宋冰++付永平+李勃++趙海濤++李丹++王丕武

摘 要：大豆是我國重要的糧油經(jīng)濟(jì)作物，是眾多行業(yè)中必需的原材料。鋅指蛋白是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，其中雙鋅指的植物C2H2型鋅指蛋白多數(shù)與植物的非生物脅迫相關(guān)，可以利用生物技術(shù)手段提高作物對非生物脅迫的耐受能力。該文利用生物信息學(xué)和同源克隆的方法克隆得到了大豆C2H2型鋅指蛋白基因STF-2，并且利用軟件對其蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析。

關(guān)鍵詞：大豆；鋅指蛋白；STF-2；結(jié)構(gòu)分析

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）03-04-18-03

Cloning and Structural Analysis of STF-2 Encoding a C2H2-type Zinc Finger Protein from Soybean

Song Bing1，2 et al.

（1Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2Jilin City Academy of Agricultural Sciences，Jilin 132101，China）

Abstract：Soybean（Glycine max[L.]Merrill）is the important food and oil crops of China which is the important raw materials of many industries.The zinc protein was an important transcription factors，and most plant C2H2-type zinc finger protein with the double zinc-finger structures related with adversity stress.It will offer a favorable condition to enhance the plants tolerance to adversity stress by the biotechnology. In this paper，a C2H2-type zinc finger protein gene STF-2 was isolated from soybean，and analyzed primary structure of the STF-2 by software.

Key words：Soybean；Zinc finger protein；STF-2；structural analysis

干旱、高鹽、低溫是限制植物生長發(fā)育的不利環(huán)境因子[1]。鋅指蛋白是轉(zhuǎn)錄因子的一種，其對植物的生長發(fā)育和非生物脅迫有著重要作用。根據(jù)以往的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，可將鋅指蛋白分為C4、C2H2、C6、C4HC3等類型，其中大部分類型的鋅指蛋白都屬于C2H2型[2-3]?？茖W(xué)家們已從擬南芥（Arabidopsis thaliana）、矮牽牛（Petuniahy brida Vilm）以及水稻（Oryzas ativa）等植物中克隆得到了多個(gè)與植物非生物脅迫相關(guān)的C2H2型鋅指蛋白基因。例如，能使轉(zhuǎn)基因煙草明顯提高對冷及高鹽耐受能力的擬南芥STZ基因[3，4]；能提升耐旱能力的矮牽?；騔PT2-3；張紅生等克隆得到的水稻鋅指蛋白基因RZF71、RZF5，能夠提高轉(zhuǎn)基因作物對滲透脅迫的耐受能力[3，5-6]；能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對低溫的耐受能力的大豆鋅指蛋白基因sCOF-1[7]。相比之下，從擬南芥、水稻、矮牽牛等作物中克隆得到的鋅指蛋白基因均有10個(gè)左右，而得到功能驗(yàn)證的大豆鋅指蛋白基因只有SCOF-1；GmZFP1是黃芳等克隆得到一個(gè)新的大豆C2H2型鋅指蛋白基因，分析后發(fā)現(xiàn)其只有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，推測與大豆的生長發(fā)育相關(guān)，與非生物脅迫無關(guān)[3，8]；白晶等從野生大豆中克隆得到了一個(gè)雙鋅指的C2H2型鋅指蛋白基因，但其氨基酸和核酸序列與sCOF-1同源性較高，且沒有進(jìn)行相應(yīng)的功能驗(yàn)證[9]。本文利用大豆基因組數(shù)據(jù)庫和相關(guān)生物信息學(xué)軟件，采用同源克隆的方法克隆得到了一個(gè)新的大豆C2H2型鋅指蛋白基因STF-2（GeneBank注冊號(hào)為：JQ74388），并利用生物信息學(xué)軟件對其蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑 選用本實(shí)驗(yàn)室自有品種“吉農(nóng)17”的種子，單粒種植于紙杯中，放入的氣候箱（15h光照/9h黑暗）中25℃培養(yǎng)10d至4葉期，隨后連續(xù)7d不予澆水進(jìn)行模擬干旱脅迫[3]，摘取處理后的大豆葉片，將其放入1.5mL離心管中，再放入液氮中以備大豆總RNA的提取。試驗(yàn)中所用的RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、克隆載體pMD18-T均購自大連寶生物（TaKaRa）公司，目的基因的引物序列由上海（生工）生物工程公司合成，大腸桿菌E.colid H5α購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 將之前液氮凍存在離心管中的大豆葉片樣品研磨粉碎，利用吸附柱式RNA提取試劑盒提取大豆的總RNA，再利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆肹3]。

1.2.2 目的基因STF-2的克隆 利用已知的SCOF-1的氨基酸序列為信息探針，在GeneBank中運(yùn)行tBlastn程序搜索對應(yīng)的氨基酸序列，從中預(yù)測出若干具有C2H2型鋅指蛋白結(jié)構(gòu)的大豆基因序列，本文選擇了一個(gè)命名為STF-2的基因進(jìn)行克隆和相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)分析。根據(jù)搜索出的cDNA序列再結(jié)合EST標(biāo)簽庫中的數(shù)據(jù)，利用軟件拼接得到STF-2的基因序列，以其為模板設(shè)計(jì)引物：STF-2F（5'-GCTCATCTACACTCATA-3'），STF-2R（5'-TGATGAAAACAATTGTTA-3'）用于后續(xù)的基因克隆。使用之前反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，克隆目的基因，PCR反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，48℃復(fù)性50s，72℃延伸50s，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，72℃后延伸10min，4℃保存[3]。經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將PCR產(chǎn)物回收純化后連接至pMD-18T載體上，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.colid H5α中，之后將菌液送由上海生工公司進(jìn)行測序。

1.2.3 染色體定位及蛋白結(jié)構(gòu)初步分析 利用軟件primer5.5對目的基因STF-2的引物序列進(jìn)行設(shè)計(jì)和分析，多個(gè)氨基酸序列的比較和系統(tǒng)發(fā)生樹采用的軟件是DNAMAN6.0和MEGA5.0。目的基因的染色體定位程序如下：首先，以STF-2的cDNA序列為搜索模板，在大豆基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.soybase.org）中運(yùn)行blast程序進(jìn)行比對，搜索得到目的基因在基因組中的具體位置，再分析目的基因在染色體上的遺傳距離，最后，根據(jù)染色體的物理圖譜將目的基因準(zhǔn)確的定位在大豆染色體上。利用在線生物信息學(xué)軟件InterProScan對蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 STF-2基因的克隆和染色體定位 根據(jù)軟件預(yù)測和拼接的STF-2的cDNA序列設(shè)計(jì)特異引物，利用RT-PCR的方法從大豆品種“吉農(nóng)17”中得到了大豆C2H2型鋅指蛋白基因STF-2，并用ORF Finder程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/）分析目標(biāo)序列確定其完整的開放閱讀框?yàn)?47bp，如圖1。利用DNAMAN6.0分析其氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)STF-2共編碼249個(gè)氨基酸，預(yù)測其等電點(diǎn)pI=8.23，分子量MW=26.7kDa。大豆基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.soybase.org）進(jìn)行blast比對，發(fā)現(xiàn)STF-2基因定位在大豆第10（O）條染色體的長臂上，目的基因全序列都包含在一個(gè)編號(hào)為Glyma10g40400的序列之中，軟件也自動(dòng)預(yù)測此基因序列編碼一個(gè)未知的C2H2型鋅指蛋白，其遺傳距離為117.2cm，再根據(jù)此序列的遺傳距離在10號(hào)染色體物理圖譜中確定其具體的位置，如圖2[3]。

2.2 STF-2蛋白的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 利用生物信息學(xué)軟件DNAMAN7.0將STF-2及水稻、擬南芥、矮牽牛、辣椒及大豆中典型的C2H2型鋅指蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對分析，結(jié)果表明，STF-2蛋白具有2個(gè)鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，且兩鋅指間相隔36個(gè)氨基酸殘基，并且氨基酸序列特征符合典型鋅指結(jié)構(gòu)所具有的氨基酸序列分布規(guī)律：Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His，鋅指結(jié)構(gòu)中都含有植物特有且保守的氨基酸序列QALGGH[3]。通過對氨基酸組成結(jié)構(gòu)的分析表明，STF-2蛋白具有典型的植物C2H2型功能結(jié)構(gòu)域，含有一個(gè)與亞細(xì)胞定位有關(guān)的核定位信號(hào)區(qū)NLS（也稱B-box），一個(gè)富含Leu的L-box，靠近C端的的DLN-box[10，11]，如圖3。利用MEGA5.0構(gòu)建出STF-2和其他典型的植物C2H2鋅指蛋白的系統(tǒng)分化樹，可以看出大豆鋅指蛋白STF-2與SCOF-1、ZPT2-1、ZPT2-3等鋅指蛋白均屬于含有2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的植物C2H2型鋅指蛋白，這些典型的的植物C2H2型鋅指蛋白基因都與植物的非生物脅迫相關(guān)，且都具有雙鋅指結(jié)構(gòu)，因此推測STF-2可能也與大豆非生物脅迫下的表達(dá)有關(guān)[3]，而STOP1、KNU等均為單鋅指的植物C2H2型鋅指蛋白，其大多與植物的生長發(fā)育相關(guān)，如圖4。利用InterProScan軟件對STF-2的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測分析，通過對其蛋白的保守區(qū)域的分析發(fā)現(xiàn)，其具有2個(gè)保守的鋅指結(jié)構(gòu)，紅色框選部位為其保守區(qū)域，更證實(shí)其為雙鋅指結(jié)構(gòu)的鋅指蛋白，如圖5。

3 討論

STF-2基因是通過同源克隆的方法獲得的，根據(jù)以往的報(bào)道，大多數(shù)植物C2H2型鋅指蛋白都沒有內(nèi)含子，經(jīng)過測序分析后發(fā)現(xiàn)STF-2也沒有內(nèi)含子[3，12]。通過各鋅指蛋白的氨基酸序列分析可以看出，STF-2氨基酸序列中具有2個(gè)典型的鋅指結(jié)構(gòu)，且其中都含有典型的植物所特有的氨基酸保守序列QALGGH，雖然STF-2基因與SCOF-1基因都來源于同一種作物，但二者的核酸序列相似性僅為54.35%，氨基酸相似性為44.31%。除了2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)外還有著相同的功能結(jié)構(gòu)域：與亞細(xì)胞定位有關(guān)的核定位信號(hào)區(qū)NLS（也稱B-box），富含Leu的L-box，與轉(zhuǎn)錄抑制活性相關(guān)的DLN-box，更可以證明STF-2是一個(gè)新的大豆C2H2型鋅指蛋白基因。通過對STF-2二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析表明，其2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)均由α螺旋和β折疊圍繞一個(gè)鋅離子構(gòu)成。鋅指蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子起到調(diào)控作用，主要通過鋅指結(jié)構(gòu)與DNA相結(jié)合，再調(diào)控下游基因的表達(dá)；經(jīng)過電荷分布情況的分析表明，STF-2的鋅指結(jié)構(gòu)帶有負(fù)電荷，而DNA具有正電荷，表明其可以與DNA相結(jié)合，這也是鋅指蛋白發(fā)揮作用的基礎(chǔ)，這一結(jié)果也與以往的報(bào)道相符[12]。

已知的植物C2H2型鋅指蛋白一部分類型參與了植物生長周期中的表達(dá)調(diào)控，另一部分則與逆境脅迫下基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。根據(jù)以往的研究可知：具有1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的植物C2H2型鋅指蛋白與植物的生長發(fā)育，尤其是生殖器官的發(fā)育有關(guān)，如典型的單鋅指基因SUPERMAN、PhSUPI、KNU等，而具有2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的植物C2H2型鋅指蛋白大多與各種非生物脅迫相關(guān)[3，11]，如典型的植物雙鋅指基因STZ/ZAT10、ZPT2-2、ZPT2-3、SCOF-1等[3，13]。研究人員發(fā)現(xiàn)：在干旱脅迫下，矮牽牛ZPT2-2被誘導(dǎo)表達(dá)，從而提高了轉(zhuǎn)基因植物的抗旱性。根據(jù)ZPT2-2的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對，科學(xué)家分離得到了ZPT2-3，經(jīng)過試驗(yàn)分析表明，ZPT2-3受低溫，干旱、茉莉酸和重金屬誘導(dǎo)并不受ABA誘導(dǎo)，且轉(zhuǎn)ZPT2-3基因的矮牽牛在20%的PEG6000溶液脅迫處理下，比對照表現(xiàn)出明顯的抗旱性[3，12]；系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)一步表明，STF-2基因與ZPT2-3、STZ、ZPT2-3、SCOF-1基因的都同屬雙鋅指結(jié)構(gòu)的植物C2H2型鋅指蛋白，軟件分析表明它們都具有相同的功能結(jié)構(gòu)域，因此推測STF-2是與非生物脅迫相關(guān)的C2H2型鋅指蛋白基因。研究表明，SCOF-1基因表達(dá)后，通過SGBF-1介導(dǎo)調(diào)控COR（低溫調(diào)控基因）的表達(dá)來提升轉(zhuǎn)基因植物的耐冷性[3，7]，但STF-2的調(diào)控機(jī)制還不清楚，具體的調(diào)控路徑和生物學(xué)功能還需要作進(jìn)一步的研究分析。

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（責(zé)編：張宏民）