包秀麗，劉婷婷，張海濤，張利民

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院眼科，呼和浩特 010050）

姜黃素通過Wnt/β-catenin信號通路抑制晶狀體上皮細胞增殖的實驗研究*

包秀麗，劉婷婷，張海濤，張利民

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院眼科，呼和浩特 010050）

[目的]探討姜黃素通過Wnt/β-catenin信號通路對人晶狀體上皮細胞（LECs）增殖的影響及其可能的作用機制，為晶狀體后囊膜混濁（PCO）的臨床治療提供新的靶點。[方法]人LECs系SRA 01/04細胞為研究對象，實驗分為3組:Wnt3a組，姜黃素組和對照組。Wnt3a組采用脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染技術(shù)將Wnt3a cDNA表達載體瞬時轉(zhuǎn)染入人SRA 01/04細胞中，構(gòu)建PCO的細胞模型。姜黃素組在轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt3a cDNA表達載體48 h后加入20 μmol/L姜黃素，對照組轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA表達載體。采用Western blot技術(shù)驗證載體在轉(zhuǎn)染細胞中的表達，CKK-8實驗檢測姜黃素對SRA 01/04細胞增殖能力的影響，采用免疫細胞化學法檢測Wnt3a過表達后增生細胞核抗原（PCNA）蛋白表達的變化；Western blot法檢測Wnt3a過表達對Wnt/β-catenin下游信號分子cyclin D1和c-Myc蛋白表達的影響；應(yīng)用免疫熒光法檢測Wnt3a過表達后β-catenin表達的定位變化。[結(jié)果]Western blot檢測證實，轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA表達載體后,SRA 01/04細胞內(nèi)Wnt3a蛋白表達明顯升高。CKK-8檢測表明，姜黃素組SRA 01/04細胞的增殖率明顯低于Wnt3a組（t=2.782，P=0.049）。姜黃組SRA 01/04細胞PCNA蛋白表達陽性率為 23.6%±4.0%，明顯低于Wnt3a組的43.4%±5.4%，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.951，P=0.018）。轉(zhuǎn)染后48 h，β-catenin蛋白密集分布于Wnt3a組細胞核和細胞質(zhì)中，而在對照組僅出現(xiàn)于細胞之中，姜黃素組β-catenin蛋白主要分布于細胞核中，少量分布于細胞質(zhì)中。Western blot檢測姜黃素組Wnt/β-catenin信號通路靶蛋白Cyclin D1和c-Myc蛋白表達明顯低于Wnt3a組。[結(jié)論]在SRA 01/04細胞中，姜黃素抑制Wnt3a過表達誘導的Wnt/β-catenin信號通路活化，下游靶蛋白Cyclin D1和c-Myc表達下調(diào)，抑制人LECs的增生。

姜黃素；Wnt3a；晶狀體上皮細胞；Wnt/β-catenin信號通路；細胞增殖；后囊膜混濁

后囊膜混濁（PCO）是白內(nèi)障囊外摘除術(shù)后最常見的并發(fā)癥，大約有20%～40%的患者術(shù)后2～5 a會發(fā)生PCO。目前的研究認為PCO的發(fā)生主要是由于手術(shù)后殘余的晶狀體上皮細胞（LECs）增殖、遷移、發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，與沉積的膠原一起形成了晶狀體囊袋內(nèi)的纖維斑塊[1]。姜黃素是姜黃的主要活性成分，近年來有研究發(fā)現(xiàn)姜黃素具有抑制腫瘤細胞生長、轉(zhuǎn)移和抗炎作用。本實驗在體外研究探討了姜黃素對晶狀體上皮細胞系HLE B-3細胞增殖的影響及其作用的信號通路，為今后PCO的防治提供部分實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 SRA 01/04細胞株（中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫）；姜黃素（美國Sigma公司）；右旋-纈氨酸基礎(chǔ)培養(yǎng)液（DMEM）培養(yǎng)基、胎牛血清購自（美國 Gibco公司）；CCK-8試劑盒購自日本DOJINDO公司；甲基四唑藍（MTT，美國 Sigma公司）;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）;小鼠抗人單克隆PCNA抗體、羊抗小鼠二抗（北京中杉公司）；BCA蛋白定量試劑盒（Pierce公司）；小鼠抗人β-catenin單克隆抗體、兔抗人cyclin D1單克隆抗體、兔抗人c-myc單克隆抗體、羊抗兔/小鼠二抗、小鼠抗人β-actin（Santa cruz公司）化學發(fā)光ECL法（Millipore公司）；羊抗小鼠IgG Alexa Flour488（Invitrogen公司）。

1.2 儀器及試劑 VD-650-U型超凈工作臺（上海楚度儀器設(shè)備有限公司）；MCO-175型CO2培養(yǎng)箱（日本三洋集團）；UV-1800 PC型紫外-可見分光光度計（廣州科曉科學儀器有限公司）；BS-300型全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；Model-680型酶標儀（美國BIO-RAD公司）；FACS Aria型流式細胞儀（美國BD公司）；DYY-11型多用電泳儀、JY-SCZ2電泳槽（北京六一儀器廠）;倒置顯微鏡（日本Olympus IMT-413）；共聚焦顯微鏡（德國Leica）。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染及實驗分組 將SRA 01/04細胞株放人含10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗分為3組：Wnt3a組，姜黃素組，對照組。轉(zhuǎn)染前l(fā) d，將對數(shù)生長期的細胞以每孔4×105的濃度接種于6孔板內(nèi)，加入不含抗生素的DMEM（含15%胎牛血清）2 mL進行培養(yǎng)。Wnt3a組將4 μg構(gòu)建的Wnt3a cDNA表達載體[1]和10 μL脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000分別用250 μL DMEM稀釋，輕柔混勻，室溫下孵育5 min，再將兩者混合孵育20 min，加入6孔板的培養(yǎng)液中。姜黃素組在細胞轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt3a cDNA表達載體后48 h加入20 μmol/L姜黃素,為保證培養(yǎng)液中姜黃素的濃度，每24 h加入10 μmol/L姜黃素，加入姜黃素48 h后收集細胞做進一步分析測定，將pcDNA3-HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染作為對照組。

1.4 CCK-8細胞增殖實驗 細胞增殖能力用細胞增殖-毒性檢測試劑盒（CCK8，購自東仁化學有限公司）檢測。將Wnt3a組，姜黃素組和對照組細胞胰酶消化后接種至5個96孔板中，接種密度為2 000個/孔，每種細胞每板種18個復孔,分別培養(yǎng)不同時間（1、2、3、4、5 d）后，每孔加5 g/L的CCK8溶液10 μL，37℃孵育3 h后,酶標儀檢測450 nm處的OD值，每組實驗重復3次。

1.5 細胞免疫化學 將pcDNA3-HA/SRA 01/04及Wnt3a/SRA 01/04細胞以5×104/mL提前鋪于含有蓋玻片的12孔盤中，4%多聚甲醛（PFA）固定10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，加入小鼠抗人單克隆PCNA抗體4℃孵育過夜，PBS沖洗，用羊抗小鼠二抗室溫孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺法（DAB）顯色，蘇木素復染，脫水，封片。于400×光學顯微鏡視野下計數(shù)陽性細胞數(shù)比例，每片計數(shù)10個視野，以陽性細胞百分數(shù)代表蛋白表達陽性率。

1.6 Western blotting 在細胞中加入1×SDS細胞裂解液，獲取細胞蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度后，取35 μg樣品進行SDS-PAGE，電泳完畢后，應(yīng)用電轉(zhuǎn)儀將樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入一抗：小鼠抗人Wnt3a單克隆抗體（1∶1 000）、兔抗人cyclin D1單克隆抗體（1∶1 000）和兔抗人c-myc單克隆抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜，洗膜后加入相應(yīng)羊抗兔/小鼠二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，洗膜后化學發(fā)光ECL法顯影，暗室曝光。以小鼠抗人β-actin（1∶5 000）作為內(nèi)參陽性對照。

1.7 免疫熒光 將 pcDNA3-HA/SRA 01/04及Wnt3a/SRA 01/04細胞以5×104/mL提前鋪于含有蓋玻片的12孔盤中，4%多聚甲醛（PFA）固定10 min，PBS沖洗，50 mmol/L氯化銨焠滅游離PFA10 min；PBS沖洗，0.5%sponin室溫處理10 min；PBS沖洗，3%BSA封閉室溫1 h；PBS沖洗，加入小鼠抗人βcatenin單克隆抗體（1∶50）4℃孵育過夜，PBS洗3次，加入羊抗小鼠IgG Alexa Flour488（1∶200）避光室溫1 h；PBS洗3次，加入4，6-二乙?；?2-苯基吲哚酸鹽（DAPI）染核，避光室溫10 min；PBS洗2次，將蓋玻片移至載玻片上，用抗熒光衰減封片劑mowoil封片，共聚焦顯微鏡觀察、拍照。

1.8 統(tǒng)計學處理 結(jié)果應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件處理系統(tǒng)進行定理。本研究測量指標的數(shù)據(jù)資料用均數(shù)±標準差（s）表示，組間的差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，采用雙尾檢測法，以P＜0.05為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)使SRA 01/04細胞中Wnt3a過表達 收集經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染48 h后的SRA 01/04細胞蛋白，Western blot檢測證實，與轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA的SRA 01/04細胞相比，轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt3a cDNA表達載體的SRA 01/04細胞內(nèi)Wnt3a蛋白表達明顯升高，提示在SRA 01/04細胞中外源性Wnt3a基因得到了表達。見圖1。

2.2 姜黃素抑制SRA 01/04細胞增殖 CCK-8實驗檢測結(jié)果顯示，Wnt3a組OD值明顯高于對照組及姜黃素組（F=7.219，P=0.016），證明SRA 01/04細胞轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt3a cDNA表達載體后細胞增殖能力明顯增強，組間兩兩比較姜黃素組OD值明顯低于Wnt3a組（t=2.782，P=0.049），表明姜黃素抑制SRA 01/04細胞增殖。見圖2。

2.3 姜黃素抑制SRA 01/04細胞核內(nèi)PCNA的表達 免疫細胞化學檢測結(jié)果顯示PCNA表達于SRA 01/04細胞的細胞核內(nèi)，呈棕黃色，PCNA在姜黃素組和對照組的SRA 01/04細胞中表達陽性率較Wnt3a組低（23.6%±4.0%,6.0%±1.6%vs 43.4%± 5.4%，F(xiàn)=22.15，P=0.000 1），而在Wnt3a組中SRA 01/04細胞中表達陽性率較姜黃素組明顯增加（43.4%±5.4%vs 23.6%±4.0%，t=2.951，P=0.018）。提示姜黃素能夠抑制SRA 01/04細胞增殖。見圖3。

圖1 pcDNA3-HA/SRA 01/04及Wnt3a/SRA 01/04細胞中Wnt3a蛋白的表達Fig.1 Expression of Wnt3a protein in pcDNA3-HA/SRA 01/04 and Wnt3a/SRA 01/04 cells

圖1pcDNA3-HA/SRA 01/04及Wnt3a/SRA 01/04細胞中Wnt3a蛋白的表達

Fig.1 Expression of Wnt3a protein in pcDNA3-HA/SRA 01/04 and Wnt3a/SRA 01/04 cells

圖2 CCK8實驗檢測各組細胞在第1,2,3,4,5天的細胞增殖能力Fig.2 CCK8 assay was conducted to detect the proliferation ability of cells in 1,2,3,4,and 5 d,respectively

圖2 CCK8實驗檢測各組細胞在第1,2,3,4,5天的細胞增殖能力

Fig.2 CCK8 assay was conducted to detect the proliferation ability of cells in 1,2,3,4,and 5 d,respectively

圖3 PCNA在各組細胞中的表達Fig.3 Expression of PCNA in each group

2.4 姜黃素抑制β-catenin由胞漿轉(zhuǎn)入胞核 免疫熒光檢測卻發(fā)現(xiàn)β-catenin蛋白在Wnt3a組中SRA 01/04細胞胞漿和細胞核內(nèi)大量積聚，而在對照細胞中卻只分布在胞漿中，提示W(wǎng)nt3a過表達引起細胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄激動因子β-catenin積聚并轉(zhuǎn)入細胞核中，Wnt/β-catenin信號通路活化。而姜黃素組中β-catenin蛋白大部分分布于胞漿中，細胞核內(nèi)只有少量β-catenin蛋白，說明姜黃素能夠抑制Wnt/βcatenin信號通路的核轉(zhuǎn)移。見圖4。

圖4 β-catenin在各組細胞中的表達Fig.4 Expression of β-catenin in each group

2.5 姜黃素下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路靶蛋白Cyclin D1和c-Myc表達 Western blotting檢測結(jié)果顯示，Wnt3a組的SRA 01/04細胞中Cyclin D1和c-Myc蛋白表達較對照組明顯增加，而姜黃素組細胞中Cyclin D1和c-Myc蛋白表達明顯減弱，表明Wnt/β-catenin信號通路活化后，可引起Cyclin D1和c-Myc的表達增加，而姜黃素能夠抑制Wnt/βcatenin信號通路的核內(nèi)靶基因Cyclin D1和c-Myc的表達。見圖5。

3 討論

姜黃素是姜黃中提取的一種植物多酚，也是姜黃藥理作用的主要活性成分。中醫(yī)認為姜黃能行氣、散風活血、通經(jīng)止痛，近年的研究證明姜黃具有防癌抗癌、抗纖維化、抗炎、抗氧化、清除自由基以及促進凋亡等作用[2-3]。已有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能有效抑制EGF誘導的LEC增殖[4]，而姜黃素-羥甲基-β-環(huán)糊精能夠抑制兔眼PCO的發(fā)生，但其發(fā)生機制尚不清楚[5]。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠通過調(diào)節(jié)P53、PTEN、Caspase-3、Hedgehog及NF-κB等信號通路活性，發(fā)揮腫瘤抑制作用細胞及誘導凋亡[6-7]，還可能通過下調(diào)Wnt/β-catenin通路抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖[8]。

圖5 c-Myc和CyclingD1在各組細胞中的表達Fig.5 Expression of c-Myc and CyclingD1 in each group

筆者前期的實驗發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路與晶狀體上皮細胞的增殖密切相關(guān)，β-catenin是經(jīng)典Wnt信號通路中關(guān)鍵的信號蛋白，Wnt3a誘導經(jīng)典Wnt信號通路活化，促進β-catenin在細胞質(zhì)中積聚并轉(zhuǎn)移入細胞核中，激活核內(nèi)靶基因的轉(zhuǎn)錄[1]。其中，cyclin D1和c-Myc基因是Wnt/β-catenin信號通路重要的核內(nèi)靶基因，也是細胞增殖的重要調(diào)控因子，其上調(diào)能夠促進細胞由G1期向S期轉(zhuǎn)換，促進處于休眠狀態(tài)的細胞進入分裂期，從而影響細胞周期，從而促進晶狀體上皮細胞增殖[9]。姜黃素還可以通過下調(diào)的β-catenin和c-Myc的表達抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖[8]。通過Western blot和免疫熒光技術(shù)檢測β-catenin蛋白的表達，觀察到在轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt3a cDNA后的SRA01/04細胞內(nèi)存在β-catenin的核內(nèi)積聚，證明轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生Wnt3a目的蛋白，并分泌到細胞外，與相關(guān)的膜受體結(jié)合并使細胞內(nèi)的βcatenin轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)，活化Wnt/β-catenin信號通路，而姜黃素能夠抑制Wnt3a誘導的β-catenin核轉(zhuǎn)染，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化。

CCK-8實驗結(jié)果顯示姜黃素抑制SRA 01/04細胞的增殖。Kim TD等[10]發(fā)現(xiàn)姜黃素可以通過減弱Wnt信號通路及細胞間黏附，使HCT-116細胞停滯于G2/M期并使其凋亡。應(yīng)用cDNA芯片的方法分析調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)的基因表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素誘導細胞阻滯于G0/G1和/或G2/M期，從而抑制細胞增殖[11-12]。免疫細胞化學檢測還發(fā)現(xiàn)，Wnt/βcatenin信號通路活化后SRA 01/04細胞核內(nèi)PCNA蛋白呈現(xiàn)高表達，PCNA是真核細胞DNA合成時所必需的一種細胞周期調(diào)節(jié)酸性核蛋白，其在細胞核中陽性表達的程度與細胞增殖活性密切相關(guān)[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素通過抑制Wnt/β-catenin信號通路下調(diào)SRA 01/04細胞中cyclin D1和c-Myc蛋白表達。一些研究已表明姜黃素能夠通過下調(diào)cyclin D1和c-Myc的表達，降低分裂期細胞的比例，從而抑制細胞增殖[12，14]。在對姜黃素抑制腫瘤和心血管保護作用機制研究中發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠調(diào)節(jié)某些基因表達和相關(guān)的信號傳導通路，基因芯片技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)c-Myc是姜黃素治療的重要靶基因。Myc是轉(zhuǎn)錄因子螺旋-環(huán)-亮氨酸拉鏈家族的成員之一，能夠形成MYC-MAX復合物，Myc是一種腫瘤基因蛋白產(chǎn)物，參與腫瘤細胞增殖、分化和凋亡[15]。10 nmol的姜黃素可以將Myc mRNA的表達下調(diào)60%，還有實驗發(fā)現(xiàn)姜黃素治療后僅有21.95%的細胞表達Myc基因[15-16]，而體內(nèi)實驗也證明姜黃素通過下調(diào)c-Myc基因表達抑制細胞增殖[17]。姜黃素可以下調(diào)cyclin D1和p21抑制從而非小細胞性肺癌的腫瘤干細胞的增殖，還可以降低髓母細胞瘤細胞的β-catenin和其靶基因cyclin D1的表達，使細胞周期停滯于G2/M期，抑制腫瘤的增殖[18]。這一結(jié)果與其他體外實驗結(jié)果相似[19]。

本研究結(jié)果表明 Wnt3a通過抑制 Wnt/βcatenin信號通路下調(diào)cyclin D1和c-Myc的表達，進而發(fā)揮抑制人晶狀體上皮細胞增殖作用。由于PCO的發(fā)生發(fā)展是一個多階段逐步演變的過程，手術(shù)后殘余的晶狀體上皮細胞的異常增殖是PCO早期階段重要的病理變化之一，提示姜黃素可作為PCO基因治療或預防的新靶點。

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Curcumin regulation of human lens epithelail cell proliferation through Wnt/β-catenin signaling pathway

BAO Xiu-li,LIU Ting-ting,ZHANG Hai-tao,ZHANG Li-min
（Department of Ophthalmology,The Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010050,China）

[Objective]To investigate the effects of curcumin on proliferation of human lens epithelial cells(LECs)and its mechanism and to provide a new gene target in the prevention and treatment of PCO.[Methods]The research objects were the human LECs SRA 01/ 04.The experiment was divided into three groups:Wnt3a group,curcumin group and control group.In Wnt3a group,human Wnt3a cDNA expressing vector targeted human LECs was constructed to PCO model.In curcumin group,curcumin of 20 μmol/L was added after 48 hs of transfection.pcDNA3-HA expression vector was used as the control group.The expression of Wnt3a was identified by Western blot assay after transfected.The growth and proliferation of SRA 01/04 cells were detected by CCK-8 test.The expression and localization of proliferating cell nuclear antigen (PCNA)were analyzed by immunocytochemistry for the exploration of the mechanism of curcumin to proliferation of LECs.The expressions of cyclin D1and c-Myc in the cells were detected by Western blot assay.β-Catenin expression was localized using immunofluorescence assay.[Results]The expression of Wnt3a was verified in the Wnt3a transfected group compared with the control group.CCK-8 test indicated that the cell proliferating rate was significantly difference between the curcumin group and Wnt3a group（t=2.782，P=0.049）.The positive expression rate of PCNA protein in SRA 01/04 was 23.6%±4.0%in the curcumin group and 43.4%±5.4%in the Wnt3a group with a significant difference between them (t=2.951,P=0.018).After 48 hours of treatment with curcumin,the immunofluorescence was stronger in cell nucleus,and the expressions of cyclin D1 and c-Myc proteins were elevated in SRA 01/04 cells in wnt3a group,but he immunofluorescence was stronger in cytoplasm,and the expressions of cyclin D1 and c-Myc proteins were less in SRA 01/04 cells in curcumin group and controls.[Conclusion]Curcumin depressed the Wnt/β-catenin signaling pathway and downregulates the expression of a subset of target genes,including cyclin D1 and c-Myc,which plays an important role in inhibiting the proliferation of human LECs.

curcumin;Wnt3a;lens epithelial cell;Wnt/β-catenin signaling pathway;cell proliferation;posterior capsular opacification

R285.5

A

1672-1519（2016）12-0745-05

2016-08-26）

（本文編輯：馬 英，于春泉）

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.12.11

國家自然科學基金項目（81360145）。

包秀麗（1975-），女，醫(yī)學博士，主任醫(yī)師,主要從事白內(nèi)障的臨床和基礎(chǔ)研究。