吳　多，周　艷，宋傲群，劉　瀏，史筱靚，姜孝成

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 中國 長沙　410081)

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利用靶擬態(tài)合成和Gateway技術(shù)構(gòu)建水稻miR164c沉默突變體

吳多**，周艷**，宋傲群，劉瀏，史筱靚，姜孝成*

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 中國 長沙410081)

摘要以水稻基因組DNA為模板， PCR擴增得到與miR399互補的OsMIM399后，改造成與miR164c互補的靶擬態(tài)序列OsMIM164c，經(jīng)測序分析后連入pGWC載體，獲得入門載體pGWC-OsMIM164c；利用Gateway技術(shù)，將入門載體pGWC-OsMIM164c經(jīng)LR反應(yīng)連接到植物表達載體GCS中，獲得GCS-OsMIM164c表達載體，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)將該表達載體導(dǎo)入水稻品種Kasalath的愈傷組織中，組織培養(yǎng)后獲得再生植株并進行目的基因的PCR鑒定， Real Time PCR方法檢測陽性突變體植株中miR164c的表達量. 研究結(jié)果表明，miR164c在突變體植株中的表達量顯著低于野生型，說明miR164c沉默突變體構(gòu)建成功.

關(guān)鍵詞靶擬態(tài); Gateway技術(shù); miR164c; 沉默突變體; 水稻

Construction of Silence Mutant ofmiR164cinOryzaSativaL.by Target Mimicry and Gateway Technology

WUDuo**,ZHOUYan**,SONGAo-qun,LIULiu,SHIXiao-liang,JIANGXiao-cheng*

(College of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha 410081, China)

AbstractGenomic DNA of rice (Variety ZR02) was used as template to amplifyOsMIM399 by PCR which has a region complementary tomiR399, andOsMIM399 was reconstructed into the target mimicryOsMIM164cwith a region complementary tomiR164c. After sequencing, the right fragment was ligated into pGWC vector to construct pGWC-OsMIM164c, andOsMIM164cwas then transferred to the plant expression vector GCS to prepare GCS-OsMIM164cthrough LR reaction. GCS-OsMIM164cwas finally transformed into rice Kasalath calli by the improved Agrobacterium-mediated method and regenerated plantlets were obtained by tissue culture technique. After target geneOsMIM164cwas identified by PCR, the expression ofmiR164cin positive mutants was analyzed by RT qPCR. The results showed that the expression ofmiR164cexhibited a distinct reduction in mutant plants compared to the wild type, indicating that themiR164csilence mutant has successfully been prepared.

Key wordstarget mimicry; gateway technology;miR164c; silence mutant; rice

microRNA(miRNA)是一類長度為20~24 nt的非編碼小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平對靶mRNA進行剪切或抑制其翻譯，繼而調(diào)控靶基因的表達[1]. 每個miRNA家族中有多個成員，各成員核苷酸序列極其相似，對基因的調(diào)控作用表現(xiàn)出冗余效應(yīng). 因此，沉默其中一個miRNA很難出現(xiàn)預(yù)期的表型；通過常規(guī)的構(gòu)建基因沉默載體方法來研究miRNA的功能喪失(lose-of-function)存在很大困難[2]. 2007年，Jose等在研究低磷誘導(dǎo)下miR399的功能時，發(fā)現(xiàn)一個非編碼的基因IPS1，它是TPS1大家族中的一員.TPS1家族成員都含有一段非保守的短開放閱讀框(ORF)，具編碼四肽(Met-Ala-Ile-Pro)的功能[3-6]；另一個共同特征是含有一個保守的23 bp的基序，該基序與miR399可形成不完美配對，即配對時在第10~11座位錯配而出現(xiàn)一個突起環(huán)，致使IPS1可以與miR399特異結(jié)合而不被切割，因此，過表達IPS1可導(dǎo)致miR399的功能沉默，從而導(dǎo)致miR399的靶基因PHO2的表達上調(diào). Jose把這個抑制miRNA活性的機制稱為“靶擬態(tài)(target mimicry)”，并通過制造人工靶擬態(tài)抑制了相關(guān)miRNA的活性[7]. “靶擬態(tài)”機制使得專一性抑制目的miRNA的活性成為可能，為研究miRNA的功能提供了新的策略和方法.

目前普遍采用高通量基因克隆技術(shù)(Gateway Cloning Technology，簡稱Gateway技術(shù))以獲得目的基因的沉默突變體[8]. 該技術(shù)在被稱為“入門克隆(Gateway Entry Clone)”中目的DNA片段的插入位置兩端分別整合att L1和att L2側(cè)翼重組序列(Flanking Recombination Sequence)，形成一個類似通道的結(jié)構(gòu). 入門克隆與表達載體可以通過LR反應(yīng)(即在LR反應(yīng)酶作用下入門克隆的目的基因兩端的attL1和attL2位點與表達載體的attR1和attR2位點發(fā)生定向重組)，從而將目的基因轉(zhuǎn)移到表達載體. 該方法無需進行限制性內(nèi)切酶酶切等操作，簡易高效.

在前期研究中，作者發(fā)現(xiàn)人工老化處理的水稻種子隨著活力下降，其胚中miR164c的表達量上調(diào)，因此推測miR164c可能參與水稻種子活力的調(diào)控[9]. 作者試圖整合靶擬態(tài)合成技術(shù)和Gateway技術(shù)，制備水稻miR164c沉默突變體，為進一步研究miR164c調(diào)控種子活力的分子機制奠定基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1材料

水稻Kasalath、水稻ZR02、大腸桿菌(Escherichiacoli)TOP10、農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)Ag10和EHA105(湖南師范大學(xué)植物發(fā)育與分子生物學(xué)實驗室提供)；pGWC Vector，GCS-AsRed-pCambia1301-UbiN Vector(北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鄧興旺實驗室惠贈). 限制性內(nèi)切酶AhdⅠ(Fermentas公司)，Gateway LR Clonase Enzyme Mix(Invitrogen)，反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)及All-in-One miRNA Detection Kit(GeneCopiea公司)，PrimeSTAR HS DNA聚合酶、質(zhì)粒提取及膠回收試劑盒(上海生工生物公司)，TRIzol及引物的合成(Invitrogen)，其他為國產(chǎn)或進口分析純試劑.

1.2方法

1.2.1OsMIM164c的制備

1)引物設(shè)計以水稻基因組數(shù)據(jù)庫中序列IPS1為模板，運用primer 5.0軟件設(shè)計引物Os-IPS1-F(Primer A)和Os-IPS1-R(Primer B)，見表1；將IPS1中本來與miR399互補的序列(圖1)替換為與miR164c互補的序列(圖2)，在IPS1的上、下游分別設(shè)計引物Os-IPS1-miR164c-F(Primer C)和Os-IPS1-miR164c-R(Primer D)，然后在引物 C的5′端加上需要改造的堿基TCTA,引物 D的5′端加上需要改造的堿基TAGA(TAGA與TCTA彼此反向互補配對)，見表1.

表1　本文PCR反應(yīng)所用的引物

注：帶下劃線部分為與miR399互補的序列圖1　OsIPS1的序列Fig.1　The sequence of OsIPS1

注：帶下劃線部分為與miR164c互補的序列;引物設(shè)計(背景顏色對應(yīng)于上述OsIPS1的相應(yīng)部位)：Os-IPS1-F(Primer A)　5′-GCAGAAAGCCCCTCAAATCTCAAAGAGGCACCAATAC-3′Os-IPS1-R(Primer B)　5′-GGCACACACAATCTTAATTACTAATATCAAATTCATC-3′Os-IPS1-miR164c-F(Primer C)　5′-TGCACGTACC TCTA TGCACGTACCATTATTCGGTGGATG-3′Os-IPS1-miR164c-R(Primer D)　5′-TGGAGAAGCA TAGA GG TAC GTG CA CCTTAGTAGAGGTAA-3′其中，帶“____”部分為改造的與目的miRNA互補配對的片段； 帶“”部分為不與miRNA互補配對而設(shè)計的堿基圖2　改造的與miR164c互補的 IPS1序列Fig.2　The remoulded sequence of IPS1 complementary to miR164c

注：帶“____”部分為與miR164c互補配對的序列，為不與miR164c匹配的部位,帶波浪線部分為BglⅡ的切割識別部位圖3　OsMIM164c序列Fig.3　The sequence of OsMIM164c

2)重疊PCR制備OsMIM164c按陳銳等的方法[10]進行.以水稻ZR02葉片為材料，CTAB法[11]提取基因組DNA，以引物(Os-IPS1-F與Os-IPS1-R )PCR獲得OsIPS1片段；以O(shè)sIPS1為模板，引物(Os-IPS1-miR164c-F與Os-IPS1-R)PCR獲得OsIPS1-3′端片段；用引物(Os-IPS1-miR164c-R與Os-IPS1-F)PCR擴增獲得OsIPS1-5′端片段；(擴增用pfu酶)；以O(shè)sIPS1-3′端片段和OsIPS1-5′端片段為模板，加入引物(Os-IPS1-F與Os-IPS1-R)和dNTP及pfu酶，進行30循環(huán)PCR，膠回收獲得OsMIM164c片段.

1.2.2pGCW-OsMIM164c入門載體構(gòu)建構(gòu)建帶OsMIM164c的pGCW入門載體步驟如下： (1)酶切反應(yīng)：pGCW空載體 7 μL，Buffer 0.2 μL，ddH2O 10 μL，AhdⅠ1 μL，混勻后37 ℃水浴 5 h. (2)電泳：1%瓊脂糖凝膠電泳，回收大片段. (3)連接：用回收純化后的帶有AhdⅠ酶切位點的OsMIM164cPCR產(chǎn)物與pGWC酶切片段通過快速連接酶在16 ℃水浴鍋中連接1 h.(4)轉(zhuǎn)化：連接后轉(zhuǎn)導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞TOP10中，混勻，冰浴 2~3 min；42 ℃熱激 90 s，再冰浴 2~3 min；加入2 mL LB 培養(yǎng)基，于 37 ℃振蕩培養(yǎng) 45 min.(5)培養(yǎng)：取適量菌液均勻涂布于 LB 平板(含氯霉素12.5 mg/L)，培養(yǎng)皿倒置于培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)過夜，再挑取菌落劃線培養(yǎng).(6)PCR鑒定：挑選陽性克隆進行PCR鑒定后，鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測序確認(rèn).

選取測序正確的克隆制備質(zhì)粒. 挑取相應(yīng)的陽性菌落，分別接種于5 mL LB液體培養(yǎng)液中 (含氯霉素12.5 mg/L)，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜后，參照SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒說明提取質(zhì)粒. 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20 ℃保存.

1.2.3構(gòu)建GCS-OsMIM164c表達載體LR反應(yīng)創(chuàng)建表達載體GCS-OsMIM164c. 在0.2 mL的離心管中加入以下反應(yīng)體系(10 μL)：3.5 μL入門載體pGWC-OsMIM164c，1.5 μL植物空表達載體GCS，1 μL Buffer，1.5 μL LR酶，2.5 μL ddH2O. 混勻，瞬時離心后，25 ℃水浴1 h；取3 μL 反應(yīng)液轉(zhuǎn)導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞TOP10中(方法同1.2.2)，取適量菌液涂布的LB平板(含潮霉素30 mg/L)上，涂布均勻后，培養(yǎng)皿倒置于培養(yǎng)箱中，37 ℃ 恒溫箱中過夜培養(yǎng). 轉(zhuǎn)化后挑取菌落劃線培養(yǎng)，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒(方法同1.2.2).

植物表達載體GCS-OsMIM164c酶切鑒定: 反應(yīng)體系20 μL：GCS-OsMIM164c7 μL，BglⅡ1 μL， Buffer 0.2 μL， ddH2O 10 μL. 37 ℃ 水浴鍋，酶切6~8 h，1%瓊脂糖電泳(5 V/cm)檢測.

1.2.4農(nóng)桿菌介導(dǎo)GCS-OsMIM164c遺傳轉(zhuǎn)化水稻Kasalath參照周艷[12]的方法.

1.2.5突變體植株的分子鑒定選取T0代抗性植株，采用CTAB[11]法提取水稻基因組DNA，根據(jù)GCS-IPS1的嵌合片段設(shè)計上游引物P-GCS-F，根據(jù)目的基因設(shè)計下游引物P-IPS1-R，引物序列見表1，進行PCR擴增.

1.2.6RT-qPCR分析取水稻組織(葉、莖或種子等)樣品100 mg，液氮研磨至粉末狀，迅速轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5 mL EP管中，采用TRIzol法提取總RNA. 非變性瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計檢測后，按All-in-One miRNA Detection Kit(GeneCopoeia)說明操作，合成cDNA第一鏈. 根據(jù)Pre-miR164c序列設(shè)計RT-qPCR正向引物Os-miR164c-F，并以O(shè)s-5.8s為內(nèi)參基因(正向引物為Os-5.8s-F)，引物序列見表1，反向引物采用試劑盒中的通用引物. 以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，按Thermo Scientific PCR0096 Real-time PCR系統(tǒng)的說明操作，PCR反應(yīng)重復(fù)3次. RT-qPCR檢測的反應(yīng)體系10 μL：2×All-in-One qPCR Mix 5 μL，正、反向引物(0.2 μmol/L)各1 μL，diluted cDNA(1∶5)1 μL，ddH2O 2 μL. 熒光定量PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，40個循環(huán)，最后以每6 s上升0.5 ℃的速度從65 ℃到95 ℃記錄熔解曲線，實驗數(shù)據(jù)用Piko Real Software2.0分析.

2結(jié)果和分析

2.1OsMIM164c目的片段和GCS-OsMIM164c載體的鑒定

以水稻ZR02的基因組DNA為模板擴增得到的OsIPS1片段預(yù)期大小656 bp. 運用重疊PCR技術(shù)將OsIPS1改造為與miR164c不完全互補的片段OsMIM164c，改造后片段與IPS1大小一致(圖4), 測序結(jié)果符合預(yù)期. 將GCS-OsMIM164c用BglⅡ進行酶切后電泳檢測，結(jié)果如圖5所示，圖中1 580 bp左右的條帶與預(yù)期一致，表明目的片段已經(jīng)成功連入載體，表達載體構(gòu)建成功.

2.2miR164c沉默突變體的分子鑒定

挑取9個轉(zhuǎn)基因株系，分別提取其葉組織的基因組DNA，以GCS-OsMIM164c做陽性對照，野生型做陰性對照. 結(jié)果表明，其中8個株系擴增出特異性目的條帶(圖6)，說明已成功獲得了miR164c沉默突變體.

2.3沉默突變體的miR164c表達量分析

運用SYBR Green I染料法對miR164c沉默突變體的葉、莖和種子中的miR164c表達量進行RT-qPCR分析(分別以野生型的葉、莖和種子作對照). 結(jié)果表明，miR164c在沉默突變體的三類組織器官中的表達量均比野生型低(圖7).

M. DNA marker； 1. OsMiM164c　　　　　　　　　　　M. DNA marker; 1. BglⅡ酶切質(zhì)粒; 2. 非酶切質(zhì)粒　　　　　　　　圖4　OsMIM164c的電泳鑒定　　　　　　　　　　　圖5　GCS-OsMIM164c的酶切鑒定　Fig.4　Electrophoresis identification of OsMIM164c on 1.0% agarose gel　　　Fig.5　BglⅡ digestion identification of GCS-OsMIM164c

M. DNA Marker; P. GCS-OsMIM164c; WT. 野生型; 1-9.轉(zhuǎn)基因株系圖6　T0代轉(zhuǎn)基因株系GCS-OsMIM164c嵌合片段的PCR鑒定Fig.6　PCR identification for the chimeric fragment of GCS-OsMIM164c of T0 transgenic lines

圖7　水稻Kasalath miR164c沉默突變體和野生型不同組織器官中miR164c的表達量比較Fig.7　Comparison of the expression of miR164c in different tissues of miR164c silence mutant and wild type of rice Kasalath

3討論

miRNA的作用方式主要是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因，廣泛參與植物生長發(fā)育、抗逆性等方面. miRNA靶擬態(tài)(target mimicry)能夠有效地抑制相關(guān)miRNA的活性. 通過定向改造IPS1基因構(gòu)建人工miRNA靶擬態(tài)(Target mimicry)來下調(diào)miRNA表達，已成為研究miRNA功能的一種重要方法. Todesco等[13]利用靶擬態(tài)技術(shù)已經(jīng)成功構(gòu)建了在擬南芥中表達的MIM156,MIM157,MIM159,MIM160,MIM164,MIM167,MIM170,MIM172和MIM319等靶擬態(tài)突變體株系，使相應(yīng)的靶miRNA表達量顯著下調(diào)并獲得明顯表型. 水稻是單子葉模式植物，呂明芳[14]用靶擬態(tài)技術(shù)獲得了沉默miR156功能的植物轉(zhuǎn)化載體. 本研究改造水稻的IPS1序列，使其與miR164c配對時形成一個錯配環(huán)，獲得了OsMIM164c. 熒光定量PCR結(jié)果表明，突變體植株中miR164c的表達量在葉、莖和種子中均明顯下調(diào).

Gateway技術(shù)是invirtogen公司開發(fā)的一種高通量克隆技術(shù)，已被廣泛運用. 比如，徐化學(xué)等構(gòu)建了水稻基因OsDAD1基因的RNA干擾載體[15]；耿衛(wèi)東等構(gòu)建了棉花GhSAMDC基因RNA干擾載體和過表達載體[16]；郭姍姍等構(gòu)建了植物表達載體p1104D[17]；高東堯等構(gòu)建了含有雙35S啟動子的高效表達載體以驗證小麥穗發(fā)芽抗性相關(guān)Vp-1基因的功能[18]；何敏等構(gòu)建了靶向人Akt基因的shRNA表達載體[19]等等. 該技術(shù)可以將入門克隆的重組片段(目的基因)轉(zhuǎn)移到各種不同的表達載體中，由于在重組時DNA片段的閱讀框和方向保持不變，因而不影響同步表達克隆的測序結(jié)果；在使用每一種新的表達系統(tǒng)時，能節(jié)省更多的時間. 此外，Gateway構(gòu)建過程沒有限制性內(nèi)切酶和連接酶的參與，比普通酶切法的轉(zhuǎn)化效率高. 因此，該方法具有操作簡便、反應(yīng)條件容易控制、反應(yīng)后陽性克隆易于檢測的特點，適合大規(guī)模的載體構(gòu)建，為高通量地研究植物基因功能提供了有力支持. 另外，利用該技術(shù)構(gòu)建的是一種二元載體，可以直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化.

本文通過整合靶擬態(tài)技術(shù)和Gateway技術(shù)，快速高效獲得了miR164c的靶擬態(tài)沉默突變體，通過PCR檢測，陽性率高達89%， 為進一步探討miR164c對水稻種子活力調(diào)控的分子機制及其他生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ).

參考文獻：

[1]LEWISBP,SHIHIH,JONES-RHOADESMW, et al.PredictionofmammalianmicroRNAtargets[J].Cell, 2003,115(7):787-798.

[2]陳龍俊, 侯蕾, 紀(jì)鴻飛. 鹽芥miRNA393沉默載體的構(gòu)建[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2010(23):11-14.

[3]BURLEIGHSH,HARRISONMJ.Thedown-regulationofMt4-likegenesbyphosphatefertilizationoccurssystemicallyandinvolvesphosphatetranslocationtotheshoots[J].PlantPhysiolo, 1999,119(1):241-248.

[4]LIUC,MUCHHALUS,RAGHOTHAMAKG, et al.DifferentialexpressionofTPS11,aphosphatestarvation-inducedgeneintomato[J].PlantMolBiol, 1997,33(5):867-874.

[5]MARTINAC,POZOJC,IGLESIASJ, et al.InfluenceofcytokininsontheexpressionofphosphatestarvationresponsivegenesinArabidopsis[J].PlantJ, 2000,24(5):559-567.

[6]SHINH,SHINHS,CHENR, et al.LossofAt4functionimpactsphosphatedistributionbetweentherootsandtheshootsduringphosphatestarvation[J].PlantJ, 2006,45(5):712-726.

[7]FRANCO-ZORRILLAJM,VALLIA,TODESCOM, et al.Targetmimicryprovidesanewmechanismforregulationofmicro-RNAactivity[J].NatGenet, 2007,39(8):1033-1038.

[8]王聰穎, 陳書霞, 陳巧, 等. 利用Gateway技術(shù)構(gòu)建黃瓜HPL基因的RNA干擾載體[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2013,22(2):152-158.

[9]成海蘭.miRNA與水稻種子活力的相關(guān)性研究[D]. 長沙: 湖南師范大學(xué), 2011.

[10]陳銳, 胡正, 張輝. 小分子RNA表達載體構(gòu)建的新方法—MicroRNA前體PCR置換法[J]. 生物技術(shù)通報, 2010(7)：101-105.

[11]敬國興, 賴小玲, 李伏欽, 等. 植物基因組DNA提取—本科分子生物學(xué)實驗方法改進[J].中國教育技術(shù)裝備, 2008(20):127-128.

[12]周艷, 吳亞先, 姜孝成, 等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化秈稻Kasalath的條件優(yōu)化[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2013,39(5):471-477.

[13]TODESCO M, RUBIO-SOMOZA I, PAZ-ARES J,etal. A collection of target mimics for comprehensive analysis of microRNA function in Arabidopsis thaliana[J]. PLoS Genet, 2010,6(7):e1001031.

[14]呂明芳. 水稻miR156基因克隆及其功能初步分析[D]. 杭州: 浙江師范大學(xué), 2011.

[15]徐化學(xué), 熊建華, 傅彬英. 應(yīng)用Gateway技術(shù)構(gòu)建水稻OsDAD1基因的RNA干涉載體[J]. 分子植物育種, 2007,5(1):133-136.

[16]耿衛(wèi)東, 李艷軍, 張新宇, 等. Gateway技術(shù)構(gòu)建棉花GhSAMDC基因植物表達載體[J]. 石河子大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版, 2012,30(2):138-141.

[17]郭姍姍, 張蒙, 單衛(wèi)星. 基于Gateway技術(shù)的植物表達載體的構(gòu)建[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版, 2010,38(11):161-166.

[18]高東堯, 夏蘭琴, 徐兆師, 等. 小麥WBp-1基因表達載體的Gateway技術(shù)構(gòu)建及其遺傳轉(zhuǎn)化[J]. 麥類作物報, 2009,29(2):189-194.

[19]何敏, 趙學(xué)芹, 李曼, 等. 應(yīng)用Gteway技術(shù)構(gòu)建pLenti6-AktshRNA真核表達載體[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志, 2012,33(15):1798-1720.

(編輯WJ)

中圖分類號Q785; Q943.2

文獻標(biāo)識碼A

文章編號1000-2537(2016)01-0024-06

*通訊作者,E-mail：jxclc@hunnu.edu.cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(31071487，31270348)；湖南省生態(tài)學(xué)重點學(xué)科建設(shè)項目(0713)；湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實驗計劃項目(2014-76)

收稿日期：2015-03-31**本研究工作同等貢獻者.

DOI:10.7612/j.issn.1000-2537.2016.01.005