王興紅,李紅葉

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 華北林業(yè)實驗中心,北京　102300;2.浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,浙江 杭州　310058)

?

柑橘葉點(diǎn)霉菌ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

王興紅1,李紅葉2

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 華北林業(yè)實驗中心,北京102300;2.浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,浙江 杭州310058)

摘要：為了獲得最優(yōu)柑橘黑斑病病原菌柑橘葉點(diǎn)霉菌 ISSR-PCR反應(yīng)體系,利用單因素試驗法對反應(yīng)體系中的5個因素(Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶和模板DNA)分別設(shè)置了不同的濃度梯度進(jìn)行反應(yīng)體系的優(yōu)化。結(jié)果表明,在20 μL反應(yīng)體系中,含有1.5 mmol/L的Mg2+、0.15 mmol/L的dNTP、0.3 μmol/L的引物、25 ng DNA模板、0.5 U Taq DNA聚合酶為最優(yōu)。利用優(yōu)化的ISSR-PCR反應(yīng)體系對不同地理來源的21株柑橘葉點(diǎn)霉菌菌株進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果表明,已建立的體系穩(wěn)定可靠。柑橘葉點(diǎn)霉菌ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立為利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對柑橘葉點(diǎn)霉菌進(jìn)行遺傳分析奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：柑橘葉點(diǎn)霉菌;ISSR;單因素試驗法;柑橘黑斑病

柑橘是世界第一大水果,我國是柑橘的重要原產(chǎn)地之一,種植面積和產(chǎn)量均居世界首位[1]。由柑橘葉點(diǎn)霉菌(Phyllostictacitricarpa)(有性態(tài)為GuignardiacitricarpaKiely)引起的柑橘黑斑病是我國柑橘的主要病害之一,該病菌主要侵染幼果,潛伏期長,一般待果實接近成熟才表現(xiàn)癥狀[2],果實受害嚴(yán)重時易脫落,不脫落果實因果皮上的病斑難以銷售。柑橘黑斑病主要分布在亞洲、澳大利亞、南美洲、南非等柑橘產(chǎn)區(qū)[3],在歐盟地區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)該病害存在,因此黑斑病被歐盟列為A1類檢疫對象[4],帶病果實無法出口歐盟等多個國家。作者的前期研究發(fā)現(xiàn),在我國柑橘葉點(diǎn)霉菌主要危害寬皮柑橘(Citrusreticulata)、甜橙(Citrussinensis)和檸檬(Citruslimon),而柚類果實上的褐斑病的病原則是亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌[5]。

Zietkiewicz等[6]在PCR擴(kuò)增技術(shù)的基礎(chǔ)上建立了簡單重復(fù)序列間(Inter-simple sequence repeat,ISSR)擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)。與其他方法相比,ISSR分子標(biāo)記技術(shù)具有不需要了解物種遺傳背景、操作過程簡便、引物設(shè)計簡單以及成本低廉等特點(diǎn)。但該技術(shù)易受許多因素的干擾,在條件不適宜的情況下會導(dǎo)致圖譜彌散、擴(kuò)增條帶不清晰甚至消失,嚴(yán)重影響多態(tài)性分析。因此在不同物種進(jìn)行ISSR分析前,均需摸索最佳反應(yīng)條件,保證試驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。目前,ISSR分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物病原菌遺傳多樣性分析、基因定位、親緣關(guān)系分析以及遺傳作圖等方面的研究[7-9]。

國內(nèi)外對柑橘葉點(diǎn)霉菌種群遺傳多樣性的研究較少,僅利用RAPD、AFLP和DNA序列分析技術(shù)[10-15],對柑橘葉點(diǎn)霉菌進(jìn)行了遺傳變異分析,目前尚無利用ISSR分子標(biāo)記研究柑橘葉點(diǎn)霉菌真菌的遺傳多樣性。為了獲得適合柑橘葉點(diǎn)霉菌種群遺傳多樣性分析的ISSR-PCR反應(yīng)體系,本研究對ISSR-PCR反應(yīng)體系影響較大的因素(模板濃度、Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶及引物)進(jìn)行優(yōu)化試驗。為進(jìn)一步利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)研究柑橘葉點(diǎn)霉菌不同種群遺傳多樣性奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1試驗材料

1.1.1供試菌株供試菌株來自重慶、四川、佛羅里達(dá)、非洲和浙江具有柑橘黑斑病癥狀的果實和葉片,通過組織分離純化得到單孢菌株,經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為柑橘葉點(diǎn)霉菌(表1)。

1.1.2供試試劑利用加拿大哥倫比亞大學(xué)(Columbia University)公布的ISSR引物序列,由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成,用于本研究ISSR-PCR反應(yīng)。TaqDNA聚合酶、dNTP、Trans2K Plus DNA Marker均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2試驗方法

1.2.1基因組DNA的提取將不同來源的柑橘葉點(diǎn)霉菌在PDA平板上活化10 d,在培養(yǎng)皿中加入2.0mL無菌水,用玻璃涂布棒刮取分生孢子,將100 μL分生孢子懸浮液置于100 mL PDB中,于25 ℃ 110 r/min振蕩培養(yǎng)10 d。用滅菌紗布過濾菌絲體,并用無菌水沖洗2次,用滅菌濾紙將水分吸干后置于-80 ℃冰箱保存。用液氮充分研磨菌絲后,利用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的DNA,0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量,利用超微量分光光度計(NanoDrop 2000)測量所提取DNA的OD260/280值均在1.8左右,純度較高。將DNA濃度稀釋為50 ng/μL,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　供試菌株及其來源

1.2.2ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化在20 μL的反應(yīng)體系中,對影響ISSR-PCR反應(yīng)的模板DNA用量、Mg2+濃度、dNTP濃度、TaqDNA聚合酶用量和引物濃度分別設(shè)置10，6，13，4,10個不同的梯度(表2)。采用初步篩選的哥倫比亞大學(xué)公布的引物891(5′-HVHTGTGTGTGTGTGTG-3′)作為試驗的固定引物,以BTC200938菌株的DNA作為反應(yīng)體系的模板。當(dāng)進(jìn)行某一因素水平試驗時,其他因素保持不變,每個處理3次重復(fù)。

表2　ISSR-PCR反應(yīng)體系中5種成分用量表

1.2.3ISSR-PCR反應(yīng)程序94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,不同引物最佳退火溫度1 min,72 ℃延伸1 min,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。采用1.5%的瓊脂糖凝膠對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測,并進(jìn)行EB染色,紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照保存。

1.2.4反應(yīng)體系穩(wěn)定性測定采用優(yōu)化后的ISSR-PCR反應(yīng)體系,利用篩選的引物對來自重慶、四川、佛羅里達(dá)、非洲和浙江的21株菌株進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增,對建立的柑橘葉點(diǎn)霉菌的優(yōu)化體系及反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行穩(wěn)定性檢測。

2結(jié)果與分析

2.1Mg2+對ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響

擴(kuò)增結(jié)果顯示(圖1),當(dāng)Mg2+濃度為0.5 mmol/L時,PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的非特異性條帶增加;當(dāng)Mg2+濃度為1.0 mmol/L時,擴(kuò)增條帶模糊不清;Mg2+濃度為2.0~3.0 mmol/L時,擴(kuò)增條帶不清晰,且部分條帶丟失;當(dāng)Mg2+濃度為1.5 mmol/L時,擴(kuò)增條帶清晰可辨,且條帶數(shù)量最多。為了得到理想的試驗結(jié)果，本試驗選擇Mg2+濃度為1.5 mmol/L。

M.Trans2K plus DNA Marker;1~6.Mg2+濃

2.2dNTP濃度對ISSR-PCR反應(yīng)的影響

試驗結(jié)果表明(圖2),當(dāng)dNTP濃度為0.05~0.10 mmol/L時,條帶較弱;當(dāng)dNTP濃度處于0.15~0.20 mmol/L時,擴(kuò)增效率高,條帶清晰可辨;當(dāng)dNTP濃度為0.25~0.80 mmol/L時,隨著濃度的增加,非特異性條帶也不斷增加,背景模糊,條帶更加彌散,清晰度不斷下降。綜上所述,dNTP濃度在0.15~0.20 mmol/L時,條帶穩(wěn)定且清晰可辨,但為了節(jié)約成本,dNTP濃度選擇0.15 mmol/L為宜。

2.3引物濃度對ISSR-PCR反應(yīng)的影響

擴(kuò)增結(jié)果顯示(圖3),反應(yīng)體系中引物濃度為0.1~0.2 μmol/L時,條帶數(shù)量少且模糊不清;當(dāng)引物濃度為0.3~0.6 μmol/L時,背景清晰,條帶分辨率最佳;當(dāng)引物濃度在0.7~1.0 μmol/L時,擴(kuò)增效率降低,條帶更加模糊,部分條帶缺失。為了節(jié)約成本,本研究引物濃度選擇0.3 μmol/L為宜。

M.Trans2K plus DNA Marker;1~13.dNTP的濃度分別為0.05,0.10,

M.Trans2K plus DNA Marker;1~10.引物濃度依次為

2.4TaqDNA聚合酶用量對ISSR-PCR反應(yīng)的影響

擴(kuò)增結(jié)果顯示(圖4),當(dāng)反應(yīng)體系中TaqDNA聚合酶為0.5 U時,背景清晰,條帶分辨率高;當(dāng)TaqDNA聚合酶為1.0~2.0 U時,條帶彌散嚴(yán)重,背景模糊,部分條帶缺失。綜上所述TaqDNA聚合酶為0.5 U較合適。

M.Trans2K plus DNA Marker;1~4.Taq DNA

2.5模板DNA用量對ISSR-PCR反應(yīng)的影響

PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示(圖5),DNA用量為200.00~800.00 ng時,由于模板濃度高擴(kuò)增產(chǎn)生的非特異性條帶較多,且分辨率較差;當(dāng)模板用量為25.00~100.00 ng時,擴(kuò)增條帶數(shù)量穩(wěn)定,且清晰可辨;當(dāng)DNA用量為1.56~12.50 ng時,由于反應(yīng)體系中模板濃度低,造成擴(kuò)增效率降低,條帶模糊難辨。為了得到理想的試驗結(jié)果,在20 μL 的反應(yīng)體系中,加入25.00 ng DNA為宜。

M.Trans2K plus DNA Marker;1~10.模板DNA用量依次為800.00,

2.6最佳柑橘葉點(diǎn)霉菌ISSR-PCR體系的建立

本研究通過對影響柑橘葉點(diǎn)霉菌ISSR-PCR反應(yīng)的主要因素模板DNA用量、Mg2+濃度、dNTP濃度、TaqDNA聚合酶用量和引物濃度的優(yōu)化,最終獲得了柑橘葉點(diǎn)霉菌ISSR-PCR的最佳反應(yīng)體系,見表3。

表3　柑橘葉點(diǎn)霉菌ISSR-PCR反應(yīng)體系

2.7柑橘葉點(diǎn)霉菌ISSR-PCR反應(yīng)體系的穩(wěn)定性檢驗

利用優(yōu)化的反應(yīng)體系,采用篩選的11條引物對21株柑橘葉點(diǎn)霉菌菌株進(jìn)行ISSR-PCR反應(yīng)體系的穩(wěn)定性檢驗,部分試驗結(jié)果見圖6。圖6擴(kuò)增結(jié)果顯示，21個參試菌株均能擴(kuò)增出穩(wěn)定性高、清晰度高、多態(tài)性高的條帶。說明建立的柑橘葉點(diǎn)霉菌ISSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠,可以用于柑橘葉點(diǎn)霉菌遺傳多樣性分析。

M.Trans2K plus DNA Marker;1~21.DNA模板依次為BTC200938、BTC200940、XC2010302、XC2010303、XC2010304、NM2010108、NM2010110、NM2010111、NM2010115、NM2010116、NM2010117、NM2010119、NM2010121、NM308、F306、Mq848、Mq833、Mq838、s278、a307、CRL。

M.Trans2K plus DNA Marker；1-21.DNA template BTC200938,BTC200940,XC2010302,XC2010303,XC2010304,NM2010108,NM2010110,NM2010111,NM2010115,NM2010116,NM2010117,NM2010119,NM2010121,NM308,F306,Mq848,Mq833,Mq838,s278,a307,CRL.

圖6引物812對21株柑橘葉點(diǎn)霉菌的擴(kuò)增結(jié)果

Fig.6The result of ISSR-PCR electrophoresis products

of 21 strains ofP.citricarpawith primer 812

3討論與結(jié)論

ISSR-PCR反應(yīng)是一個受多因素影響的綜合反應(yīng)體系,其中Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度、TaqDNA聚合酶用量以及模板DNA用量等因素對擴(kuò)增效果有較大的影響[16-18]。不同菌種ISSR-PCR反應(yīng)體系中各成分用量均不相同[19-21],因此，在新的菌種進(jìn)行ISSR分析時必須對反應(yīng)體系中的各成分進(jìn)行優(yōu)化,得到適合該菌種的最佳反應(yīng)體系。本研究采用單因素法,對影響ISSR-PCR擴(kuò)增效果的每個因素的不同濃度或用量進(jìn)行逐一篩選,建立了穩(wěn)定性好、具有可重復(fù)性的柑橘葉點(diǎn)菌的ISSR-PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)體系為:在20 μL反應(yīng)體系中,含有1.5 mmol/L的Mg2+,0.15 mmol/L的dNTP,0.3 μmol/L的引物,25 ng模板,0.5 UTaqDNA聚合酶;擴(kuò)增程序為:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,不同引物最佳退火溫度1 min,72 ℃ 1 min,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

在ISSR-PCR反應(yīng)體系中[22-23],Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必需的,Mg2+濃度除了影響TaqDNA聚合酶活性以外,還會影響擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性、引物退火和引物二聚體的形成等,Mg2+濃度過低會產(chǎn)生非特異性條帶,濃度過高條帶則模糊不清,本研究中Mg2+濃度為1.5 mmol/L時獲得較好的擴(kuò)增結(jié)果;dNTP作為PCR反應(yīng)的原料,濃度過低時條帶模糊不清,濃度過高時非特異性條帶增加,本研究中當(dāng)dNTP的濃度為0.15 mmol/L時柑橘葉點(diǎn)霉菌PCR擴(kuò)增效果較理想;引物濃度對PCR擴(kuò)增效果也具有影響,引物濃度過低時條帶模糊不清,濃度過高時易產(chǎn)生引物二聚體和堿基錯配,本研究中引物濃度為0.3 μmol/L時PCR擴(kuò)增效果較理想;TaqDNA聚合酶也是PCR中必不可少的原料,濃度高時條帶彌散難辨且提高試驗成本,濃度過低時導(dǎo)致PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量少,本研究中TaqDNA聚合酶的最佳用量為0.5 U;DNA是PCR擴(kuò)增的模板,在PCR擴(kuò)增中必不可少,DNA含量過高時非特異性條帶增加,含量過低時不能擴(kuò)增出目的條帶或擴(kuò)增產(chǎn)物不穩(wěn)定,本研究中PCR擴(kuò)增體系中(20 μL)含有 25 ng DNA擴(kuò)增效果較理想。

本試驗建立的體系是采用單因素梯度試驗進(jìn)行最佳組合的摸索,通過鑒定得到清晰穩(wěn)定的條帶,這一優(yōu)化的反應(yīng)體系可用于柑橘葉點(diǎn)霉菌遺傳多樣性的分析。

參考文獻(xiàn)：

[1]沈兆敏.2012年我國柑橘生產(chǎn)現(xiàn)狀淺析及持續(xù)發(fā)展對策[J].果農(nóng)之友,2013(10):38-39,41.

[2]EPPO.Guignardiacitricarpa[J].Bulletion OEPP/EPPO,2009,39(3):318-327.

[3]Hendricks K E M,Donahoo R S,Roberts P D,et al.Effect of copper on growth characteristics and disease control of the recently introducedGuignardiacitricarpaonCitrusin Florida[J].American Journal of Plant Sciences,2013,4:282-290.

[4]Paul I,van Jaarsveld A S,Korsten L,et al.The potential global geographical distribution of citrus black spot caused byCuignardiacitricarpa(kiely):likehood of disease establishment in the European Union[J].Crop Protection,2005,24:297-308.

[5]Wang X H,Chen G Q,Huang F,et al.Phyllostictaspecies associated with citrus diseases in China[J].Fungal Diversity,2012,52(1):209-224.

[6]Zietkiewicz E,Rafalski A,Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics,1994,20(2):176-183.

[7]Neal C O,Richardson A O,Hurst S F,et al.Global population structure ofAspergillusterreusinferred by ISSR typing reveals geographical subclustering[J].BMC Microbiology,2011,11:203.

[8]Mostafa N,Omar H,Tan S G,et al.Studies on the genetic variation of the green unicellular algaHaematococcuspluvialis(Chlorophyceae) obtained from different geographical locations using ISSR and RAPD molecular marker[J].Molecules,2011,16(3):2599-2608.

[9]Zhang X G,Han T,He Z G,et al.Genetic diversity ofCentellaasiaticain China analyzed by inter-simple sequence repeat (ISSR) markers:combination analysis with chemical diversity[J].Journal of Natural Medicines,2012,66(1):241-247.

[10]Glienke-Blanco C,Aguilar-Vildoso C I,Vieira M L C,et al.Genetic variability in the endophytic fungusGuignardiacitricarpaisolated fromCitrusplants[J].Genetics and Molecular Biology,2002,25(2):251-255.

[11]Baayen R P,Bonants P J M,Verkley G,et al.Nonpathogenic isolates of the citrus black spot fungus,Guignardiacitricarpa,identified as a cosmopolitan endophyte of woody plants,G.mangiferae(Phyllostictacapitalensis)[J].Phytopathology,2002,92(5):464-477.

[12]Baldassari R B,Wickert E,de Goes A.Pathogenicity,colony morphology and diversity of isolates ofGuignardiacitricarpaandG.mangiferaeisolated fromCitrusspp.[J].Rur J Plant Pathol,2008,120:103-110.

[13]Stringari D,Glienke C,de Christo,et al.High molecular diversity of the fungusGuignardiacitricarpaandGuignardiamangiferaeand new primers for the diagnosis of the citrus black spot[J].Brazilian Archives of Biology and Technology,2009,52(5):1063-1073.

[14]Wickert E,De Goes A,De Souza A,et al.Genetic diversity and population differentiation of the causal agent of citrus black spot in Brazil[J].The Scientific World Journal,2012(2):368286.doi:10.1100/2012/368286.

[15]Zavala M G M,Er H L,Goss E M,et al.Genetic variation amongPhyllostictastrains isolated from citrus in Florida that are pathogenic or nonpathogenic toCitrus[J].Tropical Plant Pathology,2014,39(2):119-128.

[16]郝麗芬,宋培玲,李子欽,等.油菜黑脛病菌ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化[J].華北農(nóng)學(xué)報,2013,28(4):204-207.

[17]張茹,劉亞令,梁建萍,等.黃芪ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(1):9-11.

[18]張維銘.現(xiàn)代分子生物學(xué)試驗手冊[M].2版.北京:科學(xué)出版社,2007.

[19]孫立夫,張艷華,裴克全,等.法國蜜環(huán)菌ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].菌物學(xué)報,2009,28(2):261-267.

[20]朱海榮,段霞瑜,周益林,等.小麥白粉病菌基因組DNA的微量提取及ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].植物保護(hù),2010,36(3):125-129.

[21]胡中會,趙立華,佟愛仔,等.煙草赤星病菌ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2011,26(5):602-606.

[22]沈萬寬,習(xí)平根,姜子德.甘蔗鞭黑粉菌ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2012,34(4):712-717.

[23]吳鳴謙,閆淑珍,陳雙林.擬莖點(diǎn)霉ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].生物技術(shù)通報,2012(3):123-127.

Optimization of Inter-simple Sequence Repeat PCR Reaction System ofPhyllostictacitricarpa

WANG Xinghong1,LI Hongye2

(1.Experimental Center of Forestry in North China,Chinese Academy of Forestry,Beijing102300,China;2.College of Agriculture & Biotechnology,Zhejiang University,Hangzhou310058,China)

Abstract：In order to obtain the optimization of ISSR-PCR reaction system of Phyllosticta citricarpa (McAlpine) van der Aa,the concentrations of five factors (Mg2+,dNTP,primers,Taq DNA polymerase,template) were respectively optimized by single factor test.The result showed that the optimized reaction system consisted of 1.5 mmol/L Mg2+,0.15 mmol/L dNTP,0.3 μmol/L primers,25 ng template DNA,0.5 U Taq DNA polymerase.The optimized ISSR-PCR reaction system was stable and credible by the amplification of 21 strains of P.citricarpa.The study would provide the basis for the genetic analysis of P.citricarpa.

Key words:Phyllosticta citricarpa;Inter-simple sequence repeat;Single factor test;Citrus black spot

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.020

中圖分類號：S435.79

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)01-0123-05

作者簡介：王興紅(1982-),女,河北深州人,工程師,博士,主要從事植物病原真菌系統(tǒng)演化研究。通訊作者：李紅葉(1963-),女,浙江麗水人,教授,博士,博士生導(dǎo)師,主要從事病原菌的生態(tài)和種群系統(tǒng)進(jìn)化研究。

基金項目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(柑橘)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金(CARS-27)

收稿日期：2015-10-13