許　力,李　姣,宋文強,李立芹

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,四川 成都　625014)

?

水楊酸通過提高抗氧化酶活性及基因表達緩解番茄低鉀脅迫

許力,李姣,宋文強,李立芹

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,四川 成都625014)

摘要：探討水楊酸(SA)對低鉀脅迫下番茄幼苗生理指標(biāo)及基因表達的影響,為研究SA和低鉀脅迫之間的關(guān)系奠定重要的理論基礎(chǔ)。研究噴施不同濃度(0.10,0.25,0.50,1.00 mmol/L)的SA對低鉀脅迫下番茄幼苗氧化酶活性及基因表達的影響。結(jié)果表明,在低鉀處理下噴施0.25 mmol/L的SA,番茄幼苗中Chl、Pro的含量、CAT、APX、POD、SOD的活性與對照組相比明顯增加,MDA含量則明顯降低。同時采用熒光定量PCR對幼苗葉片中的APX、CAT、POD與SOD基因表達模式進行分析,發(fā)現(xiàn)這4個基因的表達量在處理48,96 h后明顯增加。推測在低鉀脅迫下噴施0.25 mmol/L SA能促進APX、CAT、POD與SOD基因的表達,進而降低活性氧ROS的積累,增強番茄幼苗對低鉀脅迫的抗性。

關(guān)鍵詞：水楊酸;番茄;鉀;抗氧化酶;基因

鉀是植物生長發(fā)育所必需的大量元素之一,K+參與調(diào)節(jié)一些酶的活性和植物細胞光合作用、蛋白合成、離子穩(wěn)態(tài)等一些生理代謝過程,如果植物在生長過程中缺鉀則會使其生長受到限制,在缺鉀嚴重時甚至無法使植物完成其生活史[1]。番茄屬需鉀量較大的蔬菜品種,在生育后期,鉀肥更為重要。近年來,有機肥用量減少,氮素化肥用量不斷增加,而鉀素又易于流失,因此,栽培番茄很容易出現(xiàn)缺鉀現(xiàn)象[2]。缺鉀會導(dǎo)致番茄細胞內(nèi)活性氧ROS積累,進而導(dǎo)致氧化脅迫[3],ROS雖是脅迫代謝的有毒產(chǎn)物,同時在低鉀脅迫中也是一類重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子[4]。

水楊酸(SA)是生物脅迫耐性機制中的一種重要成分,它與JA、ABA等相互作用通過復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)植物在高溫、低溫、重金屬等各個方面的反應(yīng)[5-6]。目前,關(guān)于SA參與植物響應(yīng)非生物脅迫方面已有許多報道,經(jīng)過SA預(yù)處理的擬南芥,通過誘導(dǎo)根質(zhì)膜去極化和降低GORK(Guard cell outward rectifying K+channel)通道的K+電流,進而提高其耐鹽性[7]。在大麥中,SA通過增強抗氧化酶活性來降低鹽脅迫與缺水脅迫對植物危害,從而提高其耐鹽性與耐旱性[8]。經(jīng)過SA預(yù)處理的玉米能增強對低溫脅迫的耐受性[9]。在番茄中,SA處理能顯著提高細胞中抗氧化酶活性從而增強其耐鹽性和在多種脅迫下的抗性[10-11],但至今還未見SA對低鉀脅迫下番茄抗氧化酶活性和基因表達影響的研究報道。

本試驗的目的是探討不同濃度SA對低鉀脅迫下番茄幼苗生理指標(biāo)及基因表達的影響,試驗結(jié)果表明,噴施0.25 mmol/L SA能增強番茄幼苗耐受低鉀脅迫的能力。進一步研究發(fā)現(xiàn),處理后抗氧化酶活性及其基因表達量顯著增加,這為進一步研究SA和低鉀脅迫之間的關(guān)系奠定重要的理論基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1植物試材與處理

番茄品種為中蔬四號,首先挑選籽粒飽滿、大小一致的番茄種子,用10%的次氯酸鈉消毒15 min,然后用滅菌的蒸餾水清洗5次,置于鋪有一層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi),每皿50粒種子左右,放置在16 h光/8 h暗,光照強度60 μmol/(m2·s),25 ℃的光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待發(fā)芽后將其移栽到裝有珍珠巖的培養(yǎng)盤中培養(yǎng),用營養(yǎng)液澆灌30 d。挑選大小一致的番茄幼苗進行低鉀處理,鉀濃度為10 μmol/L。時間是20 d,共有5個低鉀處理,每個處理6棵幼苗,每個處理重復(fù)3次。其中4個處理噴施不同濃度的SA(SA用無水乙醇溶解包含0.02%的吐溫-20),其濃度分別為0.10,0.25,0.50,1.00 mmol/L,對照組噴施蒸餾水(含有0.02%的吐溫-20),不同濃度的SA和蒸餾水每天均勻噴施一次,噴施葉片的正、反面,以葉片附著一層小液珠為準(zhǔn)。

營養(yǎng)液的成分:1.427 mmol/L NH4NO3;0.323 mmol/L NaH2PO4·2H2O;0.512 mmol/L K2SO4;0.998 mmol/L CaCl2;1.643 mmol/L MgSO4·7H2O;9.474 μmol/L MnCl2·4H2O;0.075 μmol/L (NH4)6Mo7O24·4H2O;18.882 μmol/L H3BO3;0.152 μmol/L ZnSO4·7H2O;0.155 μmol/L CuSO4·5H2O;0.031 mmol/L FeSO4·7H2O;0.031 mmol/L Na2EDTA·2H2O。pH值調(diào)至 5.8,低鉀營養(yǎng)液成分缺少K2SO4,其余成分相同。

1.2形態(tài)和生理指標(biāo)測定

形態(tài)和生理指標(biāo)測定在處理20 d后進行取樣。各項指標(biāo)測定試驗需要重復(fù)3次。首先測定番茄幼苗的根長與根重。用分光光度法對葉綠素(Chl)含量進行測定,用酸性茚三酮比色法進行游離脯氨酸(Pro)含量的測定,用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶(POD)的活性,過氧化氫酶(CAT)的活性用紫外吸收法測定,氮藍四唑(NBT)光還原法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性以及用硫代巴比妥酸測定丙二醛(MDA)的含量。測定抗壞血酸過氧化物(APX)活性的方法是通過記錄抗壞血酸在290 nm處吸光度的降低進行測定。

1.3qRT-PCR分析APX、CAT、POD與SOD基因表達

在低鉀處理下噴施0.25 mmol/L SA、處理時間為6,12,24,48,96 h,然后對番茄幼苗同一部位的葉片進行取樣。液氮速凍后-80 ℃保存采用TRIzol法提取總RNA,然后將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過qRT-PCR檢測APX、CAT、POD與SOD的基因表達水平。反應(yīng)體系(25 μL)包括2× SYBR Green Master Mix試劑12.5 μL,cDNA 模板2 μL,每個基因前后引物各10 μmol/L。引物序列見表1,進行PCR擴增的條件如下:50 ℃反應(yīng)2 min,95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，40個循環(huán)。每次試驗重復(fù)3次。使用Actin作為內(nèi)參來標(biāo)準(zhǔn)化候選基因的相對表達?；蛳鄬Ρ磉_水平用2-ΔΔCt方法進行計算。

表1　APX1、CAT1、POD、SOD 和 Actin的引物序列

1.4數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007軟件處理數(shù)據(jù)和繪圖,以低鉀脅迫后番茄幼苗各生理指標(biāo)與對照的增減幅度為數(shù)據(jù)源進行相關(guān)性分析,用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1根長與根重的測定

在低鉀處理下,使用不同濃度SA噴施番茄幼苗20 d后,其根長與根重在不同處理之間存在明顯差異,與對照組相比,噴施SA處理組幼苗根長有不同程度的變短,而在對番茄幼苗根重的統(tǒng)計結(jié)果中發(fā)現(xiàn),經(jīng)SA噴施處理的幼苗根重與對照組相比都有不同程度的增加,尤其是使用0.25 mmol/L SA噴施后,根重達到最大(表2)。

2.2生理指標(biāo)的測定

在低鉀處理下,噴施0.10 mmol/L SA的番茄葉片中葉綠素含量與對照相比降低到84.65%,噴施 0.25 mmol/L SA的葉綠素含量增加到114.94%,噴施0.50 mmol/L SA的葉綠素含量無明顯差異,噴施1.00 mmol/L SA的葉綠素含量降低到89.21%,試驗結(jié)果表明,噴施0.25 mmol/L SA,葉片中其葉綠素含量最高(圖1-A)。

表2　在低鉀脅迫SA處理后根長與根重的統(tǒng)計結(jié)果

注：數(shù)據(jù)后的小寫字母不同表示處理間差異顯著(P<0.05)。

Note:Values followed by different lowercase letters mean having a significant difference at 0.05 level.

游離脯氨酸含量測定的結(jié)果表明,葉片中游離脯氨酸在0.10~1.00 mmol/L的SA處理下分別比對照增加了82.67%,111.78%,83.01%,41.68%(圖1-B)。同時,CAT的活性(以鮮質(zhì)量計)分別增加了12.66%,61.34%,44.00%,35.68%(圖1-C)。APX活性(以鮮質(zhì)量計)分別增加了2.18,4.91,2.85,2.27倍(圖1-D)。結(jié)果表明,游離脯氨酸含量、CAT和APX活性在0.25 mmol/L SA處理后明顯高于對照。

圖1　SA處理對低鉀脅迫下番茄幼苗葉綠素,脯氨酸含量及抗氧化酶活性的影響

在低鉀處理和噴施不同濃度的SA后,番茄葉片中POD的活性(以鮮質(zhì)量計)與對照相比,分別增加了88.20%,65.71%,81.43%,72.11%(圖2-A)。其葉片中SOD的活性(以鮮質(zhì)量計)分別增加到了120.65%,108.85%,105.90%,110.80%(圖2-B)。MDA的含量(以鮮質(zhì)量計)與對照組相比分別降低到了91.39%,92.96%,94.29%,95.36%,生理數(shù)據(jù)表明,噴施0.25 mmol/L SA在一定程度上緩解了番茄幼苗在低鉀處理下的脅迫反應(yīng)(圖2-C)。

圖2　SA處理對低鉀脅迫下番茄幼苗

2.3APX、CAT、POD和SOD基因表達模式分析

對番茄幼苗在低鉀處理下噴施0.25 mmol/L SA,處理時間為6,12,24,48,96 h,然后對同一部位的葉片進行取樣。檢測其葉片中基因的表達量。結(jié)果表明,在6,12,24 h 處理后,APX基因在對照中的表達量明顯高于處理,但是在48,96 h處理后,該基因在對照和處理后的細胞中表達量迅速增加,在48 h時,處理后的表達量明顯高于對照,但是在96 h時,對照中的表達量明顯增加,高于處理(圖3)。

圖3　0.25 mmol/L SA 處理下APX基因表達模式分析

CAT基因的表達水平在對照中處理 6,12 h時具有較高表達水平,尤其在6 h時最高,在這2個時間點,對照中的表達量明顯高于處理。在處理48,96 h,不論在對照還是處理中,該基因表達量明顯降低,遠遠低于對照6,12 h時表達量,但在處理48,96 h時,該基因的表達量明顯高于對照(圖4)。

圖4　0.25 mmol/L SA 處理下CAT基因表達模式分析

POD基因的表達量在處理6,12,24 h時,對照中的表達水平明顯高于處理。但是在48,96 h時,處理中該基因的表達量迅速增加,尤其在48 h時達到最高。與對照組相比,基因表達量明顯增加(圖5)。SOD基因表達模式與POD基本相同(圖6)。

圖5　0.25 mmol/L SA 處理下POD基因表達模式分析

圖6　0.25 mmol/L SA 處理下SOD基因表達模式分析

3討論

眾所周知,鉀在植物生長發(fā)育過程中具有重要作用,研究表明,缺鉀導(dǎo)致玉米幼苗光反應(yīng)PSⅠ、Ⅱ途徑受損從而使光合作用受到損傷[12]。細胞水平上研究發(fā)現(xiàn),缺鉀促進鹽誘導(dǎo)的氧化脅迫和細胞損傷[13],由此說明,缺鉀會嚴重影響植物的產(chǎn)量與品質(zhì)。已有研究表明,SA參與植物響應(yīng)非生物脅迫的信號途徑,在豆科植物中SA作為信號分子參與對干旱和鹽漬的響應(yīng)[14-15]。SA處理后,不同小麥品種的抗氧化酶活性變化不同,SA通過調(diào)節(jié)這些抗氧化酶活性來提高小麥耐鹽性[16],但是在豌豆中,SA處理卻增強了NaCl對葉片的損傷[17],因此說明,SA對于植物的生物學(xué)效應(yīng)具有復(fù)雜性。

在本研究中,番茄幼苗在低鉀處理下噴施不同濃度的SA,其根長與對照相比有不同程度的降低,但其根重與對照相比有明顯的增加。這與Zahra等[18]研究結(jié)果類似,即在鹽脅迫下隨SA的濃度升高番茄幼苗的莖變短。推測根重量增加,主要是由于側(cè)根數(shù)目增加,因此，能夠促進植株對鉀營養(yǎng)吸收,有利于緩解低鉀脅迫。

番茄幼苗葉片中葉綠素含量在噴施SA濃度為0.10,1.00 mmol/L時,與對照組相比有所下降,而在SA濃度為0.25 mmol/L時,葉綠素含量比對照增加。這一結(jié)果與Zahra等[18]的研究結(jié)果相似,認為高濃度的SA使葉綠素含量降低可能是由ABA的積累所導(dǎo)致。在本試驗中發(fā)現(xiàn),噴施SA濃度為1.00 mmol/L時,番茄幼苗葉片有枯死的現(xiàn)象,而其他相對較低濃度無此現(xiàn)象出現(xiàn)。這與Senaratna等[11]的研究結(jié)果相似,經(jīng)過1.00 mmol/L SA預(yù)處理后,在高溫、冷害及鹽脅迫處理后,番茄與大豆葉片也出現(xiàn)枯萎現(xiàn)象。

與對照相比,在噴施不同濃度的SA后,葉片中脯氨酸含量都有明顯增加。Idrees等[19]研究表明,外源SA在長春花中應(yīng)用也能增加脯氨酸含量,同時發(fā)現(xiàn),處理后葉片中CAT、APX、POD及SOD的活性相比對照高。在干旱脅迫下,通過噴施SA能提高番茄中POD、SOD及CAT的活性,從而提高植株的抗旱性[20]。這與本研究結(jié)果類似。SA處理后葉片中丙二醛含量比對照有不同程度的下降。這與在葡萄的研究中有相似的結(jié)果,在鋁脅迫下,噴施SA能降低其葉片中丙二醛含量[21]。

在低鉀脅迫下,噴施0.25 mmol/L的SA處理番茄,采用熒光定量PCR對葉片中APX、CAT、POD與SOD基因表達模式進行分析,結(jié)果表明,CAT、POD與SOD基因在處理48,96 h時與對照相比表達量急劇增加,這與Zhao等[22]的研究結(jié)果相似,在熱處理后,鴨茅CAT、POD與SOD基因表達量比對照明顯升高。在高溫脅迫下28 d,熱耐受性強的早熟禾品種中SOD、POD和CAT的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于熱敏感品種[23]。這3個基因表達量在48,96 h時急劇增加,推測在低鉀脅迫前期(0~24 h),ROS逐漸積累,而且ROS可能作為信號分子誘導(dǎo)細胞對低鉀脅迫的級聯(lián)反應(yīng),從而促進抗氧化酶基因的表達。已有研究表明,番茄鉀營養(yǎng)饑餓時,H2O2產(chǎn)生的峰值在24 h,認為在這個時間點對番茄根內(nèi)的K+濃度顯著低于對照[3]。APX基因的表達量在48 h時處理組高對照組。但在96 h時截然相反。在黑麥草中的研究表明,鹽處理12 d后,在耐鹽品種中APX基因下調(diào)而鹽敏感品種中的APX基因表達量上調(diào)[24]。APX基因表達模式的特殊性表明不同抗氧化酶在清除ROS過程中可能具有不同的功能。

綜上所述,噴施0.25 mmol/L SA能夠通過促進抗氧化酶活性及其基因表達來緩解番茄低鉀脅迫。但是,生理指標(biāo)測定結(jié)果與其對應(yīng)基因表達量變化趨勢不完全一致。說明SA對抗氧化酶系統(tǒng)清除ROS,以及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控途徑的復(fù)雜性。因此,本研究為進一步深入探索SA在提高番茄抗氧化酶活性水平低鉀脅迫中的調(diào)控作用具有重要意義。

參考文獻：

[1]Kanai S,Moghaieb R E,El-Shemy H A,et al.Potassium deficiency affects water status and photosynthetic rate of the vegetative sink in green house tomato prior to its effects on source activity[J].Plant Science:An International Journal of Experimental Plant Biology,2011,180(2):368-374.

[2]Besford R T,Maw G A.Effect of Potassium nutrition on tomato plant growth and fruit development[J].Plant and Soil,1975,42(2):395-412.

[3]Hernandez M,Fernandez-Garcia N,Garcia-Garma J,et al.Potassium starvation induces oxidative stress inSolanumlycopersicumL.roots[J].Journal of Plant Physiology,2012,169(14):1366-1374.

[4]Wang Y,Wu W H.Potassium transport and signaling in higher plants[J].Annual Review of Plant Biology,2013,64:451-476.

[5]Hayat Q,Hayat S,Irfan M,et al.Effect of exogenous salicylic acid under changing environment:A review[J].Environmental and Experimental Botany,2010,68(1):14-25.

[6]Asensi-Fabado M A,Munné-Bosch S.The aba3-1 mutant ofArabidopsisthalianawithstands moderate doses of salt stress by modulating leaf growth and salicylic acid levels[J].Journal of Plant Growth Regulation,2011,30(4):456-466.

[7]Jayakannan M,Bose J,Babourina O,et al.Salicylic acid improves salinity tolerance inArabidopsisby restoring membrane potential and preventing salt-induced K+loss via a GORK channel[J].Journal of Experimental Botany,2013,64(8):2255-2268.

[8]Fayez K A,Bazaids A.Improving drought and salinity tolerance in barley by application of salicylic acid and Potassium nitrate[J].Journal of the Saudi Society of Agricultural Sciences,2014,13(1):45-55.

[9]Janda T,Szalai G,Tari I,et al.Hydroponic treatment with salicylic acid decreases the effects of chilling injury in maize (ZeamaysL.) plants[J].Planta,1999,208(2):175-180.

[10]崔召明,劉長虹.外源SA對NaCl脅迫下番茄生長、保護酶活性及產(chǎn)量的影響[J].安徽農(nóng)學(xué)通報:上半月刊,2009,15(15):98-99,191.

[11]Senaratna T,Touchell D,Bunn E,et al.Acetyl salicylic acid (Aspirin) and salicylic acid induce multiple stress tolerance in bean and tomato plants[J].Plant Growth Regulation,2000,30(2):157-161.

[12]Qu C X,Liu C,Gong X L,et al.Impairment of maize seedling photosynthesis caused by a combination of Potassium deficiency and salt stress[J].Environmental and Experimental Botany,2012,75:134-141.

[13]Gong X L,Chao L,Zhou M,et al.Oxidative damages of maize seedlings caused by exposure to a combination of Potassium deficiency and salt stress[J].Plant and Soil,2011,340(1/2):443-452.

[14]Nazar R,Iqbal N,Syeed S,et al.Salicylic acid alleviates decreases in photosynthesis under salt stress by enhancing nitrogen and sulfur assimilation and antioxidant metabolism differentially in two mungbean cultivars[J].Journal of Plant Physiology,2011,168(8):807-815.

[15]Palma F,Lluch C,Iribarne C,et al.Combined effect of salicylic acid and salinity on some antioxidant activities,oxidative stress and metabolite accumulation inPhaseolusvulgari[J].Journal of Plant Growth Regulation,2009,58(3):307-316.

[16]Mutlu S,Atici ?.Alleviation of high salt toxicity-induced oxidative damage by salicylic acid pretreatment in two wheat cultivars[J].Toxicology and Industrial Health,2013,29(1):89-96.

[17]Barba-Espín G,Clemente-Moreno M J,Alvarez S,et al.Salicylic acid negatively affects the response to salt stress in pea plants[J].Plant Biology,2011,13(6):909-917.

[18]Zahra S,Amin B,Mehdi Y.The salicylic acid effect on the tomato(LycopersicumesculentumMill.)germination,growth and photosynthetic pigment under salinity stress(NaCl)[J].Journal of Stress Physiology and Biochemistry,2010,6(3):4-16.

[19]Idrees M,Naeem M,Aftab T,et al.Salicylic acid restrains Nickel toxicity,improves antioxidant defence system and enhances the production of anticancer alkaloids inCatharanthusroseus(L.)[J].Journal of Hazardous Materials,2013,252-253:367-374.

[20]Hayata S,Sa H A,Fariduddin Q,et al.Growth of tomato(Lycopersiconesculentum)in response to salicylic acid under water stress[J].Journal of Plant Interactions,2008,3(4):297-304.

[21]張永福,任禛,陳澤斌,等.水楊酸對緩解葡萄苗鋁毒害的生理機制[J].華北農(nóng)學(xué)報,2015,30(1):182-187.

[22]Zhao X X,Huang L K,Zhang X Q,et al.Effects of heat acclimation on photosynthesis,antioxidant enzyme activities,and gene expression in orchardgrass under heat stress[J].Molecules,2014,19(9):13564-13576.

[23]Du H M Zhou P,Huang B R,et al.Antioxidant enzymatic activities and gene expression associated with heat tolerance in a cool-season perennial grass species[J].Environmental and Experimental Botany,2013,87:159 166.

[24]Hu L,Li H,Pang H,et al.Responses of antioxidant gene,protein and enzymes to salinity stress in two genotypes of perennial ryegrass (Loliumperenne) differing in salt tolerance[J].Journal of Plant Physiology,2012,169(2):146-156.

Salicylic Acid Alleviates Low Potassium Stress by Enhancing Antioxidant Enzyme Activities and Gene Expression in Tomato

XU Li,LI Jiao,SONG Wenqiang,LI Liqin

(College of Agronomy,Sichuan Agricultural University,Chengdu625014,China)

Abstract：The effect of SA on physiological indexes and gene expression were studied in tomato seedlings under low potassium stress in order to provide an important theoretical basis for the relationship between SA and low potassium stress.In this study,the different concentrations of salicylic acid (SA) (0.10,0.25,0.50,1.00 mmol/L) affect antioxidant enzyme activities and gene expression in tomato seedlings under low-potassium stress were investigated.The results showed that the chlorophyll (Chl) and proline (Pro) contents,as well as catalase (CAT),ascorbate peroxidase (APX),peroxidase (POD) and superoxide dismutase (SOD) activities,were significantly increased,and malondialdehyde (MDA) concentration decreased under 0.25 mmol/L SA treatment compared with that in the control.Meanwhile,the gene expression levels of APX,CAT,POD,and SOD in tomato leaves were analyzed through quantitative Real-time PCR.Four gene expression levels of antioxidant enzymes were considerably increased after 48,96 h treatment.These results suggested that SA promoted the gene expression levels of APX,CAT,POD,and SOD to alleviate the damage of low potassium stress,and decreased the accumulation of ROS and enhanced resistance in tomato seedlings under low-potassium stress.

Key words:Salicylic acid;Tomato;Potassium;Antioxidant enzyme;Gene

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.016

中圖分類號：Q78

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)01-0096-06

作者簡介：許力(1992-),女,四川德陽人,在讀碩士,主要從事植物分子生物學(xué)研究。通訊作者：李立芹(1974-),女,山東東阿人,副教授,博士,碩士生導(dǎo)師,主要從事植物分子生物學(xué)研究。

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(31070244)

收稿日期：2015-11-13