鞏元勇,徐珍珍,郭書巧,束紅梅,蔣　璐,倪萬潮

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,農(nóng)業(yè)部長江下游棉花和油菜重點實驗室,江蘇 南京　210014)

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陸地棉EPSPS基因全基因組分析

鞏元勇,徐珍珍,郭書巧,束紅梅,蔣璐,倪萬潮

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,農(nóng)業(yè)部長江下游棉花和油菜重點實驗室,江蘇 南京210014)

摘要：當前在NCBI中提交的來源于陸地棉的EPSPS基因有2個,隨著陸地棉基因組測序結(jié)果的公布,為在陸地棉基因組中全面鑒定EPSPS基因的存在提供了便利條件。從陸地棉異源四倍體標準系TM-1基因組數(shù)據(jù)庫中共搜尋獲得4個EPSPS同源基因,這4個基因分別分布在A07、A12、D07和D12亞基因組。從這4個基因的核苷酸序列、氨基酸序列和基因結(jié)構(gòu)的比對,構(gòu)建進化樹的系統(tǒng)發(fā)育分析以及基因的轉(zhuǎn)錄情況研究來看,定位在A07和D07亞基因組的2個基因?qū)儆诠簿€性高度同源基因,定位在A12和D12亞基因組的2個基因也是相同的情況。序列比對結(jié)果表明,已經(jīng)在NCBI中提交的2個EPSPS基因分別是定位在A12和D12亞基因組上的基因,研究結(jié)果為定位在A07和D07亞基因組上EPSPS基因的克隆和功能研究提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：陸地棉;陸地棉基因組;EPSPS基因

在植物、藻類、真菌、細菌和頂配位寄生蟲體內(nèi)存在一條和芳香族氨基酸生物合成相關(guān)的代謝途徑—莽草酸途徑(Shikimate pathway),該途徑起始于五碳糖磷酸途徑中間產(chǎn)物赤蘚糖-4-磷酸(Erythrose 4-phosphate)和糖酵解中間產(chǎn)物磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate,PEP),終產(chǎn)物是分支酸(Chorismate),有7種酶在整個途徑中發(fā)揮作用[1-2]。莽草酸途徑倒數(shù)第二步反應(yīng)是莽草酸-3-磷酸(Shikimate 3-phosphate,S3P)和磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate,PEP)化合生成5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate,EPSP),催化該反應(yīng)的關(guān)鍵酶是5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase,EPSPS,EC2.5.1.19)[1,3]。此外,EPSPS還是除草劑草甘膦的靶標酶,草甘膦是PEP的結(jié)構(gòu)類似物,它通過競爭性的抑制PEP與EPSPS的結(jié)合,由此導(dǎo)致EPSP合成受阻,最終造成芳香族氨基酸及芳香族化合物合成代謝受阻[4]。

鞏元勇等[5]的研究表明,同一個植物基因組可能有多個EPSPS同源基因存在,在擬南芥(Arabidopsisthaliana)和琴葉擬南芥(Arabidopsislyrata)基因組中各有2個EPSPS基因;Papanikou等[6]用矮牽牛(Petuniahybridavilm)的EPSPScDNA作探針顯示煙草(Nicotianatabacum)有多達5個EPSPS拷貝,這一結(jié)果表明煙草可能存在多個EPSPS同源基因;有研究證實楊樹(Populus)有7個EPSPS同源基因[7]；最新研究發(fā)現(xiàn)在小麥中有3個EPSPS同源基因[8]；劉東軍等[9]在用EPSPS基因兼并引物以陸地棉(Gossypiumhirsutum)棉花品系Y18的基因組為模板擴增,獲得2條清晰的條帶,經(jīng)測序和比對分析證實這2個片段都是EPSPS基因,2個基因的編碼區(qū)有90%的同源性,與擬南芥EPSPS基因的同源性都在80%以上,但是非編碼區(qū)不具有同源性,該結(jié)果表明棉花中至少有2個EPSPS基因;這2個基因在草甘膦脅迫下的表達特性也不一樣,短片段的EPSPS基因不受草甘膦影響,長片段EPSPS基因的表達受草甘膦誘導(dǎo)影響明顯。

棉花基因組測序工作取得長足進展,先完成測序工作的是二倍體D亞組雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)[10]和A亞組亞洲棉(Gossypiumarboreum)[11],最近又公布了異源四倍體(AADD) 陸地棉遺傳標準系TM-1全基因組序列[12-13],這必然為棉花基因功能分子生物學(xué)的研究提供強大的推動力,棉花功能基因的研究將有更深入的發(fā)展。在陸地棉基因組中已經(jīng)克隆獲得了2個EPSPS基因,那么是否還有其他EPSPS基因存在,本研究通過對陸地棉基因組的搜索驗證這個問題,并通過對發(fā)現(xiàn)的新基因的生物信息學(xué)分析,為今后克隆及深入研究該基因的功能提供基礎(chǔ)理論。

1材料和方法

1.1試驗材料

陸地棉異源四倍體標準系TM-1基因組數(shù)據(jù)來自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)作物創(chuàng)新重點實驗室(http://mascotton.njau.edu.cn/html/Data/Genomefhsequence/2015/05/05/16ab0945-19e9-49f7-a09e-8e956ec 866bf.html)[14],從NCBI下載不同物種的EPSPS蛋白質(zhì)氨基酸序列。

1.2EPSPS基因的鑒定及序列分析

用HMMER及Blast程序搜索鑒定陸地棉全基因組中存在的EPSPS基因。用Perl程序從基因組數(shù)據(jù)庫文件Gossypium_hirsutum_v1.1.cds.fa和Gossypium_hirsutum_v1.1.pep.fa中提取EPSPS基因的CDS序列和氨基酸序列。用Perl解析陸地棉基因組信息文件Gossypium_hirsutum_v1.1.fa,獲得染色體長度;分析陸地棉基因組信息文件Gossypium_hirsutum_v1.1.gene.gff3,獲得EPSPS基因在亞基因組上的位置;用MapInspect軟件繪制基因的染色體物理分布圖。

利用ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)在線分析獲得陸地棉EPSPS蛋白氨基酸序列的分子量、等電點等信息;運用DNAMAN6.0.40進行氨基酸序列的多重序列比對,選擇強調(diào)的同源性水平≥75%,其他的參數(shù)選擇系統(tǒng)默認;用CBS的ChloroP 1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)預(yù)測EPSPS蛋白質(zhì)序列的葉綠體轉(zhuǎn)運肽(Chloroplast transit peptides,CTP)[15];用MEGA4軟件(Version 4.0;http://www.megasoftware.net)[16],采用Neighbor-Joining 法對不同物種的EPSPS蛋白質(zhì)序列構(gòu)建進化樹,獲取Bootstrap consensus tree進行分析,校驗參數(shù)Bootstrap=1 000[17];用GSDS (Gene structure dispely server,http://gsds.cbi.pku.edu.cn/chinese.php)繪制EPSPS基因結(jié)構(gòu)圖[18]。

1.3EPSPS基因表達分析

以陸地棉EPSPS基因的CDS序列為Query,在NCBI網(wǎng)站的EST數(shù)據(jù)庫中通過Blast搜索,獲得和EPSPS基因相關(guān)的EST序列的信息,通過對這些信息的整合與分析,明確EPSPS基因的表達情況。

2結(jié)果與分析

2.1棉花EPSPS基因鑒定及序列分析

從陸地棉異源四倍體標準系TM-1基因組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)有4個EPSPS基因,它們分別是位于A07亞基因組的GhA07g1359,位于A12亞基因組的GhA12g0923,位于D07亞基因組的GhD07g1468和位于D12亞基因組的GhD12g1013。這4個基因的序列及基本理化性質(zhì)分析結(jié)果表明,它們的CDS序列長度都是1 566 bp,都含有8個外顯子,推測出的多肽的氨基酸序列長度都是522 a.a.,氨基酸序列的分子量和等電點都相差不大(表1)。

表1　陸地棉EPSPS基因基本信息

為構(gòu)建這4個EPSPS基因的染色體定位圖,通過對陸地棉異源四倍體標準系TM-1基因組數(shù)據(jù)的解析獲得如下信息,A07亞基因組全長78.251 018 Mb,GhA07g1359基因所在的位置是34.060 008~34.063 390 Mb;A12亞基因組全長87.484 866 Mb,GhA12g0923基因所在的位置是59.396 777~59.399 852 Mb;D07亞基因組全長55.312 611 Mb,GhD07g1468基因所在的位置是25.182 909~25.186 249 Mb;D12亞基因組全長59.109 837 Mb,GhD12g1013基因所在的位置是35.862 879~35.865 958 Mb。A07、A12、D07和D12亞基因組在陸地棉中所對應(yīng)的染色體分別是Chr.07、Chr.12、Chr.16和Chr.26,這4個陸地棉EPSPS基因在染色體的物理定位如圖1所示。

圖1　陸地棉染色體上EPSPS基因的分布

2.2棉花EPSPS基因氨基酸序列比對

用DNAman軟件對陸地棉4條EPSPS基因的氨基酸序列進行多重序列比對,發(fā)現(xiàn)這4條序列的一致性達到94.49%,氨基酸殘基N端60多個氨基酸序列一致性比較差,其余的序列都高度保守。其中GhA07g1359和GhD07g1468的氨基酸序列一致性達到97.50%,GhA12g0923和GhD12g1013的氨基酸序列一致性更是高達98.50%。

植物EPSPS氨基酸殘基的N端都存在一段葉綠體轉(zhuǎn)運肽(CIP),負責(zé)將EPSPS蛋白引導(dǎo)進入葉綠體。通過CBS的ChloroP 1.1 Server在線預(yù)測證實,棉花的4個EPSPS基因的氨基酸序列的N端也都有一段CIP存在,GhA07g1359的是前16個氨基酸殘基,GhA12g0923、GhD07g1468和GhD12g1013的都是前67個氨基酸殘基(圖2)。圖2黑框中所標注的序列涉及EPSPS與PEP(或草甘膦)的相互作用,屬于高度保守的功能序列,GhA07g1359、GhA12g0923和GhD12g1013的該段序列都是LFLGNAGTAMRPLT,GhD07g1468的該段序列略有不同,第2位氨基酸殘基是S而不是F。

2.3棉花EPSPS基因系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)EPSPS對草甘膦的內(nèi)在敏感性,它主要被分為2個級別,第Ⅰ級(Class-Ⅰ)來自大腸桿菌、沙門氏菌等細菌和擬南芥、玉米、煙草等植物,第Ⅱ級(Class-Ⅱ)來自無色菌、假單胞菌和農(nóng)桿菌等細菌。在NCBI獲取第Ⅰ級(大腸桿菌E.coli(P0A6D3)、殺鮭氣單胞菌Aeromonassalmonicida(Q03321)、擬南芥Arabidopsisthaliana(P05466)、煙草Nicotianatabacum(P23981)、矮牽牛Petuniahybrida(P11043)、玉米Zeamays(CAA44974)、百日咳博得特氏菌Bordetellapertussis(P12421))和第Ⅱ級(假單胞菌Pseudomonassp. PG2982 (P0A2Y4)、農(nóng)桿菌AgrobacteriumtumefaciensCP4(Q9R4E4)、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis(P20691)、金黃色釀膿葡萄球菌Staphylococcusaureus(Q05615)、肺炎鏈球菌Streptococcuspneumoniae(Q9S400)、變異鹽單胞菌HalomonasvariabilisHTG7(AAT76791)、惡臭假單胞菌Pseudomonasputida4G-1(AJ812018)、節(jié)瘤偶蹄形菌Dichelobacternodosus(Q46550))的EPSPS氨基酸序列和陸地棉的4個EPSPS基因的氨基酸序列一起構(gòu)建進化樹。如圖3所示,進化樹明顯分為2個大的集團,第Ⅰ級EPSPS的物種聚到一起,第Ⅱ級EPSPS的物種聚到一起;棉花的4個EPSPS同源基因聚到一起,說明它們的進化關(guān)系最近。

黑色下劃線.葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列;黑框.功能保守區(qū)序列。

圖3　不同物種EPSPS氨基酸序列進化樹分析

2.4陸地棉EPSPS基因結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)搜索獲得的陸地棉4個EPSPS基因的編碼區(qū)序列和CDS序列,用GSDS軟件在線繪制EPSPS基因結(jié)構(gòu)圖,同時分析這4個EPSPS基因的外顯子和內(nèi)含子情況。這4個EPSPS基因都具有8個外顯子,且相對應(yīng)的8個外顯子的長度都相同(圖4、表2)?？傮w看這4個基因的7個內(nèi)含子長短不一,但是兩兩分析還是有規(guī)律可循,GhA07g1359基因和GhD07g1468基因所對應(yīng)的第4,5內(nèi)含子長度一致,除了第3,6個內(nèi)含子相差84,35 bp,其他所對應(yīng)內(nèi)含子的長度差別都在個位數(shù);GhA12g0923基因和GhD12g1013基因所對應(yīng)的第3,4,6,7內(nèi)含子長度相當,其他所對應(yīng)內(nèi)含子的長度也都相差無幾(表2)。內(nèi)含子長度存在差異,使得GhA07g1359基因編碼區(qū)的長度比GhD07g1468基因的長42 bp,GhD12g1013基因編碼區(qū)的長度比GhA12g0923基因長4 bp。

圖4　陸地棉4個EPSPS基因外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)

bp

2.5陸地棉EPSPS基因轉(zhuǎn)錄表達情況分析

用陸地棉4個EPSPS基因的CDS序列作為探針在NCBI陸地棉EST數(shù)據(jù)庫中Blast,搜索獲取相關(guān)的EST序列,根據(jù)EST序列的信息分析這4個基因的轉(zhuǎn)錄表達情況(表3)。GhA07g1359的搜索結(jié)果共獲得4條EST序列,這4條EST序列來自同一個cDNA文庫,這是一個有分生組織、幼小纖維、根和莖等不同組織混合提取RNA建立的標準文庫,不能明確這幾條EST分別來自哪個組織。以GhD07g1468為探針的搜索結(jié)果與GhA07g1359的搜索結(jié)果相同,也是這4條相同的EST序列,但是再通過序列比對后最終確認,這4條EST序列來源于GhA07g1359,所以未發(fā)現(xiàn)來自GhD07g1468的EST序列。以GhA12g0923為探針搜索共獲得60條EST序列,通過序列比對最終確定有23條EST序列來自GhA12g0923基因;這23條EST序列分屬于7個不同的cDNA文庫,其中有5個文庫分別只有1條EST序列,有1個文庫有2條EST序列,有1個文庫包含16條EST序列,表達組織部位有棉鈴、纖維和胚珠。以GhD12g1013為探針搜索共獲得54條EST序列,通過序列比對最終確定有37條EST序列來自該基因;這37條EST序列也分屬于7個不同的cDNA文庫,其中有3個文庫分別只有1條EST序列,其他4個文庫分別有2,20,4,8條EST序列,表達組織部位有莖、纖維和胚珠等。

表3　陸地棉4個EPSPS基因EST序列信息

表3(續(xù))

3討論

在陸地棉異源四倍體標準系TM-1基因組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)有4個EPSPS基因,其中GhA07g1359基因在下載的數(shù)據(jù)庫中的CDS序列只有489 bp,并且其倒數(shù)第5個核苷酸顯示是N,鑒于此通過對該基因在基因組上的核苷酸序列重新分析,最終明確了GhA07g1359基因的CDS序列同其他3個基因一樣長,都是1 566 bp。

在NCBI中已經(jīng)提交2個陸地棉的EPSPS序列[19],它們的GenBank登錄號分別是EU123855和EU797516,通過序列比對證實登錄號為EU123855的EPSPS基因來自GhA12g0923,登錄號為EU797516的EPSPS基因來自GhD12g1013,還沒有GhA07g1359和GhD07g1468的全長CDS序列在NCBI中提交。

陸地棉基因組是異源四倍體,屬于AADD型,A亞組和D亞組的測序結(jié)果分析表明,這2個亞組的基因存在很高的共線性[12-13]。本研究鑒定出的這4個EPSPS基因,GhA07g1359和GhD07g1468分屬于A07和D07亞組,GhA12g0923和GhD12g1013分屬于A12和D12亞組,它們兩兩都屬于共線性基因,且從它們的核苷酸序列、氨基酸序列以及基因結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果來看,它們兩兩是具有高同源性的基因。

在陸地棉EST數(shù)據(jù)庫中搜索這4條EPSPS基因的EST序列,在表3中很明顯的可以看出,GhA12g0923和GhD12g1013在不同組織部位的表達要更活躍,GhA07g1359只在一個cDNA文庫中鑒定出EST序列,其表達情況顯然要弱很多,盡管GhD07g1468沒有檢索到相應(yīng)的EST序列,鑒于EST序列數(shù)據(jù)庫自身的局限性,也不能因此表明GhD07g1468基因不表達。在研究GenBank登錄號為EU123855的EPSPS基因時,對該基因做了組織表達定位的RT-PCR半定量試驗,表明該基因在真葉、子葉、根和莖中都有表達[20-21],但是該試驗用的引物不具有特異性,其PCR結(jié)果很可能是GhA12g0923和GhD12g1013這2個高度同源的基因的混合產(chǎn)物,所以在研究具有高度同源的基因的表達情況時,為了研究結(jié)果的準確性,必須選擇在同源基因的不保守區(qū)設(shè)計引物。

本試驗的研究結(jié)果全面地分析了EPSPS基因在陸地棉基因組的存在情況,尋獲2個新的EPSPS基因,為克隆這2個基因并深入研究這2個基因的分子生物學(xué)功能提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。

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Genome-wide Analysis of theEPSPSGenes in Upland

GONG Yuanyong,XU Zhenzhen,GUO Shuqiao,SHU Hongmei,JIANG Lu,NI Wanchao Cotton

(Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Key Laboratory of Cotton and Rapeseed,Ministry of Agriculture,Nanjing210014,China)

Abstract：Currently,two EPSPS genes from Gossypium hirsutum have been submitted to NCBI.It is more convinent to identify EPSPS genes in genome level of upland cotton comprehensively following the publication of Gossypium hirsutum genomic sequence.Four EPSPS homologous genes were identified from the genome sequence database of allotetraploid cotton (Gossypium hirsutum L.acc.TM-1),and they were found to be distributed on subgenomes of A07,A12,D07 and D12.Under the comperation of nucleotide sequences,amino acid sequences and gene structures,phylogenetic analysis of constructing phylogenetic tree and the study of transcription situation of these four genes,it was more clearly that the two genes located on A07 and D07 subgenomes belong to highly homologous co-linear gene,and the two genes located on A12 and D12 subgenomes as well.Sequence alignment results showed that the two EPSPS genes submitted to NCBI were the two genes located on A12 and D12 subgenomes respectively.The study results of this paper would provide an theoretical basis on cloning and functional research of EPSPS genes which located on A07 and D07 subgenomes.

Key words:Gossypium hirsutum;Genome sequence of upland cotton;EPSPS gene

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.003

中圖分類號：S562.01;Q78

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)01-0015-07

作者簡介：鞏元勇(1982-),男,山東惠民人,副研究員,博士,主要從事植物基因分子生物學(xué)研究。通訊作者：倪萬潮(1962-),男,江蘇盱眙人,研究員,碩士,主要從事生物技術(shù)研究。

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(31301682);江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項目(CX(14)5009);國家轉(zhuǎn)基因重大專項(2013ZX08005)

收稿日期：2015-11-09