李　鵬　徐曲毅　劉　超，

（1.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州510000；2.廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所，廣東 廣州510000）

細(xì)菌與藻類生物在溺死診斷中的研究進(jìn)展*

李鵬1徐曲毅2劉超1，2

（1.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州510000；2.廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所，廣東 廣州510000）

法醫(yī)工作中，水中尸體“生前溺死”的判斷是法醫(yī)病理學(xué)尸檢案例中的一個難點和重點。硅藻檢驗是溺死診斷常用的實驗室檢驗方法，被認(rèn)為是溺死診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。近年來研究表明，除在溺死尸體臟器中存在硅藻外，其它不同于硅藻藻類與細(xì)菌類等生物也存在溺死尸體臟器與血液中。本綜述主要就存在溺死尸體臟器或血液中的藻類與細(xì)菌的種類及其相關(guān)檢測方法，旨在使人們了解藻類與細(xì)菌類等生物在溺死診斷中的研究現(xiàn)狀。

法醫(yī)病理學(xué)溺死藻類細(xì)菌

溺死的判定在法醫(yī)實踐中是一項常見的工作和難題［1］，它通常建立在對尸表檢查、尸體解剖、及實驗室檢查等結(jié)果綜合分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行判斷［1，2］。當(dāng)尸體腐敗時或白骨化時，由于尸表等溺死征象消失，此時硅藻檢驗是輔助推斷溺死不可或缺的輔助手段［2］。近年來，除硅藻外，在溺死尸體臟器中同時檢出藍(lán)藻［3］、綠藻［4］等其它藻類得到證實。除藻類外，研究表明，與硅藻體積（＞2μm）相比，一些細(xì)菌（＜2μm）類如水生細(xì)菌等體積更小的生物更易隨溺液進(jìn)入溺死者體內(nèi)分布到血液與臟器中，同時研究表明若根據(jù)細(xì)菌種類區(qū)別可對溺死尸體進(jìn)行溺死地點的判斷［5］。因此，在水中尸體臟器與血液中發(fā)現(xiàn)上述細(xì)菌、藻類等生物可對溺死診斷的判定具有重要的參考意義。本綜述主要對發(fā)現(xiàn)可在溺死過程中隨溺液進(jìn)入血液循環(huán)的生物及相關(guān)的檢測方法進(jìn)行概述。

1　在溺死尸體臟器中發(fā)現(xiàn)的藻類、細(xì)菌類生物

溺死是液體媒介（通常是水）阻塞呼吸道（鼻和口）而引起的死亡［6］。在溺死過程中，由于肺泡、毛細(xì)血管屏障損傷導(dǎo)致水中存在的一些藻類或細(xì)菌，及存在正常人體喉部的細(xì)菌均有可能隨溺液進(jìn)入體液循環(huán)，進(jìn)而到達(dá)人體各器官。下述生物是研究證實可進(jìn)入溺死人體血液循環(huán)的相關(guān)藻類、細(xì)菌。

1.1藻類

1.1.1硅藻（Diatom）

硅藻是國內(nèi)外溺死診斷研究最多同時也是最詳細(xì)的藻類。硅藻因其獨特的硅質(zhì)細(xì)胞殼，在高溫及強酸等條件不易被破壞，同時在各種水域中分布廣泛，至今仍然是溺死診斷的重要依據(jù)，尤其是對于尸體腐敗的案例［2］。目前，溺死尸體臟器中已發(fā)現(xiàn)多種硅藻，但不同水域中存在的硅藻種類與數(shù)量有差異。因此，有學(xué)者呼吁建立不同水域硅藻數(shù)據(jù)庫，對推斷溺死及溺死地點具有積極意義［2］。

1.1.2藍(lán)藻（Cyanobacteria）

據(jù)有關(guān)報道，藍(lán)藻存在于溺死尸體臟器中［3］。藍(lán)藻也稱藍(lán)細(xì)菌，是地球上現(xiàn)存最古老，最簡單、最原始的生物之一。藍(lán)藻種類繁多，分布極其廣泛。藍(lán)藻能生存于各種類型水生環(huán)境。在淡水、海水、鹽池，潮濕等環(huán)境均有分布［7］。2013年，Tie J［3］等人對溺死人體臟器肺、肝、腎等檢材分別同時取5mg、10mg、20mg進(jìn)行分子生物學(xué)檢測，結(jié)果均為陽性，其檢材量遠(yuǎn)小于硅藻檢驗所需檢材量［8］。同年，Kakizaki E［4］等人使用454焦磷酸測序方法對溺死人體血液與臟器進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)多種藍(lán)藻可進(jìn)入溺死人體臟器中，見表1。

表1　溺死尸體血液中存在的藍(lán)藻Table 1.The Cyanobacteria existed in blood of drowning victims

上表表明多種藍(lán)藻種屬存在溺死尸體臟器中，并且據(jù)報道藍(lán)藻在正常人體內(nèi)不存在［4］，可避免尸體解剖過程中造成的污染，因此其有望成為輔助診斷溺死的新對象。

1.1.3其它藻類

除上述硅藻、藍(lán)藻等藻類存在溺死尸體臟器中，有研究報道，綠藻［4］、甲藻［9］等中的一些種類也存在溺死尸體臟器中，研究較少。

1.2細(xì)菌類

近年來，有研究報道水生細(xì)菌及存在人體喉部的正常菌群也可隨溺液進(jìn)入溺死人體臟器中，可為溺死診斷提供證據(jù)。

1.2.1淡水中細(xì)菌（Freshwater bacteria）

受水中環(huán)境影響如鹽濃度影響，海水與淡水中生存的細(xì)菌種類有差別，進(jìn)而引起不同水域進(jìn)入溺死人體臟器中的細(xì)菌產(chǎn)生差別，可用于推斷溺死及溺死地點。淡水中存在且進(jìn)入溺死尸體臟器中的細(xì)菌種屬主要為氣單胞菌屬（Aeromonas）中的菌種［5，10］，見表2。

1.2.2海水中細(xì)菌（Marine bacteria）

適應(yīng)生存在鹽濃度較高即海水的水環(huán)境中且被發(fā)現(xiàn)可隨溺液進(jìn)入溺死人體臟器的海水中的細(xì)菌主要種屬屬于桿菌屬（Photobacterium）、弧菌屬（Vibrio）［5］中的菌種，見表2。

表2　溺死尸體血液中存在的淡水與海水細(xì)菌Table 2.The freshwater and marine bacteria existed in blood of drowning victims

1.2.3喉部菌群

在溺死過程中，溺液可沖刷存在于人體喉部、口腔中的正常菌群如唾液鏈球菌（Streptococcus salivarius）、血鏈球菌 （Streptococcus sanguinis），使上述細(xì)菌隨溺液進(jìn)入血液循環(huán)到達(dá)各臟器與血液中而在溺死尸體臟器中被發(fā)現(xiàn)［11］。因其存在人體特殊部位，在一些案例如溺死在浴缸中因水中細(xì)菌與藻類較少或不存在時，檢測溺死尸體臟器中上述細(xì)菌的存在與否來判定溺死是很有意義的方法。

1.2.4細(xì)菌糞大腸菌、糞鏈球菌

溺死診斷研究中，有報道稱受糞便污染的水域常見的細(xì)菌糞大腸菌（faecal coliforms）、糞鏈球菌（faecal streptococc）可能成為溺死的標(biāo)志的細(xì)菌，此研究中發(fā)現(xiàn)淡水溺死與海水溺死尸體血液中均發(fā)現(xiàn)上述兩種細(xì)菌的存在［12］。但這兩種細(xì)菌是否能成為溺死診斷的標(biāo)志受溺死水域是否被污染及污染的程度影響。

上述細(xì)菌無論是在水域中存在或在人體喉部的正常菌群，與藻類相比，細(xì)胞體積更小，更容易隨溺液進(jìn)入血液循環(huán)分布到臟器中，而可能成為溺死診斷檢測對象，對溺死診斷的判斷具有積極意義［5］。但上述細(xì)菌如喉部正常細(xì)菌屬于機(jī)會致病菌，在某種條件下死者生前血液中可能存在上述細(xì)菌，對溺死的判定造成影響。因此，使用上述細(xì)菌來診斷溺死前要充分了解死者生前身體健康狀況及相關(guān)病例來幫助分析是否為溺死是必要的。

2　檢驗方法

2.1形態(tài)學(xué)觀察

目前，形態(tài)學(xué)觀察主要應(yīng)用于硅藻檢驗。對水中尸體臟器進(jìn)行不同的方法處理后通過離心或濾膜富集的方法收集硅藻，經(jīng)過光鏡或電鏡直接觀察硅藻的形態(tài)與種類來輔助診斷溺死及溺死地點是硅藻檢驗基本過程。進(jìn)行硅藻檢驗的水中尸體臟器處理方法有很多，包括化學(xué)消化法（強酸、酶消化組織），物理消化法（灰化法、浸漬法、硅膠梯度離心法、碎漿法等）［2］。其中目前最常用的硅藻檢驗方法是強酸消化法，但其易污染、靈敏度低［8］。有報道稱使用微波消解——真空抽濾——電鏡掃描法檢測硅藻大大提高了硅藻檢驗的靈敏度、特異性［8］，但由于儀器昂貴，不易普及。其它藻類如藍(lán)藻、綠藻目前沒有相關(guān)研究其形態(tài)學(xué)在溺死診斷中的應(yīng)用。

2.2培養(yǎng)法

一些研究報道將提取溺死尸體血液進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，不同水環(huán)境生存的細(xì)菌經(jīng)過不同鹽濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)后，其生長狀況、生長后菌落的顏色出現(xiàn)差別，從而判斷血液中是否含細(xì)菌有及細(xì)菌種類來判斷溺死及溺死地點［6，13，14］。血液中的細(xì)菌經(jīng)過培養(yǎng)提高細(xì)菌數(shù)量，有利于接下來的相關(guān)研究如分子生物學(xué)方法檢測即可增加PCR擴(kuò)增時模板量，但此種方法對實驗室環(huán)境及操作者要求較高，應(yīng)嚴(yán)格控制污染避免造成假陽性結(jié)果。

2.3分子生物學(xué)方法

分子生物學(xué)方法與傳統(tǒng)的硅藻檢驗方法相比，其優(yōu)點是無需觀察溺死相關(guān)生物細(xì)胞形態(tài)，具有靈敏度高、特異性強等特點［15］。目前，國內(nèi)外許多研究報道使用分子生物學(xué)方法來檢測溺死尸體臟器中存在的上述細(xì)菌、藻類等生物基因來診斷溺死［3-5，10，16］。相關(guān)報道研究方法主要集中在PCR擴(kuò)增技術(shù)與擴(kuò)增后產(chǎn)物檢測方法的不同。

2.3.1PCR技術(shù)

PCR擴(kuò)增技術(shù)在溺死診斷的相關(guān)研究中，使用PCR擴(kuò)增技術(shù)的類型有以下3種：（1）普通PCR［3，16］；（2）巢式PCR［10］；（3）實時定量PCR［5］。這些溺死診斷相關(guān)研究中，PCR技術(shù)擴(kuò)增體系有只含一對引物，有則含有多對引物的復(fù)合擴(kuò)增體系。普通PCR技術(shù)是溺死相關(guān)研究中最常用的方法，相對簡單。巢式PCR技術(shù)含有兩對引物，據(jù)研究稱可提高樣本陽性率及擴(kuò)增結(jié)果的特異性。實時定量PCR可同步檢測原始模板的濃度及產(chǎn)物的量，省去PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物電泳檢測的步驟，操作簡捷。一對引物的PCR擴(kuò)增體系與多重PCR技術(shù)相比，由于水中尸體腐敗導(dǎo)致檢測的靶基因降解而使模板量減少可能導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗引起假陰性結(jié)果，而多重PCR技術(shù)增加了檢測對象的種類或（和）靶基因的數(shù)量，可能對于提高溺死診斷的可靠性是一種有效的方法。

2.3.2PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法

PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物除實時定量PCR技術(shù)擴(kuò)增后無需對產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，其它PCR技術(shù)擴(kuò)增產(chǎn)物均需電泳檢測，常用有瓊脂糖-EB電泳、PAGE電泳等。近年有研究將毛細(xì)管電泳技術(shù)應(yīng)用到溺死診斷中檢測PCR產(chǎn)物，即通過檢測不同顏色的熒光的存在來反應(yīng)檢測的產(chǎn)物［17］，這種方法與上述兩種電泳技術(shù)相比，上樣量少，無需制膠、顯帶等過程，可更加靈敏與迅速完成電泳過程［18］。

2.3.3變性梯度凝膠電泳（DGGE）與變性高效液相色譜分析（DHPLC）檢測PCR產(chǎn)物推斷溺死地點

判斷水中尸體是否為溺死是法醫(yī)工作中重要的一部分，同時推斷溺死地點對法醫(yī)判斷溺死的工作具有重要意義。目前關(guān)于溺死地點的推斷的分子生物學(xué)方法的研究主要有兩種方法即變性梯度凝膠電泳（DGGE）與變性高效液相色譜分析（DHPLC）。2008年，何方剛［19］等人將三個不同水域及相應(yīng)溺死地點實驗兔肺臟進(jìn)行提取浮游生物DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而后進(jìn)行DGGE電泳檢測，結(jié)果顯示溺死地點實驗兔肺臟與相應(yīng)溺死水域DGGE圖相似而不同于其它水域及溺死兔肺臟。2013年，余政梁［20］等人使用DHPLC法來推斷溺死地點，結(jié)果同樣顯示溺死水樣與相應(yīng)溺死兔肺臟DHPLC圖譜具有很高相似性。水中尸體溺死的診斷不應(yīng)僅僅是推斷溺死的本身，有時正確推斷溺死地點可使溺死診斷更加完整、可靠。

3　小結(jié)

溺死診斷是法醫(yī)病理學(xué)工作中常見的任務(wù)與困難之一［8］。目前。溺死的診斷主要依靠尸表檢查、尸體解剖與實驗室檢查，尤其當(dāng)尸體腐敗導(dǎo)致溺死征象消失時，實驗室檢查對溺死診斷更為重要，其中硅藻檢查被認(rèn)為是溺死診斷的不可缺少的手段［2］。但也有報道稱非溺死尸體臟器中發(fā)現(xiàn)硅藻的存在，其應(yīng)用也受一些學(xué)者的爭議［21，22］。近年來，除硅藻外，其它藻類如藍(lán)藻、綠藻等藻類在溺死尸體臟器中被發(fā)現(xiàn)，使更多可在溺死尸體臟器中檢測到的對象得到豐富。此外，與上述藻類相比，體積更小的一些細(xì)菌更容易進(jìn)入隨溺液進(jìn)入體液循環(huán)分布到各臟器中得到證實。若在水中尸體臟器中發(fā)現(xiàn)上述藻類與細(xì)菌等生物對溺死診斷均具有重要的參考意義。溺死的判定有望隨相關(guān)研究的深入，會有越來越多可隨溺液進(jìn)入血液循環(huán)的生物被發(fā)現(xiàn)，增加可檢測的對象，聯(lián)合檢測多種對象可使溺死診斷更加可靠。對水中尸體進(jìn)行溺死診斷外，同時對溺死地點進(jìn)行確定可使溺死診斷更加完整。目前，我們根據(jù)一些研究報道可知DGGE等分子生物學(xué)方法可判斷溺死地點，但只停留在理論研究中，其應(yīng)用于實踐中的可靠性有待進(jìn)一步檢驗。

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廣東省科技計劃項目（2010A0861001）；公安部科技強警計劃項目（2014GABJC020）