蘆永斌，李宇，馬國煜，王秋英，劉靜，吳喜江，宣小強(qiáng)，徐東海，程寧,*

1. 蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，蘭州 730000 2. 金川公司鎳鈷工業(yè)衛(wèi)生研究所，金昌 737103 3. 蘭州大學(xué)甘肅省新藥臨床前研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000

羰基鎳急性染毒致大鼠淋巴細(xì)胞DNA損傷的劑量時間效應(yīng)

蘆永斌1，李宇3，馬國煜2，王秋英2，劉靜3，吳喜江2，宣小強(qiáng)2，徐東海2，程寧3,*

1. 蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，蘭州 730000 2. 金川公司鎳鈷工業(yè)衛(wèi)生研究所，金昌 737103 3. 蘭州大學(xué)甘肅省新藥臨床前研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000

通過急性動物實(shí)驗(yàn)觀察不同劑量羰基鎳(Ni(CO)4)染毒對大鼠淋巴細(xì)胞DNA的損傷程度。采用靜態(tài)方式對SD大鼠染毒30 min，以羰基鎳20 mg·m-3、135 mg·m-3和250 mg·m-3為低、中和高劑量染毒組，250 mg·m-3氯氣染毒組為陽性對照組，未染毒組為正常對照組。大鼠染毒后1 d、2 d、3 d和7 d分別收集樣本。采用單細(xì)胞凝膠電泳測量淋巴細(xì)胞DNA的損傷程度。通過對所得彗星圖像的尾長和Olive尾距(OTM)指標(biāo)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，大鼠淋巴細(xì)胞損傷程度隨著羰基鎳染毒劑量的增加而增加，4個時間點(diǎn)各劑量組間均有顯著差異(P<0.05)，4個劑量組各時間點(diǎn)均有顯著差異(P<0.05)，且隨時間變化有一定的變化規(guī)律，損傷程度在3 d時達(dá)最大，而后緩慢下降；在高劑量組染毒和染毒后3 d，損傷程度達(dá)到最大。急性羰基鎳染毒可致淋巴細(xì)胞DNA顯著損傷，且存在明顯的劑量、時間和交互效應(yīng)。

羰基鎳；大鼠；淋巴細(xì)胞；DNA損傷；劑量效應(yīng)關(guān)系；時間效應(yīng)關(guān)系；交互效應(yīng)關(guān)系

羰基鎳是鎳和一氧化碳在一定壓力下反應(yīng)而生成的一種金屬化合物，它以蒸氣形態(tài)迅速由呼吸道吸入，造成急性中毒反應(yīng)[2]。動物實(shí)驗(yàn)表明急性吸入羰基鎳肺臟損傷最為嚴(yán)重[3]，其次為肝臟等臟器[4]。羰基鎳急性中毒對外周血淋巴細(xì)胞的損傷效應(yīng)國內(nèi)外報道很少[5]。有研究表明Ni2+主要作用于遺傳物質(zhì)，引起DNA氧化損傷[6]。魏巧妙等[7]的研究也顯示鎳及其化合物導(dǎo)致DNA損傷，Ni2+通過與細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中不同配體形成多種復(fù)合物，影響細(xì)胞功能，這些復(fù)合物通過鐵離子催化Fenton反應(yīng)，抑制DNA損傷修復(fù)酶的活性，從而引起DNA的氧化損傷。本實(shí)驗(yàn)利用單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)觀測不同劑量羰基鎳染毒后不同時間點(diǎn)大鼠外周血淋巴細(xì)胞DNA損傷情況，分析其劑量及時間變化規(guī)律。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)方法

SPF級SD大鼠170只，雌雄各半，體重180～200 g(西安交通大學(xué)提供，許可證號SCXK (陜)2007 -001)。按照性別隨機(jī)分成4個組，由一個正常對照組(10只)和4個染毒組(40只/組)。根據(jù)大鼠靜態(tài)吸入羰基鎳30 min半數(shù)致死濃度的5%、33.8%和62.5%進(jìn)行低、中、高劑量羰基鎳染毒，濃度分別為20 mg·m-3、135 mg·m-3和250 mg·m-3；氯氣染毒組(250 mg·m-3)為陽性對照組；正常對照組不做處理。靜態(tài)方式染毒30 min。分別于染毒后1 d、2 d、3 d、和7 d共4個時間點(diǎn)處死取材。

1.2 單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)(SCGE)

按單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)進(jìn)行操作和分析[8]，對于實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了改良，改良部分包括膠體調(diào)整為底膠層、細(xì)胞層低熔點(diǎn)膠層、低熔點(diǎn)膠層，具體儀器及操作過程詳見文獻(xiàn)[9]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

表1 各染毒組不同染毒時間大鼠淋巴細(xì)胞DNA的尾長(μm)Table 1 Tail moment of lymphocyte DNA of the rat in every groups at different times

注：a，與正常對照組比較，P<0.05；b，與氯氣染毒組比較，P<0.05。

Note: a, Compared with the control group, P<0.05; b, Compared with the positive control group, P<0.05.

2 結(jié)果(Results)

2.1 羰基鎳對淋巴細(xì)胞的損傷情況

從表1可以看出，在4個時間點(diǎn)，不同羰基鎳染毒組尾長隨著劑量的增加而增加；各染毒組在3 d時尾長達(dá)最大，7 d又有所下降，提示存在劑量效應(yīng)關(guān)系。經(jīng)LSD法多重比較可以看出不同羰基鎳染毒組與正常對照組的尾長之間均有差異(P<0.05)。陽性對照組染毒后，尾長先增加后降低，2 d時達(dá)到最大。

從表2中可以看出，在4個時間點(diǎn)，不同羰基鎳染毒組Olive尾矩(OTM)隨著劑量的增加而增加；各染毒組OTM在3 d達(dá)到最大，7 d又有所下降，提示存在劑量效應(yīng)關(guān)系。經(jīng)LSD法多重比較可以看出不同羰基鎳染毒組與正常對照組的OTM均數(shù)之間均有差異(P<0.05)。氯氣對照組染毒后，OTM先增加后降低，2 d達(dá)到最大。

2.2 羰基鎳染毒劑量與尾長和OTM的劑量效應(yīng)關(guān)系

從表3可以看出，在同一時間點(diǎn)，羰基鎳染毒劑量與尾長之間呈線性相關(guān)，隨著染毒劑量增加尾長也逐漸增加，提示DNA損傷程度逐漸增強(qiáng)，存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系；染毒劑量與OTM之間呈曲線相關(guān)，在一定染毒劑量下，隨著染毒劑量增加OTM

表2 各染毒組不同染毒時間大鼠淋巴細(xì)胞DNA的Olive尾矩Table 2 Olive tail moment of lymphocyte DNA of the rat in every groups at different times

注：a，與正常對照組比較，P<0.05；b，與氯氣染毒組比較，P<0.05。

Note: a, Compared with the control group, P<0.05; b, Compared with the positive control group, P<0.05.

表3 羰基鎳染毒劑量與尾長和Olive尾矩的劑量效應(yīng)關(guān)系Table 3 Dose-response relationships between nickel carbonyl dose and tail moment and Olive tail moment

表4 羰基鎳染毒時間與尾長和Olive尾矩的時間效應(yīng)關(guān)系Table 4 Time-response relationships between nickel carbonyl infected time and tail moment and Olive tail moment

逐漸增加，提示DNA損傷程度逐漸增強(qiáng)，存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。在7 d時OTM不再隨著劑量的增加而增加，而是出現(xiàn)緩慢下降狀態(tài)。

2.3 羰基鎳染毒后時間與尾長和OTM的時間效應(yīng)關(guān)系

從表4可以看出，在同一染毒組中，羰基鎳染毒后時間與尾長呈曲線相關(guān)，存在時間效應(yīng)關(guān)系，分別在0～0.75、0～2.31、0～2.32 d內(nèi)，尾長逐漸增加，提示淋巴細(xì)胞DNA損傷程度逐漸增強(qiáng)；染毒時間與OTM呈曲線相關(guān)，存在時間效應(yīng)關(guān)系，分別在0～2.46、0～1.88、0～2.41、0～2.31 d內(nèi)，OTM逐漸增加，提示DNA損傷程度逐漸增強(qiáng)。

2.4 染毒劑量與時間的交互作用

在尾長和OTM指標(biāo)測定中，染毒后時間和染毒劑量之間存在明顯的交互作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=30.507、P=0.000，F(xiàn)=38.427、P=0.000)。在3 d和高劑量組中，尾長和OTM均達(dá)到最大，提示損傷程度達(dá)到最大；在7 d和高劑量組中，尾長和OTM均達(dá)到最小，提示損傷程度降到最小，見圖1。

圖1 染毒劑量和時間的交互作用Fig. 1 Interaction effect relationships between dose and time infected

3 討論(Discussion)

羰基鎳是急性毒性最強(qiáng)的一類鎳化合物[10]。短時間大量吸入可發(fā)生急性中毒，累及機(jī)體多種重要器官。王寧等[11]研究發(fā)現(xiàn)，急性羰基鎳中毒對大鼠肺、肝、腎靶器官細(xì)胞的DNA均有一定的損傷作用。劉靜等[6]的研究提示鎳化合物導(dǎo)致明顯的DNA單鏈斷裂發(fā)生，表明DNA或蛋白質(zhì)受到損傷。M’Bemba-Meka等[12]實(shí)驗(yàn)證明，鎳化合物導(dǎo)致人體血液淋巴細(xì)胞的染色體和核染色質(zhì)DNA鏈斷裂。SCGE是一種快速檢測單細(xì)胞DNA完整性的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。SCGE中彗尾的出現(xiàn)是細(xì)胞DNA斷裂的一個標(biāo)志，能反映DNA損傷程度和損傷特征[13]。細(xì)胞DNA受損愈重，產(chǎn)生的斷鏈或斷片就愈多，其斷鏈或斷片也就愈小，在電場作用下遷移的DNA量多，遷移的距離長，表現(xiàn)為彗星尾長增加和彗星尾部熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)對羰基鎳急性中毒大鼠淋巴細(xì)胞DNA損傷的彗星圖像進(jìn)行分析，統(tǒng)計了彗星尾長和OTM這2個指標(biāo)，探討羰基鎳急性中毒對大鼠淋巴細(xì)胞DNA損傷，以及劑量和時間對其損傷的影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠吸入不同劑量的羰基鎳后，對淋巴細(xì)胞DNA有損傷作用，呈明顯的劑量和時間效應(yīng)關(guān)系。以高劑量組的損傷作用最為明顯。在染毒后1 d、2 d和3 d，低、中、高、氯氣對照組損傷程度均高于正常對照組，呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，隨著劑量增加，淋巴細(xì)胞DNA損傷加重，且在高劑量組(250 mg·m-3)時損傷程度達(dá)到最大。Werfel等[14]研究顯示，接觸鎳煙塵的電焊工人淋巴細(xì)胞DNA鏈斷裂情況與Ni2+的濃度呈正相關(guān)，與本研究結(jié)論一致。這可能是大劑量的羰基鎳進(jìn)入體內(nèi)后，對機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示染毒后時間對DNA損傷作用的影響明顯，低、中和高劑量組在染毒后3 d損傷程度最大；從變化趨勢上看，染毒后3 d損傷達(dá)最高，7 d又有所下降，但尚未恢復(fù)至正常水平，原因可能是一定時間后排泄系統(tǒng)加大毒物排泄，毒物在體內(nèi)的分布減少所致。有研究報道顯示羰基鎳無明顯蓄積性，吸入后6 h內(nèi)即有30%～40%由呼氣中排出，吸入后1 d，體內(nèi)僅存留吸入量的17%，鎳還可以隨糞和尿排出[15]。急性羰基鎳中毒后臨床病程中，死亡病例一般發(fā)生于中毒后3 d之內(nèi)，存活者中毒癥狀也以3 d內(nèi)最重，7 d后癥狀消失，提示存在時間效應(yīng)關(guān)系，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。氯氣對照組染毒后，損傷程度先加重后降低，2 d達(dá)到最大值，且損傷程度也低于羰基鎳染毒高劑量組，提示羰基鎳的毒性及持續(xù)時間強(qiáng)于氯氣。通過上述2個指標(biāo)觀察到羰基鎳可以引起淋巴細(xì)胞DNA損傷，且隨著劑量增加損傷程度也隨之增加。

致謝：感謝耶魯大學(xué)的Cynthia Chan在文章修改中給予的幫助。

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◆

Dose-Response and Time-Effect Relationships between Lymphocyte DNA Damage of Rats Poisoned with Nickel Carbonyl

Lu Yongbin1, Li Yu3, Ma Guoyu2, Wang Qiuying2, Liu Jing3, Wu Xijiang2, Xuan Xiaoqiang2, Xu Donghai2, Cheng Ning3,*

1. School of Public Health, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China 2. Jinchuan Nickel and Cobalt Industrial Health Institute, Jinchang 737103, China 3. Provincial Key Laboratory of Pre-clinical Study of New Pharmaceuticals, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China

Received 3 May 2016 accepted 26 June 2016

To investigate DNA damage in SD rat peripheral blood lymphocytes under different doses of nickel carbonyl, SD rats were exposed through inhalation of 20, 135, 250 mg·m-3nickel carbonyl (Ni(CO)4) for 30 minutes. Rats poisoned by 250 mg·m-3chlorine gas served as the positive control group, and healthy SD rats served as the control group. After 1 day (d), 2 d, 3 d, and 7 d inhalation, bone marrow samples were taken from the rats. Single cell gel eletrophoresis (SCGE) was used to measure comet tail moment, and Olive tail moment was measured from the comet image, to determine lymphocytes DNA damage. Lymphocytes DNA damage increased with increasing Ni(CO)4dose. The significant differences were observed in different doses and times (P<0.05). Extreme DNA damage was found after 3 d and decreased after 7 d in Ni(CO)4groups. The damage increased with inhalation time. Extreme DNA damage was found at the highest dose and 3 d exposure. Acute nickel carbonyl could induce lymphocyte DNA damage in dose-response, time-effect and interaction effect manner.

nickel carbonyl; rat; lymphocyte; DNA damage; dose-response relationship; time- effect relationship; interaction effect relationship

金川集團(tuán)公司與蘭州大學(xué)產(chǎn)學(xué)研合作項目

蘆永斌(1989-)，男，碩士，研究方向?yàn)榱餍胁∨c衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)，E-mail: luyb14@lzu.edu.cn

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: chengn@lzu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160503003

2016-05-03 錄用日期：2016-06-26

1673-5897(2016)6-277-05

X171.5

A

程寧(1959—)，男，教授，研究方向?yàn)榘踩栽u價。

蘆永斌, 李宇, 馬國煜, 等. 羰基鎳急性染毒致大鼠淋巴細(xì)胞DNA損傷的劑量時間效應(yīng)[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2016, 11(6): 277-281

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