郭　煒金洪年張鈺勤鄭吉龍

（1.廣東省潮州市公安局刑警支隊，廣東 潮州521000；2.廣東省公安廳刑事技術中心，廣東 廣州510050；3.中國刑警學院法醫(yī)學系，遼寧 沈陽110035）

眼組織與死亡時間推斷

郭煒1金洪年2張鈺勤1鄭吉龍3

（1.廣東省潮州市公安局刑警支隊，廣東 潮州521000；2.廣東省公安廳刑事技術中心，廣東 廣州510050；3.中國刑警學院法醫(yī)學系，遼寧 沈陽110035）

眼組織用于推斷死亡時間一直是國內(nèi)外法醫(yī)學界的研究熱點之一。從肉眼宏觀到鏡下微觀，從細胞水平到分子水平，不斷有新的研究成果和報告出現(xiàn)。大量研究結果表明隨著死后經(jīng)過時間的延長，眼角膜、視網(wǎng)膜的形態(tài)學以及玻璃體液內(nèi)的離子、酶等成分均出現(xiàn)時間依賴性的變化，并與死亡時間高度相關，可用于死亡時間推斷。

法醫(yī)病理學死亡時間眼組織

死亡時間（postmortem interval，PMI）在法醫(yī)學上是指發(fā)現(xiàn)、檢查尸體時距死亡發(fā)生時的時間間隔。PMI的推斷一直是法醫(yī)病理學的重要且復雜的研究課題之一。法醫(yī)工作者推斷PMI的傳統(tǒng)方法主要根據(jù)尸體現(xiàn)象，再結合各自的主觀經(jīng)驗，但是由于受到眾多因素的影響，包括個體自身因素和外界環(huán)境因素，存在一定的局限性。眼組織由于受到眼眶及周圍外膜的包裹及保護，受外界環(huán)境的影響較小，因此20世紀60年代，針對眼組織的研究成為法醫(yī)學者用于推斷PMI的對象。

脊椎動物的眼組織由纖維膜、血管膜、視網(wǎng)膜及其內(nèi)容物等構成。眼球在構造分眼球壁和內(nèi)容物兩部分。眼球壁由外向內(nèi)順次為纖維膜（角膜、鞏膜）、血管膜（虹膜、睫狀體、脈絡膜）和視網(wǎng)膜3層。眼內(nèi)容物包括晶狀體、眼房水和玻璃體。眾多研究結果證實，眼角膜、視網(wǎng)膜的形態(tài)結構以及玻璃體液內(nèi)的離子、酶類成分等在死后的一定時間內(nèi)均出現(xiàn)規(guī)律性的變化，與PMI具有高度相關性，可用于PMI的推斷。

1　眼角膜與PMI推斷

長期以來，角膜混濁是法醫(yī)學實踐中用于推斷早期PMI的指標，角膜混濁程度和死后角膜形態(tài)學的改變存在一定的規(guī)律性［1］。法醫(yī)學者根據(jù)個體死后角膜的混濁度（Turbidity of cornea，TC）來大致推斷死亡時間，由于一定程度上帶有主觀性，誤差多在12h左右［2，3］。加入角膜形態(tài)學變化與PMI的關系文獻研究結果。

1.1角膜厚度與PMI的關系

角膜正常厚度和透明度依靠角膜內(nèi)皮細胞膜對水的主動轉運功能和把房水與角膜基質(zhì)隔開的機械性屏障作用來維持［4］。個體死亡以后，角膜內(nèi)皮細胞的死亡引起水分進入到角膜基質(zhì)層并進一步與粘多糖發(fā)生水合作用，導致角膜的厚度增加、透明度下降，在一定時間范圍內(nèi)，死后經(jīng)過時間越長，厚度越大且越混濁［5-7］。Petit等和孟祥志等應用解剖學方法和光學顯微鏡方法發(fā)現(xiàn)角膜厚度隨PMI的延長而增加，兩者呈線性關系。李曉娜等用角膜切片并結合圖像分析軟件發(fā)現(xiàn)角膜基質(zhì)層厚度和全角膜厚度與死亡時間之間呈較好的線性關系，證實應用角膜結構厚度圖像分析推斷PMI具有一定可行性和客觀性。

1.2角膜內(nèi)皮細胞與PMI的關系

角膜內(nèi)皮細胞位于角膜五層組織結構中的最內(nèi)層，為單層排列，六邊形結構，受外界環(huán)境因素影響較小，而且細胞密度無性別、種族差異［8］。

1.2.1角膜內(nèi)皮細胞活性率與PMI的關系

研究證實，個體死亡后，角膜內(nèi)皮細胞隨著死亡時間的延長逐漸死亡。應用茜素紅—曲利苯蘭聯(lián)合染色染，在光學顯微鏡下可清晰地識別角膜內(nèi)皮活細胞和失活細胞，從而反映角膜內(nèi)皮細胞活性的指標之一。

宋國林等在1995年對已知PMI的500只非正常死亡者的眼角膜，行茜素紅-曲利苯蘭聯(lián)合染色，觀察角膜內(nèi)皮細胞活性（單位面積內(nèi)的活性內(nèi)皮細胞所占細胞總數(shù)的比例，英文全稱ECLR），發(fā)現(xiàn)ECLR隨著PMI的延長而呈降低趨勢，兩者之間存在著明顯的負相關。1999年徐長苗等研究溫度對尸體ECLR的影響，他發(fā)現(xiàn)角膜內(nèi)皮細胞的存活率與溫度呈負相關。兩者肯定了茜素紅-曲利苯蘭聯(lián)合染色法檢測角膜內(nèi)皮細胞活性率以推斷法醫(yī)學PMI的可行性并首次應用該方法進行量化。

1.2.2角膜內(nèi)皮細胞核DNA與PMI的關系

角膜本身無血管，細胞排列有規(guī)律，具有組織細胞單一、自溶速度慢等特點。2003年，劉承泉等首次應用DNA技術檢測死后72h內(nèi)兔角膜上皮細胞核和內(nèi)皮細胞核DNA降解速率與PMI的關系，發(fā)現(xiàn)兩者具有顯著的相關性，該方法具有測量精度高，速度快等特點，但其靈敏度和易觀察性不高，且只能對死后細胞DNA降解作定量分析。鄭吉龍等應用單細胞凝膠電泳（SCGE）技術結合熒光顯微鏡和專業(yè)的計算機圖像分析技術，證明了不同死后間隔時間所發(fā)生的不同程度的角膜內(nèi)皮細胞DNA降解，其降解發(fā)生率與死后間隔時間呈良好的線性關系。

1.2.3其他

另外，利用死后角膜水通道蛋白1 （AQP1）含量變化和角膜基質(zhì)中膠原纖維的分子直徑變化進行推斷PMI也在不斷進行中，其結果的有效性和可靠性有待進一步證實［9，10］。

2　視網(wǎng)膜與PMI推斷

視網(wǎng)膜位于眼組織的最內(nèi)層，受外界環(huán)境因素的影響小。陳曉瑞等應用復合熒光RTPCR技術，檢測死后不同時間大鼠視網(wǎng)膜細胞β-actin、Pgk1和Rp14等結構性蛋白mRNA水平，發(fā)現(xiàn)死后28h內(nèi)，大鼠視網(wǎng)膜細胞mRNA的含量隨PMI的延長而下降，與PMI具有顯著相關性。盡管mRNA的檢測解決了檢材含量低、敏感性不高、形態(tài)不易觀察等問題，但只能對死后細胞mRNA降解作定量分析。彭新等采用改良Feulgen-Vans染色和圖像分析技術檢測大鼠死后28h內(nèi)視網(wǎng)膜細胞核DNA含量變化，發(fā)現(xiàn)大鼠死后視網(wǎng)膜細胞核DNA含量隨著PMI的延長而呈規(guī)律性降解，并與PMI具有良好的相關性。該法間接驗證了死后細胞核DNA變化的機制。

3　玻璃體液與PMI推斷

玻璃體液具有受外界污染小和自溶慢的特點，因此玻璃體液內(nèi)的組織化學成分變化相對穩(wěn)定，優(yōu)于血液和腦脊液等體液，一直是根據(jù)尸體化學變化推斷PMI的較理想人體檢材。目前，應用玻璃體液進行PMI推斷的研究主要集中在氨、尿素氮、肌酐、葡萄糖、無機鹽離子（尤其是鉀離子）、次黃嘌呤和酶類等物質(zhì)。死亡后不同時間眼玻璃體液化學成分的變化有助于推斷PMI。

3.1玻璃體液中化學成分與PMI的關系

早在1978年，Van den Oever對150例死后玻璃體液標本用不同的方法測定氨的含量，結果表明猝死尸體的玻璃體液中的氨濃度隨著PMI的延長而有規(guī)律地升高，且與死因和環(huán)境溫度有關。大量的研究PMI和環(huán)境溫度對玻璃體液的肌酐和尿素氮變化的影響，表明在4℃下，死后48h內(nèi)玻璃體液中的肌酐和尿素氮緩慢上升，肌酐和尿素氮水平與PMI具有一定的相關性，肯定了玻璃體液中肌酐水平在推斷PMI的可行性，并建議結合其他參數(shù)以準確推斷PMI。陶濤等還發(fā)現(xiàn)玻璃體液內(nèi)葡萄糖濃度在死后迅速下降，在死后24h左右為零，與PMI之間具有很好的相關性，但需排除引起血糖升高因素如糖尿病、寒冷天氣、劇烈運動、含糖飲食等因素的影響。

3.2玻璃體液中無機鹽離子與PMI的關系

人體死亡以后，玻璃體液鉀離子濃度增高，其機制與睫狀體主動輸送鉀離子進入眼后房和玻璃體內(nèi)有關。半個世紀以來，法醫(yī)病理學者們應用不同的檢測方法和實驗對象，檢測玻璃體內(nèi)鉀離子濃度，證實鉀離子的變化與PMI的關系并建立回歸方程［11-13］。龔志強等應用電感耦合等離子質(zhì)譜（ICP-MS），系統(tǒng)地研究了家兔死后96h內(nèi)眼玻璃體液21種元素含量變化與PMI的相關性，實驗得出鉀、鎂、磷、鍶和鋇與PMI之間存在正相關，鈉、鐵、鈣和銅存在負相關性，鋁、銻、鎳和鋅則與PMI之間相關性很弱，進一步確認了玻璃體液微量元素在PMI推斷上的應用價值。

3.3玻璃體液中次黃嘌呤與PMI的關系

次黃嘌呤是在缺氧的狀態(tài)下形成的，死后或死前機體缺氧均可升高。Rognum等報道稱玻璃體液次黃嘌呤（Hx）濃度在死后隨著PMI的延長而呈線性升高，其濃度變化受溫度影響，其適用于在生前無缺氧的尸檢案例，尤其是死后24h內(nèi)。之后，Munoz等進一步修正了死亡原因對Hx濃度的影響，得到更為精確的線性回歸方程。

3.4玻璃體液中酶類與PMI的關系

2004年，李興彪等研究了死后玻璃體液中淀粉酶水平的變化，認為家兔死后72h內(nèi)玻璃體液中淀粉酶水平與PMI之間存在顯著相關。王偉平等用光度法檢測家兔死后0～54h玻璃體液膽堿酯酶（CHE）和谷草轉氨酶（GOT）的活性變化與PMI和死后溫度的關系，發(fā)現(xiàn)兩種酶的活性改變在一定時間內(nèi)各自出現(xiàn)一個平臺期，平臺期后兩種酶的活性迅速下降，與PMI呈現(xiàn)顯著的負相關。劉承泉等證明玻璃體液中羥丁酸脫氫酶（HBDH）、乳酸脫氫酶（LDH）活性變化，隨著PMI的延長而逐漸下降。

3.5其他

除了檢測玻璃體液中的酶活性和離子濃度外，龔志強等證明家兔眼玻璃體液消光度在死后0～72h內(nèi)與PMI呈線性正相關，可用于推斷早期PMI。2008年，周睿卿等首次研究玻璃體液電導率的變化，發(fā)現(xiàn)30℃和20℃下家兔死后玻璃體液電導率隨著PMI的延長而持續(xù)升高，兩者存在著顯著的正相關。

4　存在問題和展望

盡管目前應用眼組織變化推斷死亡時間的方法和研究內(nèi)容比較多，研究主要應用動物實驗且集中在短期內(nèi)的變化規(guī)律，因此，下一步應使用尸體標本進行研究，并綜合考慮個體自身因素和環(huán)境外部因素的影響，使用實驗證明的穩(wěn)定實驗手段，利用眼組織更客觀、真實地推斷PMI。眼組織有望成為一種用于法醫(yī)學PMI推斷的普遍適用的方法。

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