李瑞雪 武少賢 龔玉寶 江苑苑 王志佳 孫乃越 王光利

(淮北師范大學生命科學學院，安徽 淮北 235000)

二嗪磷(C12H21N2O3PS)，又名二嗪農、地亞農，化學名稱為O,O-二乙基-O-(2-異丙基-6-甲基-4-嘧啶基)硫代磷酸酯[1],是一種廣譜有機磷殺蟲劑，具有觸殺、胃毒和一定的內吸作用，可防治棉蚜、棉紅蜘蛛、稻飛虱、稻葉蟬、稻二化螟、三化螟以及玉米、小麥、花生地下害蟲。此外，二嗪磷還廣泛應用于獸藥領域，也可作家庭衛(wèi)生用殺蟲噴霧劑，應用前景廣闊[2-4]。該產品自問世以來，經受了毒性、殘留、品種更新?lián)Q代、害蟲抗性等多種因素的長期考驗，經久不衰，在瑞士、美國、日本、前蘇聯(lián)等國生產能力均在500 t/a以上，世界產量在萬噸以上，占有機磷殺蟲劑的第二位[5]。二嗪磷在廣泛使用的同時，給人類健康和生態(tài)環(huán)境帶來的安全隱患逐漸引起人們的重視。已有大量事實及毒性研究結果表明，二嗪磷是對鳥類具有高毒性和高風險的農藥品種，僅僅一粒顆粒劑或用二嗪磷處理過的種子就可以殺死一只小鳥[6-7]。如今，二嗪磷在世界各地被頻繁檢出，歐美國家在多項水體中殺蟲劑濃度水平的調查研究中發(fā)現(xiàn)，二嗪磷是水體中常見的農藥殘留污染物之一。生物毒性實驗表明，其對生物體的神經系統(tǒng)有毒害作用并給周圍生態(tài)環(huán)境帶來長期的生態(tài)風險[8]。因此，二嗪磷降解菌的篩選和分離具有非常重要的理論意義和應用價值。

農藥在自然環(huán)境中可通過物理、光化學等許多方法被降解消除，但是大多數(shù)農藥在自然環(huán)境中的半衰期較長，由于土壤中微生物數(shù)量大、種類多，幾乎所有能造成環(huán)境污染的有機物都能被微生物所分解、利用，所以微生物對環(huán)境污染物的降解起著至關重要的作用[9]。自1973年第一次分離出二嗪磷的降解菌黃桿菌后，又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)假單胞桿菌、沙雷氏菌、粘質沙雷氏菌、石竹伯克霍爾德氏菌、缺陷短波單孢菌和節(jié)桿菌均能將二嗪磷作為唯一碳源[10-12]。索氏菌屬(Thauerasp.)，廣泛分布于土壤和水環(huán)境中。已報道的索氏菌屬中有降解間羥苯甲酸鹽、原兒茶酸、甲氧基芳香族化合物等的種類，在環(huán)境修復中扮演重要角色[13-15]。本課題組從長期受二嗪磷污染的污泥中分離出一株新的能高效降解二嗪磷的索氏菌，并研究了5種金屬離子、3種營養(yǎng)物質以及鹽濃度等因素對二嗪磷降解效率的影響。該研究對于修復環(huán)境中二嗪磷的污染具有重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀；聚合酶鏈反應(PCR)儀；紫外—可見分光光度計；Eppendorf可調移液器(0.1～2.5、0.5～10.0、10～100、100～1 000 mL)；恒溫空氣搖床；BT423S電子天平；恒溫培養(yǎng)箱；精密pH計；高速冷凍離心機；二嗪磷(純度96%)；其他化學試劑均為分析純。

1.2 主要培養(yǎng)基

無機鹽(MM)培養(yǎng)基: NaCl 1.00 g/L，K2HPO41.50 g/L，KH2PO40.5 g/L，NH4NO31.00 g/L， MgSO4·7H2O 0.20 g/L，pH 7.0。將添加70 mg/L二嗪磷的MM培養(yǎng)基標記為MM-1培養(yǎng)基。

LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g/L，酵母粉 5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，加入1.5%(質量分數(shù))瓊脂。

無碳無氮培養(yǎng)基：NaCl 1.00 g，K2HPO41.50 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.20 g，去離子水1 000 mL。將添加70 mg/L二嗪磷的無碳無氮培養(yǎng)基標記為MM-2培養(yǎng)基。

1.3 細菌的富集、分離和培養(yǎng)

取長年生產二嗪磷農藥的工廠排污口處污泥10.0 g于100 mL MM-1培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min搖瓶培養(yǎng)。7 d后從中移取5 mL富集液轉接到新鮮的100 mL MM-1培養(yǎng)基中。連續(xù)4次傳代培養(yǎng)后，使用高效液相色譜儀檢測二嗪磷含量。取1 mL有降解二嗪磷能力的富集液，采用梯度稀釋涂布平板法涂布于含200 mg/L二嗪磷農藥的LB固體培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。挑取有透明圈的菌落在含200 mg/L二嗪磷農藥的LB固體培養(yǎng)基平板上不斷劃線并驗證其降解能力，直至獲得能降解二嗪磷的純菌YM-3。

1.4 降解菌株的形態(tài)特征和生理生化特性

菌株YM-3于LB固體培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)48 h后，觀察菌落顏色及形態(tài)。通過革蘭氏染色、芽孢染色、鞭毛染色觀察其個體形態(tài)[16]。降解菌株的生理生化特性鑒定參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[17]。

1.5 降解菌株16S rRNA基因的擴增與測序

細菌基因組DNA的提取采用高鹽法，菌株YM-3的16S rRNA基因的PCR擴增采用50 μL反應體系：DNA模板(50 ng/μL)1 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL ，引物(1 mmol/L)各1 μL，10×PCR Buffer 5 μL，rTaq酶(5 U/μL)0.5 μL，雙蒸水(ddH2O) 37.5 μL，所使用引物為通用引物27F(5’-GAGTTTGATCATGGCTCAG-3’)、1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGATC-3’)[18-20]。測序委托上海生工測序公司完成。

1.6 降解菌株系統(tǒng)發(fā)育地位的確定

將降解菌株的16S rRNA基因序列在NCBI上進行在線比對并分析，并在EzTaxone (hppt://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)上進行同源性比對，選擇同源性較近的序列運用MEGA 6.0建立其進化樹[21]。

1.7 菌株YM-3降解特性的研究

通過搖床實驗研究不同溫度、pH、接種量、裝液量、底物濃度、鹽濃度、金屬離子和營養(yǎng)物對底物降解的影響。結果表明，最佳降解溫度和pH分別為30 ℃和7.0，以下不作詳細敘述。將YM-3的菌液分別做以下處理：(1)按1%(體積分數(shù))的接種量接種于分別裝有15、30、45、60、75、90、105 mL MM-2培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中。(2)按1%、2%、5%、8%、10%和20%的接種量分別接入10 mL MM-2培養(yǎng)基中。(3)按1%的接種量分別接種于含5、10、15、20、25、30、35、40、50、100 g/L NaCl的10 mL MM-2培養(yǎng)基中。(4)按1%的接種量分別接入含10、100、1 000、10 000 mg/L 4個濃度梯度的葡萄糖、酵母粉和蛋白胨的10 mL MM-2培養(yǎng)基中。(5)按1%的接種量分別接入含0.1、1.0、2.0 mmol/L 3個摩爾濃度梯度的Cu2+、Ca2+、Ba2+、Li+和Zn2+的10 mL MM-2培養(yǎng)基中。(6)按1%的接種量分別接入含70、90、110 mg/L二嗪磷的10 mL無碳無氮培養(yǎng)基中。搖床培養(yǎng)36 h后通過高效液相色譜儀測二嗪磷的濃度。

1.8 檢測方法

二嗪磷的提取在CHEN[22]的方法上稍加改進：向實驗組MM-1和MM-2培養(yǎng)基中加入等體積的二氯甲烷，劇烈振蕩10 min后，靜置至水相與有機相分層。移出有機相，并加入適量無水硫酸鈉去除有機相中殘留的水分。將有機相移出，氮氣吹干后，加入2.0 mL乙醇將其溶解，經0.45 μm有機濾膜過濾后，通過高效液相色譜儀測定二嗪磷的含量。流動相為甲醇∶水(體積比48∶52)，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL，波長為244 nm，出峰時間為11 min。

圖1 采用鄰接法對菌株YM-3及其相關的種的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of strain YM-3 and related species using the neighbor-joining approach

2 結果與分析

2.1 菌種分離與鑒定

從污泥中篩選到能高效降解二嗪磷的菌株YM-3，該菌為革蘭氏陽性；最適生長溫度為30 ℃；在LB固體培養(yǎng)基平板上單菌落呈淡黃色、圓形、邊緣整齊、表面濕潤有光澤；經16S rRNA基因序列同源性分析，如圖1所示，菌株YM-3與索氏菌屬位于同一分支上，與ThaueraaminoaromaticaT(AMXD01000247)序列相似度高達97.52%，所以鑒定其為索氏菌屬，GenBank登陸號為KU321686。

2.2 菌株YM-3的降解曲線

按1%的接種量將菌懸液(600 nm處光密度(OD600)值為1.0)接種到MM-1培養(yǎng)基中，每隔12 h取出10 mL培養(yǎng)液按1.8中所述方法測定二嗪磷的含量，得到其降解曲線。結果表明，當?shù)孜镔|量濃度為70 mg/L時，在第一個12 h內二嗪磷的降解速率為3.4 mg/h，72 h時二嗪磷的降解率高達91%。

2.3 菌株YM-3降解特性

2.3.1 接種量對菌株YM-3二嗪磷降解率的影響

如圖2所示，接種量對菌株的降解率有很大的影響。接種量在0～5%時，菌株YM-3對二嗪磷的降解率隨接種量的增大而迅速增加；在5%～20%時降解率緩慢增加。說明當接種量小于5%時，供菌體生長的營養(yǎng)物質充足，因此二嗪磷的殘留量迅速降低。

圖2 接種量對菌株YM-3二嗪磷降解的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on diazinon degradation by strain YM-3

2.3.2 裝液量對菌株YM-3二嗪磷降解率的影響

為考察裝液量對二嗪磷降解的影響，將菌株YM-3(OD600=1.0)按1%的接種量接種于分別裝有15、30、45、60、75、90、105 mL MM-2培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，搖床培養(yǎng)36 h。如圖3所示，當裝液量小于等于75 mL時，二嗪磷殘留量隨裝液量的增加而明顯增加?？梢?，YM-3為好氧菌，減小裝液量，即增大通氣量有利于提高二嗪磷的降解速率。

2.3.3 底物濃度對菌株YM-3二嗪磷降解率的影響

在無碳無氮培養(yǎng)基中設置3個二嗪磷質量濃度梯度：70、90、110 mg/L，以期研究底物濃度對二嗪磷降解率的影響。如圖4所示,當?shù)孜镔|量濃度為70 mg/L時二嗪磷被降解的最徹底，72 h時降解率達到91%；隨底物濃度的增加降解率明顯下降，并且二嗪磷的降解主要集中在前24 h；當?shù)孜镔|量濃度為110 mg/L、降解72 h時二嗪磷只被降解了59%?？梢?，在無碳無氮培養(yǎng)基中，菌株能以二嗪磷為唯一碳氮源，因為二嗪磷本身具有毒性，所以二嗪磷超過一定濃度時對菌體的生長起到了抑制的作用。

圖3 裝液量對菌株YM-3二嗪磷降解的影響Fig.3 Effect of aeration on diazinon degradation by strain YM-3

圖4 二嗪磷質量濃度對菌株YM-3二嗪磷降解的影響Fig.4 Effect of diazinon concentration on diazinon degradation by strain YM-3

2.3.4 鹽濃度對菌株YM-3二嗪磷降解率的影響

將菌株YM-3分別接種到NaCl質量濃度為5～100 g/L的MM-2培養(yǎng)基中。如圖5所示，在5～20 g/L的NaCl質量濃度范圍內二嗪磷的殘留量逐漸上升；隨NaCl濃度繼續(xù)增大，二嗪磷的殘留量在61～71 g/L波動；說明菌株YM-3對NaCl的耐受性有限。

2.3.5 金屬離子對菌株YM-3二嗪磷降解率的影響

菌株YM-3接種于MM-2培養(yǎng)基中，分別添加0.1、1.0、2.0 mmol/L 3個摩爾濃度梯度的Cu2+、Ca2+、Ba2+、Li+、Zn2+，搖床培養(yǎng)36 h。如圖6所示，5種不同的金屬離子均抑制了二嗪磷的降解，且Ba2+對二嗪磷的降解影響與自身濃度的關系不大。

2.3.6 不同營養(yǎng)物對菌株YM-3二嗪磷降解率的影響

對于以共代謝途徑降解農藥或其他化合物的細菌，需要外界提供其他能源和碳源物質才能降解目標物[23]。將菌株YM-3分別接種到10、100、1 000、10 000 mg/L葡萄糖、酵母粉和蛋白胨的MM-2培養(yǎng)基中。如圖7所示，這3種營養(yǎng)物的加入均不同程度地抑制了二嗪磷的降解，說明菌株YM-3不是通過共代謝的途徑降解二嗪磷的。

圖5 NaCl質量濃度對菌株YM-3二嗪磷降解的影響Fig.5 Effect of NaCl concentration on diazinon degradation by strain YM-3

圖6 不同金屬離子對菌株YM-3二嗪磷降解的影響Fig.6 Effect of various heavy metal ions on diazinon degradation by strain YM-3

圖7 不同營養(yǎng)物對菌株YM-3二嗪磷降解的影響Fig.7 Effect of various nutrients on diazinon degradation by strain YM-3

3 討 論

有機磷農藥在農業(yè)上的使用已有40多年，且大部分有機磷農藥結構相似，均通過抑制乙酰膽堿酯酶達到殺蟲、殺菌的目的[24]。二嗪磷是一種高效有機磷殺蟲劑，具有觸殺、胃毒和一定的內吸作用[25]。隨著二嗪磷產品的廣泛使用，其在環(huán)境中的殘留問題正逐漸暴露，與化學和物理法相比，生物降解具有經濟、安全、高效等顯著優(yōu)點，因此，使用微生物技術處理二嗪磷成為污染治理的研究熱點[26-27]。索氏菌廣泛存在于環(huán)境中，是一種多功能降解菌，能降解多種難降解的有機物，如間羥苯甲酸鹽、原兒茶酸、甲氧基芳香族化合物。本課題組從長期受二嗪磷污染的污泥中分離出一株新的能高效降解二嗪磷的索氏菌YM-3，并從底物濃度、裝液量、接種量、金屬離子、營養(yǎng)物和鹽濃度等方面對其降解特性做進一步的研究。

降解特性實驗選擇70 mg/L的二嗪磷作為實驗合適的降解濃度，因為當二嗪磷質量濃度高于70 mg/L時，細菌受環(huán)境影響，酶活性受到抑制，生長速度減慢導致降解效率低[28]。菌株YM-3對二嗪磷的降解存在快速降解期和緩慢降解期，在前12 h降解速度很快，之后降解緩慢。首先，可能是細菌生長進入衰亡期或二嗪磷濃度迅速降低導致降解緩慢；其次可能是因為在二嗪磷降解過程中，中間產物的積累與二嗪磷形成競爭代謝[29-30]。二嗪磷的微生物降解不僅考慮時間因素，還要考慮菌種特性，在實際應用中，根據(jù)長期或短期不同的實際要求選擇菌種[31]。例如，對二嗪磷的降解，若在較短期取得較好的降解效果可以選擇菌株YM-3，而長期而言，應選擇菌株CTN-4[32]。本研究篩選的以二嗪磷為唯一碳氮源的高效降解菌株，不僅豐富了二嗪磷降解菌的種類，并且在修復二嗪磷污染方面有較好的前景。

4 結 論

從長年生產二嗪磷的農藥廠的排污口處污泥中分離篩選得到一株二嗪磷的高效降解菌株，初步鑒定為索氏菌屬。菌株YM-3是以非共代謝形式降解二嗪磷的細菌，可以將二嗪磷作為唯一碳氮源，對70 mg/L的二嗪磷降解72 h降解率高達91%。從降解特性研究結果得出，菌株YM-3是好氧菌，對NaCl的耐受性有限；降解能力受Cu2+、Ca2+、Ba2+、Li+、Zn2+5種金屬離子的影響。

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