]。

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Identification of soybean cultivars and lines for resistance and germplasm screening to bacterial blight

CHEN Qingshan1, YU Renjing1, XIN Dawei1, MENG Hui1, ZOU Jianan1, WEI Wei1, LIN Meijing1, FU Ying1, LIU Yang1, LIU Limin1, LIU Chunyan2, JIANG Hongwei2(1. School of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. Land Reclamation Research and Breeding Centre of Heilongjiang, Harbin 150090, China)

Abstract:In recent years, the Pseudomonas syringae pv. glycinea induced disease of soybean had serious damage effect on the soybean quality and yield. High pressure spraying method was used to inject the soybean with Psgneau001, Pseudomonas syringaepv. glycinea, isolated by our lab, then 211 cultivars of Heilongjiang Province and 192 Northeast soybean core gemplasm were identified. The resistance phenotype showed that 34% resistance, 51% sensitivity, and 15% intermediate in 211 cultivars. The resistant phenotype in Northeast soybean germplasm was 57% resistance, 26% sensitivity, and 17% intermediate. The identified germplasm materials supply a valuable foundation for disease resistant breeding.

Key words:Pseudomonassyringaepv. glycinea; soybean; resistance identification; germplasm

作者簡介：陳慶山（1973-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為大豆生物技術(shù)。E-mail: qshchen@126.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(31271747, 31471516)

收稿日期：2015-07-22

中圖分類號：S565.1；S435.651

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1005-9369（2016）01-0001-08