高 靜 綜述，劉 新 審校

(沈陽醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，沈陽 110034)

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·綜 述·

噬菌體治療細(xì)菌性感染的研究進(jìn)展*

高 靜 綜述，劉 新△審校

(沈陽醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，沈陽 110034)

噬菌體； 細(xì)菌性感染； 多重耐藥菌

1915年，F(xiàn)rederick在研究牛痘病毒時(shí)，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌被殺死的現(xiàn)象，但尚未進(jìn)行深入研究[1]。1917年，F(xiàn)elix發(fā)現(xiàn)了一種能夠殺滅涂布在瓊脂表面上細(xì)菌并且呈現(xiàn)獨(dú)立噬斑的“微生物”，并認(rèn)為這種微生物可以侵入細(xì)菌內(nèi)并在其體內(nèi)擴(kuò)增，因此稱之為“噬菌體”。此后，噬菌體的研究拉開了帷幕。噬菌體被定義為一類能夠感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒。1921年，Bruynogh和Maisin首次利用噬菌體治療了由葡萄球菌引起的人類皮膚癤腫。在噬菌體研究的前十年里，研究者們因過多關(guān)注噬菌體的應(yīng)用而忽視了噬菌體的生物學(xué)特性。起初，研究者們?cè)谑删w中只檢測(cè)到蛋白質(zhì)，直到1936年，Schlesinger研究發(fā)現(xiàn)噬菌體中還存在DNA，這才證實(shí)了噬菌體是由核酸和蛋白質(zhì)組成的病毒顆粒。1940年，Ruska 首次用電鏡觀察到噬菌體的形態(tài)。隨后，陸續(xù)有研究者利用電鏡觀察到噬菌體的形態(tài)并得出了噬菌體的一般特征。噬菌體的生物學(xué)特性逐漸明了。近年來，隨著抗菌藥物的廣泛使用，出現(xiàn)了越來越多的難以用抗菌藥物治療的多重耐藥菌(MDR)，現(xiàn)已成為全球許多重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)一個(gè)迫在眉睫的醫(yī)療危機(jī)[2]。人們不得不將關(guān)注點(diǎn)轉(zhuǎn)向?qū)ふ铱咕幬锏奶娲煼?。于是，噬菌體療法成為了一個(gè)潛在的治療細(xì)菌感染的可行性方案。

1 噬菌體的類型及其生物學(xué)特性

噬菌體根據(jù)生活方式分為毒性噬菌體和溫和噬菌體[3]。毒性噬菌體又稱裂解性噬菌體，能夠在敏感菌中增殖并引起細(xì)菌裂解；溫和噬菌體又稱為溶原性噬菌體，感染細(xì)菌后，將其基因整合于細(xì)菌染色體中，不引起宿主菌裂解，隨宿主菌的繁殖將基因傳到子代。

當(dāng)噬菌體寄生在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)時(shí)，可呈現(xiàn)出不同的生活狀態(tài)。無論噬菌體處于何種生活狀態(tài)，在進(jìn)入細(xì)菌前，第一步都是先與細(xì)菌細(xì)胞壁上的受體結(jié)合。這個(gè)特定的過程會(huì)影響噬菌體與細(xì)菌的相互作用。例如，噬菌體λ僅與大腸桿菌的LamB受體相互作用，并且此作用對(duì)于噬菌體成功侵入細(xì)菌非常重要，即噬菌體具有特異性，僅選擇特異性受體才能侵入細(xì)菌[4]。

研究表明，某些噬菌體在與特異性受體作用之前，能合成水解酶或多糖分解酶系及多糖裂解酶，這些酶可以降解宿主菌的多糖，為噬菌體治療提供了潛在的意義，但目前尚在研究中，還未應(yīng)用于臨床[5]。

噬菌體在與特定的受體結(jié)合后，通過細(xì)菌的細(xì)胞壁打開缺口，然后把噬菌體DNA注入細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)，其蛋白質(zhì)外殼留在菌體外。如果是溫和噬菌體，噬菌體DNA插入到細(xì)菌的染色體上，成為細(xì)菌染色體的一部分，隨細(xì)菌繁殖而傳代。因此，溫和噬菌體不產(chǎn)生子代噬菌體，但這種噬菌體DNA隨著細(xì)菌DNA的復(fù)制進(jìn)行復(fù)制，直到誘發(fā)裂解周期。當(dāng)溫和噬菌體因發(fā)生變異而失去進(jìn)入裂解周期的能力，噬菌體DNA會(huì)成為細(xì)菌染色體的一部分，成為一個(gè)長(zhǎng)期寄住于宿主染色體的噬菌體序列，即前噬菌體。如果是毒性噬菌體，感染宿主菌后馬上進(jìn)行噬菌體早期基因的表達(dá)，噬菌體利用細(xì)菌的細(xì)胞器復(fù)制子代噬菌體的核酸和蛋白質(zhì)，然后組裝、釋放新合成的子代噬菌體。

噬菌體可通過轉(zhuǎn)導(dǎo)作用傳遞細(xì)菌之間的遺傳物質(zhì)，因此，可以利用生物工程技術(shù)將抗菌藥物敏感基因表達(dá)于目的菌中，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)移抗菌藥物敏感基因。例如，Lu等[6]的研究表明，在體外通過M13mp18噬菌體靶向SOS DNA修復(fù)系統(tǒng)插入特定基因，增加了大腸桿菌對(duì)抗菌藥物的敏感性。Edgar等[7]利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將特定的基因轉(zhuǎn)入耐藥菌內(nèi)，增加耐藥菌對(duì)鏈霉素和萘啶酸的敏感性。

2 噬菌體治療的潛在優(yōu)勢(shì)

毒性噬菌體是天然的抗菌藥物，能夠裂解細(xì)菌，可作用于革蘭陽性菌和革蘭陰性菌，包括耐藥菌。噬菌體具有嚴(yán)格的宿主專一性，不會(huì)破壞正常菌群，同時(shí)噬菌體的治療效果不因細(xì)菌耐藥性而改變[8]。

2.1 噬菌體治療的療效 噬菌體具有的高度的特異性和嚴(yán)格的宿主專一性，使噬菌體能夠有效控制細(xì)菌性感染。徐花等[9]在小鼠經(jīng)腹腔感染最小致死量(MLD)的黏質(zhì)沙雷菌后，立即給予的噬菌體治療能顯著提高小鼠的存活率。Kumari等[10]用肺炎克雷伯菌B5055建立全層燒傷創(chuàng)面感染的小鼠模型，分別應(yīng)用硝酸銀、慶大霉素和肺炎克雷伯菌噬菌體Kpn5治療，結(jié)果表明，單劑量的噬菌體Kpn5治療顯著降低了小鼠病死率，并且治療效果優(yōu)于硝酸銀和慶大霉素治療。

然而，由于噬菌體的高度特異性，使噬菌體具有較窄的宿主譜，限制了噬菌體治療。隨著研究的進(jìn)展，國(guó)內(nèi)外的一些研究人員利用多種噬菌體混合制劑(噬菌體雞尾酒)治療細(xì)菌感染，從而達(dá)到擴(kuò)寬宿主譜、提高治療效果的目的。例如，劉曉賀等[11]應(yīng)用噬菌體GH15和噬菌體K聯(lián)合治療由金黃色葡萄球菌感染引發(fā)的菌血癥小鼠，結(jié)果表明，噬菌體GH15和K聯(lián)合使用的治療效果優(yōu)于單一噬菌體治療。Tamariz等[12]通過皮下和靜脈接種的方式建立由耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)引起的局部和全身性感染的小鼠模型，然后，選用噬菌體雞尾酒法治療，結(jié)果表明，噬菌體雞尾酒法治療能有效控制局部的MRSA感染。

2.2 噬菌體治療細(xì)菌性炎癥 孫利利等[13]用金黃色葡萄球菌噬菌體對(duì)患有急性乳腺炎的奶牛進(jìn)行治療，結(jié)果表明，奶牛病灶內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量顯著下降，經(jīng)過治療，奶牛的炎癥得以治愈并恢復(fù)了正常的產(chǎn)奶能力。Miedzybrodzki等[14]對(duì)患有人工關(guān)節(jié)感染、皮膚和軟組織感染或下呼吸道感染的患者進(jìn)行噬菌體治療，他們的C-反應(yīng)蛋白(CRP)和白細(xì)胞計(jì)數(shù)最初沒有受到影響，而在第9～32天卻顯著減少。但研究中也發(fā)現(xiàn)，CRP初始水平高于10 mg/dL的患者的CRP才會(huì)受到影響[15]。

2.3 噬菌體治療的醫(yī)療成本 Miedzybrodzki等[16]選擇了6例被葡萄球菌感染患者作為研究對(duì)象，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染、耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌感染和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌感染，結(jié)果表明，噬菌體治療的治療費(fèi)用明顯低于抗菌藥物治療。這說明，噬菌體治療可以節(jié)省醫(yī)療費(fèi)用。

2.4 噬菌體治療的安全性 Rhoads等[17]進(jìn)行了一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，用噬菌體雞尾酒治療了42例因下肢慢性靜脈潰瘍而導(dǎo)致的由大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌引起的3種不同的細(xì)菌感染患者，并評(píng)價(jià)了噬菌體療法的安全性，未發(fā)現(xiàn)有關(guān)噬菌體治療的不良反應(yīng)。Abedon等[18]用單一的噬菌體噴霧處理大面積的燒傷部分，而遠(yuǎn)處的傷口作為對(duì)照組，結(jié)果沒有出現(xiàn)安全問題。國(guó)內(nèi)也有一些針對(duì)噬菌體的安全性的研究。張紅梅等[19]向小鼠體內(nèi)注射噬菌體D29，發(fā)現(xiàn)噬菌體D29未對(duì)機(jī)體的安全產(chǎn)生威脅。靳靜等[20]也通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了克雷伯菌屬噬菌體LH-01對(duì)小鼠具有良好的安全性。

以上研究尚未報(bào)告革蘭陰性菌噬菌體裂解宿主菌所產(chǎn)生的負(fù)面影響。雖然，小劑量的由革蘭陰性菌裂解釋放的內(nèi)毒素(LPS)作為特異性免疫刺激劑應(yīng)用時(shí)，可增強(qiáng)機(jī)體非特異性抵抗力，也有增強(qiáng)抗感染免疫和抗腫瘤免疫作用[21]，但一般情況下，因革蘭陰性菌裂解產(chǎn)生的LPS的危害確實(shí)存在。由于目前缺乏大型的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，因此還很難評(píng)估噬菌體治療的不良反應(yīng)和潛在的影響。

鑒于噬菌體治療的優(yōu)勢(shì)，人們將噬菌體治療視為后抗菌藥物時(shí)代治療細(xì)菌性感染的一種療法。現(xiàn)在已有研究者們利用噬菌體治療傷寒、痢疾、沙門氏菌引起的相關(guān)腸炎、腹膜炎、皮膚感染、外科感染(主要是各部位膿腫)、敗血癥、尿路感染及耳鼻咽喉感染。

3 噬菌體治療的局限性

雖然噬菌體治療有許多優(yōu)點(diǎn)，但噬菌體應(yīng)用于臨床治療仍需進(jìn)一步確定。噬菌體治療之所以沒有廣泛應(yīng)用于臨床治療，是因?yàn)榇睡煼ㄖ委熂?xì)菌感染有一定的局限性。

噬菌體治療的主要缺點(diǎn)是要先快速鑒定病原微生物。通過標(biāo)準(zhǔn)的微生物學(xué)鑒定程序，對(duì)臨床樣本進(jìn)行鑒定；然后，分離特定的噬菌體；最后，利用噬菌體對(duì)患者進(jìn)行抗菌治療。采用基因組方法和質(zhì)譜可能有助于新的細(xì)菌快速診斷方法。但目前，在大多數(shù)臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室和資源有限的基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)，還無法普及噬菌體治療。

噬菌體所具有的高度的特異性，使得噬菌體有一個(gè)狹窄的噬菌譜，僅限作用于單一物種或某個(gè)物種的單一菌株。溫和噬菌體不能引起細(xì)菌裂解，因此，噬菌體治療必須選擇毒性噬菌體。但毒性噬菌體在某些特定條件下可轉(zhuǎn)變?yōu)闇睾褪删w，這也是噬菌體治療所面臨的問題之一[22]。

在應(yīng)用噬菌體治療細(xì)菌感染時(shí)，宿主菌可能會(huì)對(duì)噬菌體產(chǎn)生抗性。細(xì)菌對(duì)噬菌體的抵抗機(jī)制可分為4類：(1)吸附抑制。細(xì)菌通過自身基因的突變，使受體發(fā)生一些變化，如受體缺失、掩藏受體和受體突變，來阻止噬菌體吸附；或者通過產(chǎn)生莢膜、黏液層等阻止噬菌體接近而逃避噬菌體。(2)流產(chǎn)感染。噬菌體將其DNA注入宿主菌內(nèi)，噬菌體的復(fù)制受到阻斷，沒有子代噬菌體的產(chǎn)生和釋放。(3)穿入阻滯。依靠細(xì)菌外膜上的錨定蛋白或膜蛋白來阻止噬菌體DNA的注入，編碼這些蛋白的基因常會(huì)在前噬菌體中發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌一旦具有了這些前噬菌體，就可抵抗同種噬菌體再次感染。(4)降解或干擾噬菌體DNA。限制-修飾系統(tǒng)可以保護(hù)細(xì)菌自身的DNA，識(shí)別細(xì)菌內(nèi)的外源DNA，并對(duì)其切割、降解。此外，細(xì)菌中的規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)(CRISPR)也可抵抗噬菌體[23-24]。同時(shí)，噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用和性菌毛的接合作用可能會(huì)在細(xì)菌之間發(fā)生基因轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致產(chǎn)生一種新的微生物甚至更多的耐藥菌[25-26]。

毒性噬菌體導(dǎo)致細(xì)菌裂解，細(xì)菌釋放出的各種物質(zhì)如革蘭陰性菌的LPS，可導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)。LPS進(jìn)入血循環(huán)后，機(jī)體出現(xiàn)LPS血癥，可使體溫上升、血液白細(xì)胞數(shù)驟減，嚴(yán)重時(shí)可引起LPS休克；嚴(yán)重者可活化凝血系統(tǒng)，出現(xiàn)彌散性血管內(nèi)凝血(DIC),引起皮膚和黏膜出血、滲血及內(nèi)臟廣泛出血，甚至死亡。因此，限制了噬菌體對(duì)革蘭陰性菌的治療。

噬菌體屬于病毒，在應(yīng)用于治療人類感染時(shí)，可能被患者的免疫系統(tǒng)視為一個(gè)潛在的入侵者，特別是噬菌體外殼的蛋白，會(huì)成為抗原刺激免疫系統(tǒng)的反應(yīng)，這使噬菌體進(jìn)入體內(nèi)后可能會(huì)迅速被脾臟、肝臟和其他器官的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，或被免疫細(xì)胞清除[27]。

4 展 望

隨著抗菌藥物耐藥性問題的日益嚴(yán)重，尋找抗菌藥物替代品治療細(xì)菌感染變得尤為重要。雖然在近百年前就有人進(jìn)行了噬菌體治療細(xì)菌感染的相關(guān)研究，如今人們又將視線聚焦于噬菌體的研究上，期待噬菌體自身的優(yōu)勢(shì)可以解決抗菌藥物治療所遇到的問題。盡管噬菌體治療細(xì)菌性感染有效，但仍有難題亟待解決，例如，如何保持噬菌體的穩(wěn)定性，如何準(zhǔn)確把握給藥時(shí)間、給藥劑量和給藥途徑，以及如何提高給藥的效率及安全性等[28]。對(duì)于噬菌體的不足，人們也試圖尋找解決的方法，如篩選裂解性強(qiáng)的噬菌體[29]；尋找具有寬噬菌譜的噬菌體[30]；通過基因工程尋找合適的轉(zhuǎn)基因噬菌體[31]；應(yīng)用噬菌體雞尾酒療法有效治療細(xì)菌感染等。隨著各種技術(shù)和方法的不斷改進(jìn)，相信噬菌體治療的不利因素會(huì)逐漸被克服。

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遼寧省科學(xué)事業(yè)公益研究基金項(xiàng)目(GY2013-A-014)；沈陽醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究基金項(xiàng)目(20135060)。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.033

A

1673-4130(2016)23-3325-03

2016-05-29

2016-08-19)

△通訊作者，E-mail:syliuxin141236@sina.cn。