張博，向文勝（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱　150030）

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Cis-AT和Trans-AT聚酮合酶及其特殊功能域研究進(jìn)展

張博，向文勝
（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030）

摘要：聚酮合酶（Polyketide synthase, PKS）是產(chǎn)生聚酮化合物的模塊化復(fù)合酶，聚酮合酶能產(chǎn)生數(shù)量眾多并具有生物活性的聚酮類天然產(chǎn)物。近年來一類與cis-AT聚酮合酶存在較大差異的trans-AT聚酮合酶被廣泛研究。文章介紹cis-AT聚酮合酶與trans-AT聚酮合酶區(qū)別及trans-AT聚酮合酶基因簇中特殊功能域研究進(jìn)展，展望利用功能域改造基因簇研究方向，以期為天然產(chǎn)物改造提供新靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：trans-AT聚酮合酶；特殊功能域；結(jié)構(gòu)改造

張博,向文勝. Cis-AT和Trans-AT聚酮合酶及其特殊功能域研究進(jìn)展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2016, 47(1): 87-92.

Zhang Bo, Xiang Wensheng. Advances in Cis-AT and Trans-AT polyketide synthases and their special domains[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2016, 47(1): 87-92. (in Chinese with English abstract)

聚酮合酶（Polyketide synthases，PKS）是由具有多種功能的小蛋白功能域組合而成的巨大蛋白復(fù)合體。PKS能產(chǎn)生數(shù)量眾多且具有生物活性的聚酮類天然產(chǎn)物，如臨床應(yīng)用的抗生素紅霉素（Erythromycin）和抗寄生蟲藥物阿維霉素（Aver?mectin），以及抗癌藥物埃博霉素（Epothilone）和變構(gòu)霉素（Tautomycetin）等。聚酮化合物具有高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和較強(qiáng)藥理學(xué)活性，雖然由醋酸鹽和丙酸鹽組成，但其結(jié)構(gòu)多樣性和復(fù)雜性使傳統(tǒng)化學(xué)合成方式難以獲得聚酮化合物。隨著分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，研究者對聚酮化合物生物合成及其機(jī)理了解更加深入，關(guān)注聚酮化合物中特殊功能團(tuán)相關(guān)功能域研究與發(fā)掘，以期通過功能域改造和重組產(chǎn)生具有新功能團(tuán)甚至新功能的化合物[1]。本文比較Ⅰ型聚酮合酶中cis-AT型（整合AT型）聚酮化合物生物合成基因簇和trans-AT型（游離AT型）聚酮化合物生物合成基因簇，介紹Ⅰ型聚酮合酶中包含的特殊功能域和近期合成生物學(xué)研究進(jìn)展，為聚酮類化合物結(jié)構(gòu)改造和發(fā)掘提供理論基礎(chǔ)。

1 cis-AT和trans-AT型聚酮合酶簡介

Ⅰ型聚酮合酶主要是催化二碳單元線性延伸和可選擇性催化酮基基團(tuán)的還原反應(yīng)，這種類似于初級代謝中脂肪酸合成的催化反應(yīng)產(chǎn)生數(shù)量繁多、結(jié)構(gòu)多樣的天然產(chǎn)物。聚酮化合物形成過程始于酰基轉(zhuǎn)移酶（Acyltransferase, AT）特異性活化簡單前體，如丙二酰（Malonyl）輔酶A、甲基丙二酰（Methlymalonyl）輔酶A或其他起始單元[2]，將其裝載到?；d體蛋白（Acyl carrier protein, ACP），完成起始模塊（Loading module）。在?；D(zhuǎn)移酶活化一個?；鶈卧?，酮基合成酶（Ketosynthase，KS）則催化克萊森縮合反應(yīng)（Claisen condensation），將之前模塊上的?；鶈卧徒?jīng)過脫羧反應(yīng)后用于延伸的二碳單元融合，并將上一模塊中?；d體蛋白上的中間體轉(zhuǎn)移到所在模塊中的?；d體蛋白，實(shí)現(xiàn)二碳單元線性延伸。此外，二碳單元延伸過程中，每一個模塊還會存在一些酮基還原酶（Ketoreductase, KR）、脫水酶（Dehydratase, DH）、烯醇還原酶（Enoylreductase, ER）功能域催化β位酮基還原反應(yīng)，導(dǎo)致聚酮化合物在不同位置上酮基還原程度有所不同，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多樣性。當(dāng)聚酮鏈延伸到特定程度，通常會在硫酯酶（Thioester?ase, TE）功能域作用下將硫脂鍵切割終止聚酮鏈延伸。對經(jīng)典Ⅰ型聚酮合酶而言，除起始模塊之外，KS-AT-ACP等3個功能域是構(gòu)成聚酮合酶最小組成單位（見圖1）。

對經(jīng)典Ⅰ型聚酮合酶的認(rèn)知主要從放線菌中紅霉素生物合成聚酮合酶基因簇中歸納[3]。研究者將重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到非常規(guī)細(xì)菌和未認(rèn)知基因簇上，發(fā)現(xiàn)一系列聚酮基因簇和與之相對應(yīng)的化合物。這些特殊的聚酮基因簇中，每個模塊均缺少酰基轉(zhuǎn)移酶功能域，而底物?；瘎t由1個游離在聚酮合酶之外的?；D(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)[4-7]；因此每一步克萊森縮合反應(yīng)中裝載的大多數(shù)均是相同的丙二酰單元（見圖1）。為區(qū)別這兩種不同類型的Ⅰ型聚酮合酶，使用trans- AT PKS和cis-AT PKS分別命名含有游離酰基轉(zhuǎn)移酶的聚酮合酶和含有整合?；D(zhuǎn)移酶功能域的聚酮合酶。此外，trans-AT PKS也被稱作AT-less PKS[8]，表明整個聚酮合酶上的?；D(zhuǎn)移酶缺失，但經(jīng)典的Ⅰ型聚酮合酶則沒有名稱對應(yīng)。

圖1 cis-AT聚酮合酶和trans-AT聚酮合酶結(jié)構(gòu)模型及生物合成過程Fig. 1 Biosynthesis of a functional complex polyketide under the action of a cis-AT(textbook) PKS and a trans-AT

首例trans-AT聚酮合酶基因簇是1993年從測序枯草芽孢桿菌168基因組中預(yù)測出的bacillaene聚酮合酶基因簇，該菌株并不產(chǎn)生任何聚酮化合物，由于測序技術(shù)不成熟導(dǎo)致其序列中存在錯誤，故無法確認(rèn)bacillaene聚酮合酶基因簇是功能基因簇抑或是進(jìn)化生成的殘缺基因簇[9]。1999年和2001年，myxovirescins和albicidin生物合成基因簇中單一模塊被分別鑒定，展現(xiàn)出與bacillaene聚酮合酶相同的結(jié)構(gòu)特征，即均缺失酰基轉(zhuǎn)移酶功能域[10-11]。事實(shí)上，2002年發(fā)現(xiàn)的pederin聚酮合酶基因簇是第一個被人們認(rèn)知的trans-AT聚酮合酶基因簇，首次通過體內(nèi)試驗證明trans-AT聚酮合酶存在，提出游離?；D(zhuǎn)移酶為整個聚酮合酶系統(tǒng)提供?；孜锛僭O(shè)[12]。2003年，發(fā)現(xiàn)另外一個trans-AT型聚酮合酶基因簇，即leinamycin生物合成基因簇，通過體外試驗驗證游離?；D(zhuǎn)移酶能提供?；孜颷8]。隨后，trans-AT型聚酮合酶基因簇引起關(guān)注，相繼發(fā)現(xiàn)一系列trans-AT基因簇，如oxazolomycin[13]、virginiamycin M[14]、lankaci?dins[15]、Kirromycin[16]等。

2 cis-AT和trans-AT型聚酮合酶區(qū)別及特殊功能域

結(jié)構(gòu)上，cis-AT和trans-AT型聚酮合酶唯一區(qū)別是?；D(zhuǎn)移酶功能域以整合或游離形式存在。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，兩種聚酮合酶系統(tǒng)是從簡單脂肪酸生物合成途徑按照不同方式獨(dú)立進(jìn)化的結(jié)果[17]；cis-AT主要通過獨(dú)立模塊復(fù)制和功能域分化進(jìn)化形成[18]，而trans-AT則多通過不同細(xì)菌中水平基因轉(zhuǎn)移而進(jìn)化形成[19]。由于進(jìn)化途徑不同，大多數(shù)trans-AT型聚酮合酶具有一定特性。主要體現(xiàn)在cis-AT型聚酮合酶大多只存在8種功能域組合方式，而在trans-AT型聚酮合酶中則存在超過50余種排列多樣和功能特異的功能域模塊，大多不遵循經(jīng)典聚酮合酶生物合成線性規(guī)律。

2.1甲基基團(tuán)添加

大部分cis-AT型聚酮合酶從放線菌中被分離鑒定，由于放線菌能夠代謝產(chǎn)生各種類型底物，使大多數(shù)cis-AT型聚酮合酶可利用內(nèi)部整合的酰基轉(zhuǎn)移酶功能域識別特殊底物（例如甲基丙二酰輔酶A）引入α位置上的甲基、乙基等支鏈[20]。而trans-AT型聚酮合酶主要從一些非放線菌中分離，由于進(jìn)化方式不同，游離在聚酮合酶之外的?；D(zhuǎn)移酶不能直接酰基化含有甲基或乙基支鏈的丙二酰輔酶A，而只能通過一個S-腺苷甲硫氨酸（SAM）依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶引入α位置上的甲基。因此，幾乎所有含有甲基側(cè)鏈的trans- AT型聚酮合酶基因簇中均包含一個甲基轉(zhuǎn)移酶功能域（MT）用于引入與之相對應(yīng)的甲基基團(tuán)。

2.2游離AT特殊結(jié)構(gòu)

trans-AT聚酮合酶生物基因簇中酰基轉(zhuǎn)移酶在整個聚酮合酶外均以游離形式游離存在，單一?；D(zhuǎn)移酶能重復(fù)作用?；械孜?。除oxa?zolomycin[13]和kirromycin[16]等特例外，所有trans-AT聚酮合酶均利用丙二酰輔酶A為底物進(jìn)行二碳單元延伸。因此，在trans-AT型聚酮合酶基因簇中含有一個或多個拷貝的AT基因，這些AT基因可融合以二聚體形式存在。此外，某些AT基因可融合一個氧化還原酶功能域?qū)μ囟ㄎ恢眠M(jìn)行烯醇還原反應(yīng)，將雙鍵還原為單鍵，這一氧化還原功能域以游離ER基因形式存在[21]。但這一還原酶特異性識別某些特定位置進(jìn)行還原反應(yīng)的原因尚不明確。

2.3 β-branch形成

trans-AT除能夠通過甲基轉(zhuǎn)移酶功能域催化聚酮化合物α位上發(fā)生取代反應(yīng)而產(chǎn)生碳支鏈外，也存在β位酮基基團(tuán)被轉(zhuǎn)換成碳支鏈的現(xiàn)象，這兩個不同位置的取代反應(yīng)需要兩種完全不同的機(jī)制。通過大量含有β-branch的聚酮化合物研究發(fā)現(xiàn)，β-branch由一組酶催化的與甲羥戊酸生物合成途徑相似的β-酮基與丙二酰單元發(fā)生羧基縮合反應(yīng)形成。這種有脫羧功能的酮基合成酶（KSQ）、羥甲基戊二酰輔酶A合成酶（HCS）、烯酰輔酶A脫水酶（ECH）和?；d體蛋白（ACP）組成的負(fù)責(zé)β-branch形成的一組酶稱作HCS卡殼（Hydroxy?methyleglutaryl-CoA synthase cassette）。通過?；D(zhuǎn)移酶識別丙二酰輔酶A并將其裝載到游離?；d體蛋白上，通過KSQ催化一步脫羧反應(yīng)，進(jìn)行HCS催化縮合反應(yīng)并在ECH作用下脫去一分子水，最終形成β位側(cè)鏈。Haines等研究發(fā)現(xiàn)，ACP上的1個相對保守序列是β-branch形成的識別位點(diǎn)，ACP第3個螺旋結(jié)構(gòu)對ACP和HCS形成起決定作用[22]。因此，通過ACP結(jié)構(gòu)改造可在特定位置上添加β支鏈（見圖2A）。

除通過HCS卡殼形成β-branch外，近年還在rhizoxin和iso-migrastatin生物合成途徑中鑒定出一種全新的、與HCS不同的β-branch形成方式[23]，最終形成δ-內(nèi)酯和戊二酰亞胺類官能團(tuán)。Hert?Weck等通過體內(nèi)突變試驗和分離鑒定生物合成途徑利用中間體方法提出假設(shè)，即δ-內(nèi)酯通過一個邁克爾加成反應(yīng)將丙二酰單元與α,β不飽和硫脂結(jié)合形成。對預(yù)測的與β-branch形成相關(guān)的β-branching module（KS-B-ACP）作體內(nèi)試驗并在體外成功模擬側(cè)鏈形成反應(yīng)，最終確定側(cè)鏈C-C鍵形成是通過一個共軛加成反應(yīng)及δ-羥基攻擊KS上的硫脂最終形成δ-內(nèi)酯結(jié)構(gòu)[24]。通過該蛋白晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，C-C鍵形成和內(nèi)酯化主要通過KS催化，然而首次發(fā)現(xiàn)的支鏈功能域（B domain）并未直接參與支鏈形成，所以B domain起輔助作用，引導(dǎo)KS完成β位側(cè)鏈形成而非常規(guī)二碳單元延伸（見圖2B）。Hertwech等通過體外試驗證明戊二酰亞胺類官能團(tuán)產(chǎn)生機(jī)理與之相同[25]。

a-類似萜類化合物的β支鏈形成過程；b-乙烯β支鏈形成過程；KSQ-非延伸型脫羧酶；HCS-羥甲基戊二酰輔酶；A-合成酶；ECH-脫氫/脫羧酶；B-支鏈功能域a-Terpenoid-like b-branching; b-Vinylogous chain branching；KSQ-Non-elongating, decarboxylating ketosynthase; HCS-Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase; ECH-Dehydratase/decarboxylase; B-Branching domain圖2聚酮化合物β支鏈形成機(jī)制Fig. 2 Mechanisms of polyketide chain branching

2.4特殊功能的功能域

除上文描述的特殊功能域外，trans-AT型聚酮合酶基因簇中還存在多種結(jié)構(gòu)特殊、功能新穎的功能域。例如Leinamycin生物合成聚酮合酶LnmJ包含兩個與其他已知聚酮合酶功能域不同的特殊功能域，這兩個功能域位于TE domain之前，推測其可能與Leinamycin上活性官能團(tuán)的二硫鍵形成有關(guān)，但目前關(guān)于其功能的研究尚無報道[26]。此外，在Pederin、Onnamides和Bryostatins的trans-AT聚酮合酶基因簇中均包含不常見的PS功能域（Pyran synthase domain），此功能域最初被認(rèn)為與脫水酶具有同源性，在該功能域所處的module上已存在1 個DH domain，因此被注釋為PS domain，與常規(guī)DH domain加以區(qū)分。預(yù)測這個功能域可催化與常規(guī)DH domain完全相反的反應(yīng)，即催化一分子乙醇與一分子不飽和硫脂之間的加成反應(yīng)形成罕見的四氫呋喃環(huán)[12]。在含有類似呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的on?namides和bryostatins的生物合成基因簇中也發(fā)現(xiàn)相似的PS domain，可側(cè)面證明PS domain功能。bryo? statins聚酮合酶基因簇上還存在兩個不常見的OMT domain（O-methyltransferase domain）即氧甲基轉(zhuǎn)移酶功能域，根據(jù)整個聚酮合酶基因簇和bryo?statins之間關(guān)系，推測OMT domain功能是在β-branch上面形成甲基酯[27]。同時在oxazolomycin 和thailandamides聚酮合酶基因簇中也發(fā)現(xiàn)與該OMT domain同源的domain，然而這三個結(jié)構(gòu)相似的OMT domain在各自生物合成途徑中卻起到完全不同的功能，oxazolomycin中的OMT domain向α位的甲基中引入一分子氧而形成氧甲基[13]，thailand?amides中的OMT domain則是在β位上的酮基上引入一分子甲基形成β位烯醇甲酯，再經(jīng)額外的一步還原反應(yīng)最終形成β位氧甲基基團(tuán)[19]。2014年，在Burkholderia sp. FERM BP-3421基因組中發(fā)現(xiàn)1個與spliceostatins生物合成相關(guān)的基因簇，通過該基因簇注釋，發(fā)現(xiàn)為1個trans-AT型聚酮合酶基因簇，該基因簇中除含有兩個PS domain、4個非延伸功能的KS0、兩個與β-branch相關(guān)的ECH domain和大量2個或者3個迭代的ACP外，基因簇內(nèi)部還存在1個與三元氧環(huán)形成相關(guān)的FMO domain（Fla?vin-dependent monooxygenase），即黃素依賴性單加氧酶功能域。隨后通過體內(nèi)敲除試驗確定FMO do?main功能并將其與化合物結(jié)構(gòu)上的三元氧環(huán)形成關(guān)聯(lián)[6]。除不常見的domain外，在trans-AT聚酮合酶基因簇中，如bacillaene生物合成基因簇中第三個module中的KR domain除能夠催化常規(guī)β位酮基還原反應(yīng)外，還催化α位上的酮基還原反應(yīng)[28]。證明在trans-AT聚酮合酶基因簇中，普通domain也可重復(fù)作用或作用在遠(yuǎn)端位置。

3聚酮化合物篩選和結(jié)構(gòu)改造的展望

傳統(tǒng)化合物分離主要通過環(huán)境微生物分離純化后，經(jīng)多種培養(yǎng)基發(fā)酵和發(fā)酵液富集，采用隨機(jī)分離和活性介導(dǎo)方式分離并對化合物作結(jié)構(gòu)鑒定。這兩種方法在分離前，無法對所分離化合物作精準(zhǔn)預(yù)測，易導(dǎo)致化合物重復(fù)分離，同時微生物中的基因簇可能在某一特定培養(yǎng)基中處于沉默或表達(dá)較低水平，因此隨機(jī)嘗試培養(yǎng)基無法全面了解微生物次級代謝產(chǎn)生能力。隨基因組測序技術(shù)發(fā)展，從基因組水平入手，以已知生物合成途徑為基礎(chǔ)對基因組中各個基因簇預(yù)測并通過不同分子生物學(xué)手段將目的基因簇異源表達(dá)，例如全長RecE介導(dǎo)的linear-linear同源重組系統(tǒng)[29]和同源重組效率較高的酵母TAR-cloning的利用[30]。針對性分離所需化合物，選取的異源表達(dá)宿主可降低發(fā)酵液復(fù)雜程度，便于化合物檢測和分離。

以上特殊功能域研究，可更清晰認(rèn)識聚酮化合物生物合成，結(jié)合已發(fā)表基因組序列，可從繁雜基因組數(shù)據(jù)中找到所需含有特殊功能域基因簇。在此基礎(chǔ)上對多種基因簇修飾和改造，甚至打散重新組合達(dá)到自然進(jìn)化目的，產(chǎn)生全新結(jié)構(gòu)小分子藥物。優(yōu)化利用主要包括：①通過Ⅰ型聚酮合酶結(jié)構(gòu)研究，已確定除MT外所有功能域活性位點(diǎn)[31]，對活性功能域以突變失活方式改造基因簇，對碳鏈飽和程度人為修改產(chǎn)生非天然化合物。例如，通過對KR和DH功能域點(diǎn)突變失活后，分離得到非天然Candicidin類似物[32]；②通過對AT功能域改造使聚酮合酶可識別不同前體從而改造化合物結(jié)構(gòu)。例如，通過對erythromycin生物合成基因簇上的第6個AT功能域改造后，使聚酮合酶識別含有一個炔鍵側(cè)鏈的丙二酸鹽，并將其整合到erythromycin生物合成途徑中，最終在紅霉素結(jié)構(gòu)中引入含炔鍵側(cè)鏈[33]。在此基礎(chǔ)上，通過體內(nèi)突變試驗將聚酮合酶上的AT功能域突變失活后，引入1個trans-AT并將氟乙酸鹽衍生的氟丙二酰輔酶A整合到聚酮化合物的生物合成過程中，產(chǎn)生全新含氟短鏈聚酮化合物[34]。在藥物化學(xué)研究中，氟原子具有較強(qiáng)生物活性，可在所需位置引入氟原子。2014年，Ye等研究trans-AT聚酮合酶中具有非甲基丙二?；钚缘孽；D(zhuǎn)移酶KirCII和?；d體蛋白蛋白結(jié)構(gòu)并確定了內(nèi)部關(guān)鍵位點(diǎn)[35]

近年來，trans-AT型聚酮合酶作為結(jié)構(gòu)復(fù)雜且具有活性天然產(chǎn)物的重要來源被日益關(guān)注。由于trans-AT型聚酮合酶具有全新、多樣性的催化方式，主要存在于特殊微生物中，與cis-AT聚酮合酶相比，trans-AT聚酮合酶研究仍處于起步階段，其蛋白結(jié)構(gòu)研究可解釋各種酶或功能域的特殊功能，為改造和創(chuàng)造新的生物合成基因簇提供理論基礎(chǔ)。

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Advances in Cis-AT and Trans-AT polyketide synthases and their special domains

ZHANG Bo, XIANG Wensheng(School of Life Sciences, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Abstract:Due to the diversity and specificity of polyketide synthase (PKS), the polyketide natural products generated by PKSs were structurally and bioactively diversified. Recently, the trans-AT polyketide synthase was discovered, characterized and investigated as the subfamily of TypIe I PKSs. In this review, the difference between cis-AT PKS and trans-AT PKS as well as the research advance of special domains in trans-AT PKS were summarized and discussed. In addition, the methods could be use to modify the gene clusters to generate the novel structure compounds were also analyzed and providing the new target for natural product modification.

Key words:trans-AT polyketide synthase; special domains; structural improvement

*通訊作者：向文勝，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為微生物農(nóng)藥。E-mail：xiangwensheng@neau.edu.cn

作者簡介：張博（1986-），男，博士研究生，研究方向為微生物天然產(chǎn)物生物合成。E-mail：bozhang95@yahoo.com

收稿日期：2015-07-29

中圖分類號：Q78

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1005-9369（2016）01-0087-06