趙亞學(xué)，李宇，馬國(guó)煜，劉靜，王秋英，張小培，宣小強(qiáng)，閆銘鋒，吳喜江，程寧

1. 蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)研究所，蘭州 730000 2. 蘭州大學(xué)甘肅省新藥臨床前研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000 3. 金川集團(tuán)股份有限公司職工醫(yī)院，金昌 737103

羰基鎳急性中毒對(duì)大鼠骨髓細(xì)胞的DNA損傷

趙亞學(xué)1,2，李宇1，馬國(guó)煜3，劉靜1，王秋英3，張小培1，宣小強(qiáng)3，閆銘鋒1，吳喜江3，程寧2,*

1. 蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)研究所，蘭州 730000 2. 蘭州大學(xué)甘肅省新藥臨床前研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000 3. 金川集團(tuán)股份有限公司職工醫(yī)院，金昌 737103

通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察不同劑量羰基鎳對(duì)大鼠骨髓細(xì)胞DNA損傷程度。采用SD大鼠，以135 mg·m-3和250 mg·m-3羰基鎳為染毒組，250 mg·m-3氯氣為陽性對(duì)照組，靜態(tài)方式染毒30 min。未染毒組為正常對(duì)照組，大鼠染毒后1、2、3和7 d分別采集樣本。采用單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)每組大鼠骨髓細(xì)胞DNA的損傷程度。彗星尾長(zhǎng)和Olive尾矩2個(gè)指標(biāo)的分析結(jié)果表明，大鼠骨髓細(xì)胞DNA損傷程度隨著羰基鎳染毒劑量的增加而增加，在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)各劑量組間均有顯著差異(P<0.05)且隨時(shí)間的變化有一定的規(guī)律，損傷程度在3 d時(shí)達(dá)到最大，而后緩慢下降。羰基鎳急性中毒對(duì)大鼠骨髓細(xì)胞DNA有一定的損傷，且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，各劑量組損傷程度有一定的時(shí)間效應(yīng)規(guī)律。

羰基鎳；SD大鼠；DNA損傷；單細(xì)胞凝膠電泳；骨髓細(xì)胞

羰基鎳(nickel carbonyl)是由鎳和一氧化碳在一定壓力條件下反應(yīng)生成的一種金屬化合物，進(jìn)入體內(nèi)的羰基鎳與蛋白質(zhì)和核酸結(jié)合，隨血流分布到全身，可導(dǎo)致肺、肝、腦等的損傷[1]。羰基鎳致器官、組織、細(xì)胞等損傷的研究較多，我們前期研究發(fā)現(xiàn)羰基鎳可導(dǎo)致肺組織和肝組織的氧化損傷，降低肺組織和肝組織SOD活力，對(duì)肺臟和肝臟產(chǎn)生毒性作用[2-4]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)羰基鎳可誘導(dǎo)腦組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)而產(chǎn)生神經(jīng)毒性[5]。Armit[6]觀察到了人在羰基鎳急性中毒后出現(xiàn)呼吸困難、眼花、嘔吐，隨后幾天出現(xiàn)發(fā)紺、咳嗽、血痰、脈搏加快、神智錯(cuò)亂等癥狀，嚴(yán)重者甚至死亡。但以往研究中對(duì)羰基鎳致骨髓細(xì)胞損傷的研究較少，本研究旨在對(duì)羰基鎳骨髓細(xì)胞DNA的損傷程度進(jìn)行研究，揭示羰基鎳對(duì)大鼠骨髓細(xì)胞DNA的損傷作用規(guī)律。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 動(dòng)物分組與染毒

由西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的體重在180～220 g之間的雌雄各半的SD大鼠。按照性別隨機(jī)分成4個(gè)組，1個(gè)正常對(duì)照組(8只)以及3個(gè)染毒組(40只/組)分別定義為A、B、C、D組。萬級(jí)潔凈動(dòng)物房分籠飼養(yǎng)，SPF級(jí)大鼠飼料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司)喂養(yǎng)，自由采食及飲水。

135 mg·m-3、250 mg·m-3的羰基鎳和250 mg·m-3的氯氣靜態(tài)方式染毒30 min。4組動(dòng)物染毒后分別于1、2、3和7 d這4個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)處死2、10、10、10只，取材。

1.2 單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

按常規(guī)單細(xì)胞凝膠電泳(single-cell gel electrophoresis, SCGE)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行操作和分析。運(yùn)用CASP彗星分析軟件測(cè)量所選骨髓細(xì)胞的彗星尾長(zhǎng)(comet tail length)和Olive尾矩(Olive tail moment)，將彗星尾長(zhǎng)和Olive尾矩作為實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)，具體儀器及操作過程詳見文獻(xiàn)[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)于不符合正態(tài)要求的數(shù)據(jù)經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行分析，多組樣本均數(shù)之間的比較采用方差分析，多組樣本均數(shù)間的多重比較采用LSD法，劑量-反應(yīng)關(guān)系采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法，對(duì)于相關(guān)性的組別做線性或曲線回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果(Results)

2.1 羰基鎳急性染毒后大鼠骨髓細(xì)胞彗星尾長(zhǎng)和Olive尾矩的變化趨勢(shì)

從表1可以看出，各個(gè)時(shí)間段不同羰基鎳染毒劑量組間彗星尾長(zhǎng)和Olive尾矩隨著染毒劑量的增加而增加。各染毒劑量組在3 d時(shí)尾長(zhǎng)和Olive尾矩達(dá)到最大，在7 d時(shí)均開始下降。經(jīng)LSD法多重比較可以看出，未染毒組與3個(gè)染毒組的尾長(zhǎng)和Olive尾矩均數(shù)之間均有差異(P<0.05)。氯氣組在染毒后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的彗星尾長(zhǎng)和Olive尾矩也明顯高于未染毒組，且最大損傷程度出現(xiàn)在染毒后2 d，但最大損傷程度小于羰基鎳高劑量組的最大損傷程度。

分組Groups染毒劑量Exposuredoses1d2d3d7d彗星尾長(zhǎng)ComettaillengthA03.58±1.33#3.58±1.33#3.58±1.33#3.58±1.33#B135mg?m-3nickelcarbonyl21.62±1.76*#20.64±1.64*36.47±1.60*#8.49±1.48*C250mg?m-3nickelcarbonyl26.90±1.59*#23.17±1.72*31.55±1.31*#7.60±1.57*D250mg?m-3chlorine16.97±1.33*21.91±1.32*21.00±9.50*9.04±1.63*Olive尾矩OlivetailmomentA00.173±2.375#0.173±2.375#0.173±2.375#0.173±2.375#B135mg?m-3nickelcarbonyl2.536±1.784*#2.485±1.939*5.995±1.658*#0.917±1.680*C250mg?m-3nickelcarbonyl3.538±1.843*#2.540±1.800*5.887±1.533*#0.809±1.744*D250mg?m-3chlorine2.646±5.292*3.544±1.435*2.430±2.091*1.036±1.768*

注：* 為經(jīng)LSD法多重比較；同時(shí)間點(diǎn)，與A組比較，P<0.05；#為與D組比較，P<0.05。

Note: * By using the line segment detector (LSD) method; compared with A, at the same time P<0.05; # compared with D, P<0.05.

2.2 相同時(shí)間點(diǎn)不同劑量組間及相同劑量組不同時(shí)間點(diǎn)的相關(guān)性及回歸分析

經(jīng)過Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)同一時(shí)間不同劑量組之間，同一劑量組不同時(shí)間的各組均有相關(guān)性(表2)，從表中還可以看出同一時(shí)間點(diǎn)不同劑量組之間除了第7天時(shí)的Olive尾矩之外幾乎都呈線性相關(guān)，即隨著劑量的增加，彗星尾長(zhǎng)、Olive尾矩都在增加，存在著明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。第7天時(shí)回歸方程呈現(xiàn)曲線相關(guān)，從方程看出，在第7天時(shí)Olive尾矩不再隨著劑量的增加而增加，而是出現(xiàn)緩慢下降狀態(tài)，這可能是由于羰基鎳對(duì)骨髓DNA的損傷劑量達(dá)到一定程度后，機(jī)體開始將外源化學(xué)物質(zhì)排泄出體外，不會(huì)再加重?fù)p傷效應(yīng)，故Olive尾矩不再增長(zhǎng)。表中還可看出同一劑量組不同時(shí)間點(diǎn)之間呈現(xiàn)曲線相關(guān)，曲線回歸方程表明，羰基鎳染毒各個(gè)劑量組中DNA的損傷在染毒3 d時(shí)損傷程度均達(dá)到最大，而在7 d時(shí)損傷程度都逐漸變小，這可能因?yàn)橥庠椿瘜W(xué)物質(zhì)排出體外，濃度減少。

3 討論(Discussion)

羰基鎳是鎳化合物中急性毒性最強(qiáng)的一種，短時(shí)間大劑量吸入可累及到多種臟器及器官，包括對(duì)肝臟、肺臟、心臟及腦組織的損傷。以往對(duì)羰基鎳致動(dòng)物或人體損傷的研究較多，但其制毒的細(xì)胞及分子機(jī)制仍不完全清楚。有研究表明鎳化合物可引起機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生超氧陰離子自由基，導(dǎo)致細(xì)胞突變及腫瘤的發(fā)生[8-9]。還有研究得出羰基鎳是通過抑制Ca2+-Mg2+ATP酶和Na+-K+ATP酶的活性，導(dǎo)致組織/器官細(xì)胞漿內(nèi)游離鈣增多引起組織細(xì)胞損傷，影響肝肺等臟器功能[2-3]。Armit[6]的研究顯示羰基鎳吸入后在呼吸道表面進(jìn)入血液或淋巴液，在接觸到水、血液等體液的情況下如果有氧氣或者二氧化碳的存在，分解產(chǎn)生碳酸鹽化合物，形成沉淀，分布在肺部、大腦、脊髓束、心肌、棕色脂肪、腎上腺皮質(zhì)等處，刺激神經(jīng)節(jié)和腎上腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞引起毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的退變，引起血管壁脂肪變性和出血，同時(shí)機(jī)體也會(huì)通過腎臟和腸道將其排出體外。Sunderman等[10]在對(duì)懷孕倉鼠進(jìn)行研究的過程中發(fā)現(xiàn)倉鼠吸入一定濃度羰基鎳后產(chǎn)生胎盤毒性對(duì)后代有致畸效應(yīng)。骨髓是維持機(jī)體生命和免疫力的重要器官，骨髓細(xì)胞DNA的損傷嚴(yán)重影響機(jī)體的正常運(yùn)行。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠吸入不同濃度羰基鎳后各時(shí)間點(diǎn)隨羰基鎳濃度的增加，DNA斷鏈片斷也增多，尾長(zhǎng)增加，呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，這種關(guān)系估計(jì)是隨著羰基鎳濃度的升高，DNA的修復(fù)功能不能與越來越嚴(yán)重的損傷相平衡，從而使DNA的損傷加重所致。但Olive尾矩在一定時(shí)間后不再隨著劑量的升高而加重，這可能是大劑量的羰基鎳進(jìn)入體內(nèi)對(duì)機(jī)體的損傷嚴(yán)重，機(jī)體調(diào)動(dòng)排泄系統(tǒng)加大毒物排泄，一定時(shí)間后毒物在體內(nèi)的分布減少所致。相同劑量，不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量的尾長(zhǎng)和Olive尾矩變化也有一定規(guī)律，在染毒后3 d時(shí)，DNA的損傷程度均達(dá)到最重，在7 d時(shí)開始下降。此結(jié)果與Barnes和Denz[11]的研究結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)羰基鎳急性中毒后，死亡病例一般發(fā)生在前3 d，存活者中毒癥狀也以前3 d最為明顯，7 d后癥狀逐漸減輕。氯氣染毒組各時(shí)段骨髓細(xì)胞DNA的損傷程度均低于羰基鎳高劑量組，這說明相同劑量羰基鎳致大鼠骨髓細(xì)胞DNA的損傷程度比氯氣嚴(yán)重。

表2 同一時(shí)間不同劑量組間和同一劑量不同時(shí)間點(diǎn)間相關(guān)性分析及回歸方程Table 2 The correlation analysis and regression equations among different doses and different times

注：* 相關(guān)性分析P<0.05，r為相關(guān)系數(shù)，Y為回歸方程。

Note: * P<0.05 by the correlational analysis, r stands for correlation coefficient, Y stands for regression equation.

外周血中的各種細(xì)胞均由骨髓中的始祖細(xì)胞分化而來，處于不同發(fā)育、分化階段的血細(xì)胞對(duì)外源化學(xué)物敏感性較高，因此，血液系統(tǒng)比其他身體器官更容易受到外源化學(xué)物的損傷。本研究結(jié)果表明，羰基鎳對(duì)大鼠骨髓細(xì)胞DNA損傷嚴(yán)重，具有骨髓毒性，且損傷程度與羰基鎳存在時(shí)間-效應(yīng)規(guī)律和劑量-效應(yīng)關(guān)系。

致謝：感謝金川公司鎳鈷工業(yè)衛(wèi)生研究所祁光偉、徐東偉、黃克英在動(dòng)物飼養(yǎng)方面的幫助！感謝蘭州大學(xué)張榮強(qiáng)、蘆永斌、常曉宇在樣本處理和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)上的幫助！

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◆

DNA Damage in Bone Marrow Cells of Rat Acutely Poisoned with Nickel Carbonyl

Zhao Yaxue1,2, Li Yu1, Ma Guoyu3, Liu Jing1, Wang Qiuying3, Zhang Xiaopei1, Xuan Xiaoqiang3, Yan Mingfeng1, Wu Xijiang3, Cheng Ning2,*

1. Institute of Epidemiology and Statistics, School of Public Health, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China 2. Provencial Key Preclinical Study Laboratory of New Drug, Lanzhou 730000, China 3. Staff Hospital, Jinchuan Group Co., Ltd., Jinchang 737103, China

Received 23 March 2016 accepted 23 May 2016

In order to study the DNA damage induced by nickel carbonyl in rat bone marrow cells, 128 healthy SD rats were divided into four groups to conduct 30 min static inhalation experiments. SD rats in the two exposure groups were exposed to a nickel carbonyl concentration of 135 mg·m-3and 250 mg·m-3, and the rats were exposed to 250 mg·m-3Cl2in the positive control group. 8 unpoisoned rats served as the blank control. After rats inhaled for 1, 2, 3 and 7 d, bone marrow samples were taken. SCGE was used to detect the acute injury extent. The comet tail length and Olive tail moment in the comet image were measured. In nickel carbonyl groups, extreme DNA damage was found after 3 d, and the DNA damage was decrease after 7 d. Higher nickel carbonyl dose caused greater DNA damage. It is indicated that acute nickel carbonyl exposure caused DNA damage in the bone marrow cells of the SD rats, with a dose-response and time-response relationship.

nickel carbonyl; SD rats; DNA damage; single-cell gel electrophoresis; bone marrow cell

金川集團(tuán)股份有限公司與蘭州大學(xué)產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目(金科綜2009-12和2011-18)

趙亞學(xué)(1990-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹亟饘僦卸痉乐危珽-mail: yxzhao14@lzu.edu.cn

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: chengn@lzu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160323061

2016-03-23 錄用日期：2016-05-23

1673-5897(2016)6-230-04

X171.5

A

程寧(1959)，男，教授，研究方向?yàn)榘踩栽u(píng)價(jià)。

趙亞學(xué), 李宇, 馬國(guó)煜, 等. 羰基鎳急性中毒對(duì)大鼠骨髓細(xì)胞的DNA損傷[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2016, 11(6): 230-233

Zhao Y X, Li Y, Ma G Y, et al. DNA damage in bone marrow cells of rat acutely poisoned with nickel carbonyl [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(6): 230-233 (in Chinese)