陳麗如，張立平，劉 源，聶 瑋，馬麗娜·阿新拜

1 北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2 北京中醫(yī)藥大學國際交流與合作處

柴芪湯對非酒精性脂肪肝大鼠固醇調節(jié)元件結合蛋白-1c表達的影響*

陳麗如1，張立平2△，劉 源1，聶 瑋1，馬麗娜·阿新拜1

1 北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2 北京中醫(yī)藥大學國際交流與合作處

目的：觀察柴芪湯對非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝臟固醇調節(jié)元件結合蛋白-1c(SREBP-1c)mRNA及蛋白表達的影響，探討其防治NAFLD的可能機制。方法：將32只SPF級雄性SD大鼠隨機分為正常組、模型組、柴芪湯組和羅格列酮組，每組8只，采用高脂高糖高鹽飲食喂養(yǎng)8周復制NAFLD模型，造模第一天開始用藥，給予柴芪湯［5.67g/(kg·d)］及羅格列酮混懸液［3 mg/(kg·d)］灌胃干預，8周后檢測大鼠血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)及肝組織中TG含量；觀察肝組織病理形態(tài)改變；Western Blot測定肝SREBP-1c蛋白表達；RT-PCR測定肝SREBP-1c mRNA表達。結果：模型組大鼠血清ALT、AST、TC、TG、HDL-C、LDL-C水平及肝組織中TG含量明顯高于正常組(P＜0.05)，2用藥組各項指標低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；但2組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。2用藥組SREBP-1c mRNA及蛋白表達水平較模型組降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但2用藥組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結論：柴芪湯能夠改善NAFLD大鼠肝臟脂肪變，其干預效果與西藥羅格列酮相似，抑制SREBP-1c mRNA和蛋白表達，從而降低NAFLD大鼠血清ALT、AST、TG、TC、HLD-C、LDL-C，這可能是柴芪湯治療NAFLD的機制之一。

非酒精性脂肪肝；柴芪湯；羅格列酮；固醇調節(jié)元件結合蛋白-1c

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，按病理學分類可分為單純性非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎和非酒精性脂肪性肝硬化［1-2］。其常與肥胖、2型糖尿病、血脂紊亂同時存在，被視為代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)［3］。近年來隨著生活水平的提高和飲食結構的改變，NAFLD已經成為現(xiàn)代社會最常見的肝病之一［4］。相關研究發(fā)現(xiàn)［5］，固醇調節(jié)元件結合蛋白-1c(SREBP-1c)是調控肝臟脂質代謝的重要核轉錄因子，同時在脂肪酸代謝中起關鍵調控作用。根據其臨床癥狀及體征，NAFLD應當屬中醫(yī)“肥胖”“脅痛”“積聚”“痰飲”等范疇，病因多為過食肥甘厚味，過逸少勞，情志失調等，發(fā)病機制主要為肝失疏泄，脾失健運，痰濁瘀血阻滯。肝郁脾虛是該病主要病理基礎，本研究以高脂、高糖、高鹽飲食建立大鼠NAFLD模型，觀察具有疏肝健脾之效的柴芪湯對NAFLD大鼠肝臟SREBP-1c mRNA及蛋白表達，探討柴芪湯對防治NAFLD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼料 SPF級SD雄性大鼠6～8周齡，體質量(200±20)g，共32只購于北京維通利華實驗動物技術有限公司［動物實驗合格證號：SCXK(京2012-0001)］。高鹽高脂高糖飼料(52.5%基礎飼料，10%熟豬油，10%蛋黃粉，2%膽固醇，10%奶粉，10%果糖，5%食用鹽，0.5%膽鹽)由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。

1.2 藥品、主要試劑及儀器 柴芪湯(柴胡10 g，黃芪30 g，白術10 g，枳實10 g，三七粉3 g)由北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院中藥房代煎制備。羅格列酮(葛蘭素史克公司生產，規(guī)格4 mg/片，批號：H20020475)。谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測試盒均購中生北控生物科技股份有限公司，肝臟組織甘油三酯測試盒均購自南京建成生物工程研究所，兔抗大鼠SREBP-1c多克隆抗體(Abcam，ab28481)，鼠單抗β-actin(中杉金橋，TA-09)，Trizol及引物均由Invitrogen公司提供，Taq酶(RR82LR)、SYBR R Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒及DNA Marker(3427Q)均購于大連寶生物工程有限公司。全自動生化檢測儀(日立7160)，灰度分析軟件：tanon公司(Gel Image System Ver 4.0)，分光光度計(Therno scientific，NANODROP 2000)，ABI7500熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及給藥 將32只大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，按隨機數字表法隨機分為4組：正常組、模型組、柴芪湯組與羅格列酮組，每組8只。除正常組給予普通飼料外，其余3組均給予高鹽高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周。自造模第1天開始持續(xù)灌胃8周，柴芪湯組給予柴芪湯5.67 g/(kg·d)(按“人和動物體表面積折算的等效劑量比值表”計算)，羅格列酮組予羅格列酮混懸液3 mg/(kg·d)，正常組及模型組給予10 mL/(kg·d)蒸餾水對照。

1.3.2 標本采集 實驗第8周末取材，禁食不禁水12小時，以10%水合氯醛溶液(4 mL/kg)腹腔注射麻醉后，于腹主動脈取血，靜置1小時，置于離心機4℃，3 000 r/min離心15分鐘，分離上層血清，分裝凍存待測。于各組大鼠肝臟最大葉距邊緣0.5 cm處，切取約1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的肝組織，置于4%多聚甲醛溶液中，待做病理學觀察。將最大葉剩余肝組織切成約0.5 cm×0.5 cm× 0.5 cm大小若干塊(全部過程在冰上操作)，置于凍存管中，-80℃冰箱凍存待用。

1.3.3 指標檢測 采用全自動生化檢測儀檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、TG、TC、HDL-C、LDL-C。精確稱取一塊大鼠肝組織，按質量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的冰生理鹽水，制備成10%的肝組織勻漿液，在冰浴下使用超聲勻漿機勻漿5 s/次，間隔5 s，共7～8次，至勻漿液均勻無顆粒為止，3 500 r/min離心15分鐘后取上清，按試劑盒方法測定肝臟組織中TG含量。

1.3.4 肝組織病理學 將固定好的肝組織從多聚甲醛中取出，流水過夜后脫水機梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，以4 μm連續(xù)切片行HE染色，光鏡下觀察大鼠肝臟脂肪變性情況。

1.3.5 Western blot檢測SREBP-1c蛋白表達 取約200 mg的肝組織加入RIPA裂解液2 mL及20 μL PMSF，在冰浴下使用超聲勻漿機勻漿5 s/次，間隔5秒，共7～8次，至勻漿液均勻無顆粒為止。冰浴靜置1小時；4℃離心，30 000 r/min，10分鐘。取中層清液(上層為油脂，下層為少許沉淀)，重復離心1次。BCA法定量后，將蛋白高溫變性，行聚丙酰胺凝膠電泳，轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5小時，將膜浸于兔抗鼠SREBP-1c抗體1∶500，4℃過夜，洗滌后加入辣根過氧化酶結合的山羊抗兔IgG液1∶20000(Jackson，111-035-003)室溫孵育1.5小時，洗膜后在膜上滴加ECL發(fā)光試劑，膠片曝光顯影，對條帶進行半定量分析，利用軟件讀取積分光密度值(OD)，以目的蛋白的OD值除以內參(β-actin)條帶的OD值作為最終結果進行統(tǒng)計。

1.3.6 RT- PCR檢測肝組織SREBP-1c mRNA表達 從-80℃冰箱中取出肝組織，加入Trizol裂解肝組織，提取總RNA，分光光度計檢測總RNA濃度后，逆轉錄合成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增。目的基因SREBP-1c的引物：上游5′-AGGGAGTTCTCAGATGCTCTTGGAT-3′，下游為5′-GTCTGTGCCAGTGGTGGTAGCC-3′，產物大小為80 bp；內參GAPDH引物：上游為5′-TGGAGTCTACTGGCGTCTT-3′，下游為5′-TGTCAT-ATTTCTCGTGGTTCA-3′產物大小為 138 bp。用 SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)，ROX plus進行擴增，實驗操作按產品說明書進行。擴增程序為：95°30sec，(95℃5sec，60℃40sec)×45個循環(huán)。用ABI 7500型熒光定量PCR儀，采用2-△△CT法進行數據的相對定量分析。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行處理，計量資料用表示，采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清生化指標的比較 血清ALT、AST、TG、TC、HDL-C及LDL-C模型組與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；血清ALT、AST、TG、HDL-C及LDL-C柴芪湯組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；血清ALT、AST、TG、TC及LDL-C羅格列酮組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；上述指標兩用藥組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清生化指標比較

表1 各組大鼠血清生化指標比較

注：#表示與正常組比較，P＜0.05；*表示與模型組比較，P＜0.05。

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2.2 各組大鼠肝臟組織TG水平 大鼠肝組織中TG含量模型組、柴芪湯組、羅格列酮組與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；柴芪湯組、羅格列酮組與模型組比較，差異也有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；兩用藥組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肝臟組織TG含量mmol/L

表2 各組大鼠肝臟組織TG含量mmol/L

注：#表示與正常組比較，P＜0.05；*表示與模型組比較，P＜0.05。

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2.3 各組大鼠肝臟組織觀察結果 光鏡下正常組肝組織結構完整，肝細胞以中央靜脈為中心向四周呈條索狀、放射狀整齊排列，肝細胞分界清，肝小葉結構完整，肝竇排列規(guī)則，匯管區(qū)清晰。模型組大鼠肝細胞胞質內充滿大量大小不等的圓形脂滴，肝小葉結構不清，肝索排列紊亂，大部分肝細胞呈脂肪變性。柴芪湯組大鼠肝細胞胞質內脂滴較少，肝索排列較正常，肝血竇擴張，肝細胞形態(tài)接近正常。羅格列酮組大鼠肝臟脂變程度介于模型組與柴芪湯組之間，肝細胞形態(tài)基本可見，肝細胞脂肪變性少見，可見點狀炎性細胞浸潤。見圖1。

圖1 光鏡下觀察大鼠肝組織(HE，×200)

2.4 各組SREBP-1c mRNA及蛋白的表達情況

SREBP-1c及SREBP-1c mRNA表達模型組、柴芪湯組、羅格列酮組與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；柴芪湯組、羅格列酮組與模型組比較，差異也有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；2用藥組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 各組大鼠肝臟SREBP-1c蛋白及其mRNA表達

3 討論

3.1 NAFLD的中醫(yī)學認識 中醫(yī)學認為食物的消化吸收有賴于肝疏泄和脾運化的功能正常，飲食不節(jié)、過食肥甘厚味，勞逸失?；蚯橹舅鶄?，可損傷肝脾，而致肝失疏泄，氣機阻滯，脾胃運化失健，水谷精微不化，停聚濕生痰，痰濕阻絡，血行不暢，留而為瘀，終致氣、血、濕、痰互結于肝而成脂肪肝。故肝郁脾虛是NAFLD的主要病理基礎。柴芪湯由黃芪、柴胡、白術、枳實、三七粉組成。方中黃芪補中益氣健脾，柴胡疏肝解郁，調暢氣機，共為君藥；白術健脾助運，“見肝之病，知肝傳脾，當先實脾”，故實脾以防肝乘，為臣藥；枳實理氣解郁，與柴胡共同調暢肝脾氣機，為佐藥；三七化瘀止血活血為使藥。此方補中有疏，調中有養(yǎng)，護脾治肝，使脾運復健，肝郁得疏，標本同治。

3.2 柴芪湯對大鼠血清血脂及肝功能的影響 LDL-C為極低密度脂蛋白水解后除去部分脂肪及少量蛋白質后的殘余部分，主要用于運輸體內膽固醇至肝臟，檢測LDL-C水平可反映肝臟膽固醇水平［6］。HDL-C主要由肝臟生成和分泌，用于將肝臟中的磷脂和膽固醇轉運出去［7］。模型組血清TG、TC及LDL-C較正常組明顯升高，同時HDL-C降低，符合NAFLD病變模型。柴芪湯干預8周后，可明顯降低TG及LDL-C，并提高HDL-C含量，但對血清TC含量改善較模型改善無統(tǒng)計學意義。羅格列酮可降低NAFLD大鼠血清TG、TC及LDL-C含量，但對提高HDL-C無明顯效果。ALT和AST主要分布于肝及心肌細胞內，血清中含量較少，當肝細胞膜通透性增加或嚴重受損時ALT和AST被釋放至血，血清ALT和AST水平升高［8］。因此，模型組大鼠經喂養(yǎng)特殊飼料后發(fā)生肝臟脂肪病變時肝細胞膜通透性改變，大量細胞受損或壞死，導致血清ALT和AST水平升高。利用柴芪湯或羅格列酮干預后均可較模型組降低血清ALT及AST含量，且血清中該2項指標與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，表示柴芪湯與羅格列酮有一定保護肝臟功能的作用，且效果相當。

3.3 柴芪湯對肝臟組織TG影響 過量高脂飲食可使肝內TG堆積［9］，引起肝組織脂肪變性。研究結果顯示，NAFLD患者存在脂代謝紊亂［10］，肝細胞內脂質代謝紊亂是引起TG大量沉積于肝臟的重要原因，TG是肝細胞正常生理功能的必需物質之一，但當肝組織中沉積大量TG則會導致脂肪肝變性［11］。本研究發(fā)現(xiàn)柴芪湯及羅格列酮均可改善TG在肝組織中的沉積，兩者比較差異無統(tǒng)計意義。

3.4 柴芪湯對肝臟SREBP-1c的影響 SREBP-s是一類分布于內質網和核膜上的膜連接蛋白，有3種同工型：SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP-2，嚙齒類動物和人類的肝臟中以SREBP-1c為主，它是一類調控脂肪酸TG和TC的合成，參與LDL-C代謝相關基因表達的核轉錄因子，上調脂肪合成基因的表達，可明顯增加游離脂肪酸和TG的合成，在NAFLD的發(fā)病過程中具有重要作用［12］。

本實驗利用特殊飼料誘發(fā)NAFLD模型，病理形態(tài)證實模型成立，RT-PCR與Western Blot實驗結果提示模型組SREBP-1c mRNA表達及蛋白含量較正常組明顯增加，與文獻中報道一致［13］。使用柴芪湯及羅格列酮干預后發(fā)現(xiàn)SREBP-1c mRNA表達及蛋白含量較模型組降低，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示柴芪湯與羅格列酮可能有相似的干預機制，均可以通過抑制SREBP-1c mRNA表達和下調SREBP-1c的表達，減少脂肪酸和甘油三酯的生成，從而對NAFLD具有防治作用。

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Effects of ChaiQi Tang on Expression of SREBP-1c in Rats with Nonalcoholic Fatty Liver Disease

CHEN Liru1,ZHANG Liping2△,LIU Yuan1,NIE Wei1,Malina·AXINBAI1
1 Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;
2 International Exchange and Cooperation of Beijing University of Chinese Medicine

Objective: To observe the effects of ChaiQi Tang on SREBP-1c mRNA and protein expression in rats with nonalcoholic fatty liver disease(NAFLD) and explore the possible mechanism of preventing and treating NAFLD. Methods: All 32 male SPF rats were randomly divided into the normal group, the model group, ChaiQi Tang group and rosiglitazone group, each group eight rats, all groups were fed with high salt, high fat and high sugar diet for eight weeks for duplicating NAFLD model, the medication groups accepted gastric lavage of ChaiQi Tang [5.67 g/ (kg·d)] and rosiglitazone suspension [3 mg/(kg·d）] from the first day of preparing the models, ALT, AST, TG, TC, HDL-C, LDL-C and TG level in liver were detected after eight weeks; pathological changes of hepatic tissue were observed; SREBP-1c protein expression was measured by Western Blot; SREBP-1c mRNA expression was measured by RT-PCR. Results: The model group was higher than the normal group obviously in the levels of ALT, AST, TG, TC, HDL-C, LDL-C in serum and TG in liver(P＜0.05), the two medication groups were lower than the model group in different indexes, and there were statistical differences (P＜0.05); there were no statistical difference between two groups(P＞0.05). Two medication groups were lower than the model group in the levels of SREBP-1c mRNA and protein expression, there were statistical differences(P＜0.05), but there were no statistical differences between two medication groups(P＞0.05). Conclusion: ChaiQi Tang can improve fatty change of liver in rats with NAFLD, its intervention function is similar to rosiglitazone, ChaiQi Tang also can inhibit SREBP-1c mRNA and protein expression, finally reducing ALT, AST, TG, TC, HDL-C, LDL-C of serum in rats with NAFLD, this may be one of mechanisms of ChaiQi Tang treating NAFLD.

NAFLD; ChaiQi Tang; rosiglitazone; SREBP-1c

R285.5

A

1004-6852(2016)12-0013-05

2016-07-08

國家自然科學基金資助項目(編號81273695)；高等學校博士學科點專項科研基金項目(編號20130013110016)；北京中醫(yī)藥大學在讀研究生項目(編號2015-JYB-XS163)。

陳麗如(1976—)，女，在讀博士研究生。研究方向：消化系統(tǒng)疾病的中醫(yī)診治。

△通訊作者：張立平(1963—)，女，博士學位，博士研究生導師，教授，主任醫(yī)師。研究方向：消化系統(tǒng)疾病的中醫(yī)診治。