郭松梅

(虎林市中心血庫(kù), 黑龍江　虎林　158499)

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血液乙肝病毒基因檢測(cè)

郭松梅

(虎林市中心血庫(kù), 黑龍江虎林158499)

全世界每年死于乙型肝炎病毒相關(guān)疾病的人數(shù)已達(dá)60萬(wàn)人，應(yīng)用熒光定量PCR法檢測(cè)能夠提高乙肝病毒基因的檢出率，正確掌握該技術(shù)方法能夠更加有效地進(jìn)行疾病診斷和預(yù)防工作?；诖?，研究針對(duì)熒光定量PCR法檢測(cè)乙肝病毒基因的方法進(jìn)行探討。

乙肝病毒；熒光定量PCR；檢測(cè)

乙型肝炎病毒簡(jiǎn)稱乙肝病毒，是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科，這是一種傳染性很強(qiáng)的病毒，它可以通過(guò)血液、精液和其他體液進(jìn)行傳播。基于8%個(gè)核苷酸序列的基因型之間的差異，乙型肝炎病毒已被分為10個(gè)基因型，從A到J[1]。全世界每年死于乙型肝炎病毒相關(guān)疾病至少有60萬(wàn)人，如慢性乙型肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌[2]。因此，該疾病的檢測(cè)與預(yù)防顯得尤為重要。乙肝病毒基因檢查的實(shí)驗(yàn)室診斷主要依賴于血清特異性抗原抗體檢測(cè)和乙肝病毒基因檢測(cè)。酶聯(lián)免疫方法一直是臨床診斷乙肝病毒感染的傳統(tǒng)手段；而乙肝病毒基因檢測(cè)則是采用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，能夠提高乙肝病毒基因的檢出率，為臨床診斷是否為乙肝病毒感染提供了一種強(qiáng)有力的手段。鑒于此，以下針對(duì)該技術(shù)方法進(jìn)行深入探討。

1　樣品與材料

1.1臨床樣本來(lái)源

將收集到的乙型肝炎病毒 HBsAg陽(yáng)性患者全血樣本及時(shí)處置。采血管3 000 r/min離心10 min后，無(wú)菌操作條件下分離血漿和血細(xì)胞。

1.2藥品和儀器

乙肝病毒血清標(biāo)志物ELISA檢測(cè)試劑盒、乙型肝炎病毒(HBV)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光定量檢測(cè)試劑盒、Thermo -80 ℃ 冰箱、移液器、高速低溫離心機(jī)、熒光定量PCR儀、電泳儀、酶標(biāo)儀、電熱恒溫水浴鍋、超凈臺(tái)、電熱恒溫水浴鍋、微波爐。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1血清標(biāo)志物檢測(cè)

應(yīng)用乙肝病毒血清標(biāo)志物ELISA檢測(cè)試劑盒，采用酶聯(lián)免疫法對(duì)乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝e抗原(HBeAg)、乙肝表面抗體(抗-HBs)、乙肝e抗體(抗-HBe)和乙肝核心抗體(抗-HBc)進(jìn)行檢測(cè)。

2.2DNA 定量檢測(cè)

應(yīng)用乙型肝炎病毒(HBV)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光定量檢測(cè)試劑盒，采用熒光定量PCR法檢測(cè)乙肝病毒DNA。

2.3基因組DNA提取

將200 μL待測(cè)血清、20 μL QIAGEN蛋白酶K，200 μL Buffer AL加入1.5 mL Eppendorf管中；混勻振蕩15 s。56 ℃ 溫育10 min。離心后加入200 μL無(wú)水乙醇，混勻振蕩15 s。將上述溶液全部轉(zhuǎn)至離心柱中，8 000 r/min 離心1 min，棄去廢液和離心管，換為新的離心管；向離心柱中加入500 μL Buffer AW1，8 000 r/min離心1 min，棄去廢液和離心管，換為新的離心管；向離心柱中加入500 μL buffer AW2，14 000 r/min 離心3 min，棄去廢液和離心管；將離心柱置于1.5 mL無(wú)菌EP管中，加入60 μL去離子水，室溫靜置1 min后，8 000 r/min 離心1 min。將收集到的DNA于-40 ℃保存待用。

2.4基因擴(kuò)增

引物設(shè)計(jì)完成后，設(shè)置基因組各基因片段PCR反應(yīng)條件如預(yù)變性、變性、退火、延伸、循環(huán)數(shù)、結(jié)束條件以及相應(yīng)參數(shù)進(jìn)行基因擴(kuò)增。

2.5PCR產(chǎn)物鑒定

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠，通過(guò)凝膠成像儀下觀察各擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶有無(wú)及大小，若擴(kuò)增片段大小與目的基因一致則擴(kuò)增成功。

2.6序列測(cè)定

將PCR擴(kuò)增成功的產(chǎn)物經(jīng)克隆后進(jìn)行測(cè)序。

3　結(jié)　果

對(duì)送檢的血清標(biāo)本進(jìn)行DNA熒光定量PCR測(cè)定，其HVB DNA陽(yáng)性者均能準(zhǔn)確檢測(cè)。

4　總　結(jié)

JACK等最近的研究表明,建立引物組可以提高乙肝病毒基因組檢測(cè)分析的靈敏度[2]。ROSA等[3]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在過(guò)去的五年中，低收入國(guó)家的乙型肝炎病毒(HBV)感染呈中度或高度的流行程度。由于乙型肝炎病毒的普遍接種方案開(kāi)始于九十年代，急性乙型肝炎和乙型肝炎表面抗原慢性攜帶者的患病率已降低。然而一些國(guó)家，仍無(wú)法實(shí)施這些方案，特別是在農(nóng)村地區(qū)的發(fā)病率較高。乙肝病毒感染的擴(kuò)散在少數(shù)低收入國(guó)家仍然很廣泛，預(yù)防、管理和治療乙肝病毒感染是政府和醫(yī)療機(jī)構(gòu)的沉重負(fù)擔(dān)[3]。因此廣泛推廣乙肝病毒檢測(cè)技術(shù)顯得尤為迫切，同時(shí)需要配合乙型肝炎病毒的預(yù)防接種工作[4-5]。

[1]JACK B C, WOON L T,YUN F N,et al.Universal primers for detection and sequencing of hepatitis B virus genomes across genotypes A to G[J]. J Clin Microbiol，2015，53(6): 1831-1835.

[2]MUSTAFA S. Hepatitis B virus genotypes: Global distribution and clinical importance[J]. World J Gastroenterol，2014，20(18): 5427-5434.

[3]ROSA Z, AORIANA B, CATERINA S, et al.Hepatitis B virus burden in developing countries[J]. World J Gastroenterol， 2015，21(42): 11941-11953.

[4]YURI C, MARTIN R, EIKE R.Hepatitis B virus large surface protein: function and fame[J]. Hepatobiliary Surg Nutr， 2015，4(1): 1-10.

[5]JASON L, LAURA F S, MICHAEL J B.Hepatitis B virus and microRNAs: Complex interactions affecting hepatitis B virus replication and hepatitis B virus-associated diseases[J]. World J Gastroenterol，2015，21(24): 7375-7399.

Detection of Hepatitis B virus Gene in Blood

GUO Songmei

(Hulin Central Blood Bank, Heilongjiang Hulin 158499, China)

At least 600 000 individuals worldwide annually die of hepatitis B virus (HBV)-related diseases.The detection rate of hepatitis B virus gene could be improved by using fluorescence quantitative PCR method, and correctly grasp the technical method can be more effective in disease diagnosis and prevention. Based on this, this study aimed to explore the method of detection of hepatitis B virus gene by fluorescence quantitative PCR method.

hepatitis B virus; fluorescence quantitative PCR; detection

1006-446X(2016)08-0068-03

2016 - 03 - 23

郭松梅(1975—)，女，副主任檢驗(yàn)技師，學(xué)士，主要從事輸血及病毒檢測(cè)研究。

R 512.62

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