韋青　王晰程　綜述　沈琳　審校

北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院北京腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所消化道腫瘤多學(xué)科協(xié)作組/惡性腫瘤發(fā)病機制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點實驗室，北京100142

二氫嘧啶脫氫酶與氟尿嘧啶類藥物不良反應(yīng)及療效相關(guān)性

韋青王晰程綜述沈琳#審校

北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院北京腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所消化道腫瘤多學(xué)科協(xié)作組/惡性腫瘤發(fā)病機制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點實驗室，北京100142

氟尿嘧啶及其衍生物是常用的抗腫瘤藥物。二氫嘧啶脫氫酶（DPD）是嘧啶代謝中的起始酶和限速酶，在氟尿嘧啶類藥物的代謝中起關(guān)鍵作用，其活性與氟尿嘧啶類藥物的不良反應(yīng)和療效相關(guān)。DPD的酶活性個體差異很大，部分和完全缺陷能導(dǎo)致嚴(yán)重甚至致命的藥物不良反應(yīng)。近年來，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，對DPD的研究也從酶學(xué)水平上升至基因水平。本文回顧了DPD的分布、功能和檢測方法，及其基因多態(tài)性與氟尿嘧啶類藥物相關(guān)性。

DPD；氟尿嘧啶類藥物；DPYD基因

氟尿嘧啶類藥物在抗腫瘤治療中應(yīng)用廣泛，包括5-氟尿嘧啶（5-Fu）及其衍生物，這類藥物在多種惡性腫瘤中得到廣泛應(yīng)用。臨床實踐中我們經(jīng)常發(fā)現(xiàn)，盡管不同患者接受相同劑量的5-Fu類藥物治療，卻表現(xiàn)出來不同程度的不良反應(yīng)和療效。體內(nèi)80%的5-Fu由二氫嘧啶脫氫酶（dihydropyrimidine dehydrogenase，DPD）代謝［1］，如果DPD缺陷則會導(dǎo)致5-Fu代謝物在體內(nèi)的毒性蓄積。近年來，氟尿嘧啶類制劑的種類越來越多，例如替加氟、卡培他濱、替吉奧（S-1）等。S-1由替加氟（FT）、吉美嘧啶（CDHP）、奧替拉西鉀（Oxo）3種藥物構(gòu)成。CDHP能夠抑制在DPD作用下從FT釋放出來的5-Fu的分解代謝，有助于長時間控制血中和腫瘤組織中5-Fu的有效濃度。故如果患者存在DPD缺陷，使用S-1則會出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥。多項研究顯示DPD在決定氟尿嘧啶藥物的不良反應(yīng)及有效性方面起很重要的作用，DPD活性的個體差異是決定不良反應(yīng)和療效差異的最重要因素之一。以往對于DPD的研究往往停留在酶學(xué)水平，但是隨著測序技術(shù)的發(fā)展，對其研究也上升至基因組學(xué)水平。本文將對DPD的功能、分布及檢測方法，及其基因與氟尿嘧啶類藥物的相關(guān)性進(jìn)行綜述。

1　DPD的結(jié)構(gòu)及功能

DPD在人體大部分組織中廣泛分布，在肝臟中活性最高［2］。另外，在腫瘤組織中也存在DPD。DPD在外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中呈正態(tài)分布，與肝臟中的活性正相關(guān)［3］。DPYD基因編碼DPD，定位于人類染色體1p22，包括23個基因（共950 Kb）。DPD是由兩個相同亞單位構(gòu)成的同型二聚體蛋白，每個亞單位由1025個氨基酸組成［4-5］。酶動力學(xué)研究表明DPD通過非經(jīng)典的“乒乓”機制（ping-pong mechanism）發(fā)揮作用［6］。DPD的蛋白結(jié)構(gòu)的解析為闡述DPD的基因突變引起的氨基酸序列改變對活性的影響提供了理論基礎(chǔ)。

2　DPD缺陷的臨床表現(xiàn)

DPD缺陷表現(xiàn)為腫瘤患者接受氟尿嘧啶類藥物治療后出現(xiàn)嚴(yán)重甚至是致命性的不良反應(yīng)。1985年，Tuchman等［7］報道了第1例乳腺癌患者接受常規(guī)5-Fu化療后出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉、骨髓抑制、神經(jīng)毒性、意識混亂等不良反應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)血液及尿液中的嘧啶濃度異常升高，首次提出是因為DPD缺陷導(dǎo)致的5-Fu代謝障礙。接下來后續(xù)更多的研究報道了5-Fu治療后因DPD缺陷或表達(dá)不足而出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，主要表現(xiàn)為胃腸道反應(yīng)（黏膜炎）及骨髓抑制。

3　DPD缺陷的人群分布特征

因為5-Fu藥物的廣泛應(yīng)用，DPD缺陷或不足導(dǎo)致的5-Fu治療后嚴(yán)重不良反應(yīng)日趨受到臨床重視。納入1200例患者的Meta分析提示大于30%的患者在接受5-Fu化療后出現(xiàn)藥物相關(guān)不良反應(yīng)［8］。DPD的人種差異被廣泛報道［9］。既往的酶學(xué)研究顯示，高加索人種中DPD活性部分缺陷出現(xiàn)概率為3%～5%，完全缺陷的概率為0.1%［10］；亞洲人群中DPD部分缺陷的比例為0～0.7%［10-11］；非裔美國人中這一比例為8%［12］。

4　DPD分析的方法學(xué)

目前DPD活性的判定主要有3類研究方法：評估DPD活性、DPYD基因改變、編碼DPD的mRNA改變。每種方法均有其利弊。

4.1DPD活性測定

雖然大部分DPD存在于肝臟中，但是其他組織中的DPD也在氟尿嘧啶的代謝中起重要作用。肝臟中與外周血單個核細(xì)胞（PBMC）中的DPD活性具有相關(guān)性［3］。因為雜合性的病理性突變部分所致的DPD缺陷患者PBMC中的平均DPD活性大約是正常人群的48%［13］。可用放射活性物質(zhì)標(biāo)記的5-Fu或者胸腺嘧啶去孵育分離的淋巴細(xì)胞，然后通過高壓液相色譜法檢測降解產(chǎn)物來檢測DPD的活性［14-16］。但PBMC中的DPD活性是否可直接反映人體中5-Fu的清除率仍存在一定爭議。加上這種分析方式需要大量的試驗室工作和不菲的價格，故在臨床很少采用該技術(shù)。

2004年，Mattison等［17］報道了另一個非侵入性的檢測方法。在口服2-13C-尿嘧啶后，由于DPD參與降解2-13C-尿嘧啶，故產(chǎn)生代謝產(chǎn)物13CO2。通過IR光譜儀方法檢測呼出氣體中13CO2濃度前后的變化可以分析DPD活性。研究者認(rèn)為13CO2濃度的降低與部分或者完全的DPD缺陷相關(guān)。但是2-13C-尿嘧啶及IR光譜儀設(shè)備并不是很好獲取，故限制了這一方法的臨床推廣。

此外，由于直接對DPD檢測方法都未在臨床廣泛應(yīng)用，因此目前對DPD活性閾值也未達(dá)成共識。究竟DPD值低于多少被認(rèn)為是DPD活性缺陷或不足，哪些患者需要謹(jǐn)慎給予低劑量5-Fu或采用其他藥物替代治療尚未統(tǒng)一。早期的研究根據(jù)群體DPD活性分布，將95%參考值下限作為DPD活性缺陷的臨界值，后來有研究者提出，將DPD正常活性均值的70%作為DPD活性缺陷的臨界值，并發(fā)現(xiàn)39%～61%出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)的患者DPD活性低于此臨界值［18］，但是均沒有達(dá)到統(tǒng)一。

4.2DPYD基因的多態(tài)性與酶活性的關(guān)系

DPD由DPYD基因編碼，核苷酸的變異可能導(dǎo)致DPD的結(jié)構(gòu)及活性的變化。相比于酶活性的檢測，DPD的基因檢測時間短，實驗操作性強。故DPYD基因多態(tài)性與DPD活性的研究也越來越受到臨床醫(yī)生的關(guān)注。已有超過100個突變位點被報道及研究［19］。較明確的與DPD缺陷相關(guān)的突變有以下3個單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphisms，SNP）：DPYD*2A（IVS14+1G＞A，c.1905+1G＞A，rs3918290），c.2846A＞T（D949V，rs67376798）和DPYD*13（c.1679T＞G，I560S，rs55886062）［20］。

目前發(fā)現(xiàn)最為常見的導(dǎo)致5-Fu嚴(yán)重不良反應(yīng)的基因突變位點為DPYD*2A（IVS14+1G＞A，c.1905+1G＞A，rs3918290），即14內(nèi)含子5′剪切位點處堿基GT突變?yōu)锳T，可導(dǎo)致DPD失活［21-22］，與另外2個SNP相比更為常見，這個位點突變在非洲裔美國人及高加索人種中的頻率分別為0.1%及1.0%［19，23-25］。體外試驗顯示若發(fā)生純合突變，則會導(dǎo)致DPD活性的完全失活［26］。而且，多項臨床試驗也證明DPYD*2A（IVS14+1G＞A，c.1905+1G＞A，rs3918290）攜帶者更易發(fā)生3級以上的氟尿嘧啶類藥物相關(guān)不良反應(yīng)。2015年發(fā)表在臨床腫瘤學(xué)雜志上的一項前瞻性研究，檢測了2038例接受氟尿嘧啶類為基礎(chǔ)方案化療患者的DPYD*2A（IVS14+ 1G＞A，c.1905+1G＞A，rs3918290），其中22例（1.1%）為雜合突變，并進(jìn)行減量治療。突變攜帶者的中位劑量強度是48%（17%～91%）。與歷史對照，3級不良反應(yīng)的發(fā)生率從73%降至28%；藥物不良反應(yīng)導(dǎo)致的死亡率從10%降至0［27］。

c.2846A＞T（D949V，rs67376798）是在2000年被首先報道的，其變異導(dǎo)致DPD結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而干擾輔因子結(jié)合或者電子傳送。在非裔美國人及高加索人種中的突變頻率分別為0.1%、1.1%［19，23-24，28］。體外試驗證明c.2846A＞T（D949V，rs67376798）純合突變使酶活性降為59%［26］。雖然相關(guān)研究沒有DPYD*2A多，但仍然有多項臨床研究及Meta分析顯示c.2846A＞T（D949V，rs67376798）與氟尿嘧啶類藥物相關(guān)不良反應(yīng)有關(guān)，并且需要進(jìn)行藥物減量。Rosmarin等［29］的研究發(fā)現(xiàn)c.2846A＞T（D949V，rs67376798）與卡培他濱3級以上相關(guān)不良反應(yīng)的比值比為9.35（P=0.0043）。

DPYD*13（c.1679T＞G，I560S，rs55886062）在高加索人種中的突變頻率只有0.07%～0.1%［23-24］，與前2個位點相比，發(fā)生頻率最低，而且只在酶活性下降的人群中出現(xiàn)，酶活性正常的人群未發(fā)現(xiàn)［30］。體外試驗證明DPYD*13（c.1679T＞G，I560S，rs55886062）純合突變使酶活性下降75%，幾乎導(dǎo)致了酶活性的完全失活［26］。DPYD*13（c.1679T＞G，I560S，rs55886062）突變的患者在多個臨床試驗中顯示過嚴(yán)重的藥物不良反應(yīng)。

以上3個位點是目前確認(rèn)的與氟尿嘧啶類藥物不良反應(yīng)相關(guān)的突變位點。c.496A＞G的突變頻率比DPYD*2A、c.2846A＞T、DPYD*13都要高，但是與氟尿嘧啶不良反應(yīng)的相關(guān)性沒有得到證實。一項納入64例接受奧沙利鉑+氟尿嘧啶+伊立替康3種藥物治療的腸癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，19%的患者有c.496A＞G突變，且與3～4級不良反應(yīng)相關(guān)（OR=4.93，95%CI為1.29～18.87，P=0.021）［31］。

上文提過，DPD活性可能是由于DPYD基因人種差異導(dǎo)致，SNP在亞洲人群的情況日本及韓國的3項研究均沒有檢測到DPYD*2A（IVS14+1G＞A，c.1905+1G＞A，rs3918290）位點的突變［32-34］。來自我國的研究統(tǒng)計了DPYD基因SNP在122例漢族人群中的突變情況，也沒有檢測到DPYD*2A（IVS14+ 1G＞A，c.1905+1G＞A，rs3918290）的突變［35］。意味著該位點可能在亞洲人中與DPD活性關(guān)系較小。相反的，2015年在亞洲進(jìn)行的一項納入764例患者的Meta分析顯示DPYD*5在中國、韓國、泰國人群中的突變頻率能達(dá)到＞20%，85T＞C（DPYD*9A）在日本患者和韓國患者中的突變頻率分別為3.7%及2.5%，中國患者高達(dá)7.04%，納入的研究都報道了5-FU為基礎(chǔ)的嚴(yán)重化療不良反應(yīng)（≥2級）可能與這些常見的多態(tài)性位點相關(guān)，化療不良反應(yīng)主要集中在胃炎、骨髓抑制、腹瀉，也有心律失常的報道［36］。

鑒于DPYD基因突變與毒性的關(guān)系，美國CPIC推薦在DPYD*2A（IVS14+1G＞A，c.1905+1G＞A，rs3918290），DPYD*13（c.1679T＞G，I560S，rs55886 062）和c.2846A＞T（D949V，rs67376798）雜合突變的患者中起始氟尿嘧啶類藥物的治療時需減量至少50%，然后根據(jù)不良反應(yīng)及藥動學(xué)調(diào)整劑量。若是純合突變，則選擇別的藥物治療［37］。近期荷蘭科學(xué)家建立了一套評分系統(tǒng)，根據(jù)PCR方法檢測出DPYD*2A（IVS14+1G＞A，c.1905+1G＞A，rs3918290），c.2846A＞T（D949V，rs67376798），DPYD*13（c.1679T＞G，I560S，rs55886062）或者c.1236G＞A/HapB3的突變狀態(tài)，每種突變賦予不同的比重，根據(jù)總值來判斷是否需要減量及具體減量多少［38］。

4.3DPYD基因研究困境及展望

除了以上3個位點，還有許多其他位點突變尚需進(jìn)一步研究。最近，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)有DPD活性下降的非洲裔美國人中26%存在rs115232898位點的突變，導(dǎo)致酶活性下降了46%［39］。2015年柳葉刀雜志發(fā)表了一項Meta分析，列入了8項臨床研究中的7365例患者，發(fā)現(xiàn)c.1236G＞A/HapB3與氟尿嘧啶藥物相關(guān)不良反應(yīng)顯著相關(guān)（矯正RR為1.59，95%CI為1.29～1.97，P＜0.0001）。并且細(xì)化到不良反應(yīng)的類型上，發(fā)現(xiàn)c.1236G＞A/HapB3與胃腸道不良反應(yīng)及血液學(xué)不良反應(yīng)相關(guān)，但是與手足反應(yīng)無關(guān)［40］。

但是存在這些突變并不意味著一定會出現(xiàn)酶活性的下降及治療不良反應(yīng)的發(fā)生。Morel等［41］進(jìn)行了一項列入487例患者的研究，均接受了基于5-Fu的治療，并檢測了22個DYPD基因的SNP，包括IVS14+1G＞A，2846A＞T，1679T＞G等。發(fā)現(xiàn)DPYD*2A及c.2846A＞T突變與治療不良反應(yīng)相關(guān)。300例患者并沒有單核苷酸多態(tài)性，其中20例患者出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)。187例存在SNP的患者中，僅24例出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)。這意味著除了DPYD基因以外，還有些其他因素與5-Fu藥物不良反應(yīng)相關(guān)。這包括5-Fu代謝參與的其他多種酶，例如胸苷酸合成酶（thymidine phosphorylase，TS）、乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（orotate phosphoribosyltransferase，OPRT）等。這些酶若異常表達(dá)也可能會影響5-Fu的不良反應(yīng)和療效［42］。此外DYPD的SNP超過100個，臨床上是否應(yīng)該擴大SNP的檢測來提高敏感性和特異性也尚無定論。但是，目前隨著二代測序等技術(shù)的發(fā)展，短時間內(nèi)可同時檢測多個位點，能幫助我們高效、迅速地獲取突變結(jié)果，這一技術(shù)已經(jīng)在DPYD基因檢測中得以應(yīng)用［19］。發(fā)表在2014年GUT雜志上的一項研究表明，在968例英國腸癌患者中進(jìn)行二代測序，發(fā)現(xiàn)2個常見的多態(tài)性位點與卡培他濱的不良反應(yīng)有關(guān)，分別是rs12132152及rs12022243。特別是rs12132152與手足綜合征的發(fā)生密切相關(guān)。在1個患者中發(fā)現(xiàn)了少見的p.Ala551Thr突變，通過功能預(yù)測，證實其與卡培他濱的不良反應(yīng)有關(guān)［43］。

因為DNA突變會導(dǎo)致mRNA水平或者pre-RNA的異常剪切，故有人猜想DPD活性還可能與DYPD mRNA表達(dá)相關(guān)?？赏ㄟ^實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測血液中的DPYD mRNA。一項納入157例患者的研究顯示DPD活性與血液中的DPYD mRNA相關(guān)［44］。除了mRNA水平的改變，還有研究認(rèn)為DPD的活性在表觀遺傳學(xué)上受到調(diào)節(jié)，即DPYD啟動子的甲基化以及miRNA對甲基化過程的調(diào)節(jié)，在這部分上還有爭議，需要進(jìn)一步探索［45-46］。

5　DPD與氟尿嘧啶類藥物療效的關(guān)系

1999年，Ishikawa等［47］和Kirihara等［48］報道，體內(nèi)腫瘤細(xì)胞DPYD基因表達(dá)及活性與5-Fu抗腫瘤敏感性有關(guān)。高表達(dá)的DPYD mRNA和活性水平可能會導(dǎo)致5-Fu藥物耐藥。對于大于60種人類腫瘤細(xì)胞系研究顯示DPYD mRNA表達(dá)、DPD活性與5-Fu治療反應(yīng)率呈負(fù)相關(guān)［49-50］。另外，DPYD mRNA表達(dá)低、DPD活性低移植瘤模型也呈現(xiàn)對5-Fu治療相對敏感［47］，這都證明細(xì)胞內(nèi)DPD的水平是5-Fu治療的重要預(yù)測因子。一項前瞻性的臨床研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸術(shù)后接受5-Fu輔助治療的68例患者中，腫瘤組織中DPD活性高與較差DFS及OS相關(guān)［51］。

另外，有研究認(rèn)為5-Fu類藥物的不良反應(yīng)越高，療效越佳。一項奧地利的研究顯示227例接受卡培他濱+貝伐珠單抗治療的乳腺癌患者，出現(xiàn)手足綜合征后進(jìn)展或者死亡風(fēng)險可降低44%，死亡風(fēng)險降低56%。手足綜合征越重，對OS的影響越大［52］。這是否與DPD活性相關(guān)值得進(jìn)一步探索。

6　小結(jié)

DPD在5-Fu藥物治療中起了重要的作用，檢測及評估DPD的活性是開始氟尿嘧啶類藥物治療前重要的步驟，能提高有效性和避免嚴(yán)重不良反應(yīng)。DPD在腫瘤組織中的表達(dá)情況與療效關(guān)系對于指導(dǎo)臨床用藥具有一定價值。在蛋白或者基因水平前瞻性地檢測DPD活性或者DPYD基因型是個體化腫瘤治療時代的重要方向。

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R730.2

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.07.02

2016-01-22）

（corresponding author），郵箱：lin100@medmail.com.cn