姜　雙，徐海月

作者單位：(121000)中國遼寧省錦州市，錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院眼科

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·實驗研究·

碘酸鈉對小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)和功能變化的影響

姜雙，徐海月

作者單位：(121000)中國遼寧省錦州市，錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院眼科

Citation:Jiang S, Xu HY. Study on morphological and functional changes of mouse retina induced by NaIO3.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(6):1036-1038

摘要

目的：探討碘酸鈉鼠尾靜脈注射導(dǎo)致的C57BL/6J小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)和功能的變化。

方法：將60只6～8周齡C57BL/6J小鼠分為正常對照組和碘酸鈉組。碘酸鈉組經(jīng)鼠尾靜脈注射碘酸鈉(35mg/kg)，分別于注射后6h，1、3、5、8d進(jìn)行眼底照相、OCT和電生理檢測；正常對照組注射同等劑量的生理鹽水。所有小鼠摘除眼球制作石蠟切片進(jìn)行HE染色。

結(jié)果：正常對照組小鼠視網(wǎng)膜呈淡紅色，視盤呈黃色，視網(wǎng)膜血管呈放射狀走行。鼠尾靜脈注射碘酸鈉后6h即可見到眼底黃白色類似玻璃膜疣樣改變，但此時OCT和ERG尚無明顯變化。注射后1d，眼底改變加重，類玻璃膜疣的改變逐漸增加，OCT可見RPE層色素紊亂，光感受器和外核層受損。注射后3d，視網(wǎng)膜損傷進(jìn)一步加重，視網(wǎng)膜出現(xiàn)水腫，注射后5d水腫消失，視神經(jīng)變白，眼底病灶進(jìn)一步增多。注射后8d，RPE層、感光細(xì)胞層及外核層結(jié)構(gòu)破壞明顯，幾乎沒有正常結(jié)構(gòu)。在此過程中，ERG表現(xiàn)為a波、b波振幅下降，并呈時間依賴性加重。HE染色結(jié)果顯示，對照組小鼠視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列規(guī)則整齊，密度均勻。碘酸鈉組小鼠外層視網(wǎng)膜呈波浪狀改變，RPE層正常結(jié)構(gòu)消失，可見黑色圓形沉積物，隨時間延長，黑色沉積物逐漸增多，至注射后第8d時幾乎沒有正常RPE結(jié)構(gòu)。

結(jié)論：碘酸鈉經(jīng)鼠尾靜脈注射后，可以很好地模擬年齡相關(guān)性黃斑變性的發(fā)病過程，視網(wǎng)膜出現(xiàn)明顯的形態(tài)和功能變化，為年齡相關(guān)性黃斑變性的研究提供一個較好的動物模型。

關(guān)鍵詞：年齡相關(guān)性黃斑變性；碘酸鈉；光學(xué)相干斷層成像

引用：姜雙，徐海月.碘酸鈉對小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)和功能變化的影響.國際眼科雜志2016;16(6):1036-1038

0引言

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是一種神經(jīng)退行性疾病，是發(fā)達(dá)國家65歲以上人群致盲的主要原因[1]。AMD分為干性和濕性兩種，干性即AMD的早期階段，主要特點是在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層和Bruch膜內(nèi)存在異常代謝產(chǎn)物即玻璃膜疣(drusen)的沉積；濕性的主要特點是形成脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)。目前針對濕性AMD的治療主要是抗新生血管藥物的應(yīng)用，但對于干性AMD尚無確切有效的治療方法，而將疾病限制在早期階段、防止其發(fā)展為濕性對于提高患者的治療效果、減輕患者家庭及社會的經(jīng)濟(jì)壓力具有十分重要的意義。因此，找到適合研究干性AMD、簡單經(jīng)濟(jì)、可重復(fù)性強(qiáng)的動物模型迫在眉睫。

圖1不同時間點兩組小鼠眼底照相圖片A：正常對照組；B：碘酸鈉組6h；C：碘酸鈉組1d；D：碘酸鈉組3d；E：碘酸鈉組5d；F：碘酸鈉組8d。

圖2不同時間點兩組小鼠OCT圖片A：正常對照組；B：碘酸鈉組6h；C：碘酸鈉組1d；D：碘酸鈉組3d；E：碘酸鈉組5d；F：碘酸鈉組8d。

1材料和方法

1.1材料6～8周齡C57BL/6J雄性小鼠60只，體質(zhì)量為18～24g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。碘酸鈉粉末(NaIO3)購于索萊寶公司，戊巴比妥鈉粉(Sigma)，復(fù)方托吡卡胺滴眼液(參天制藥株式會社)，右旋糖酐羥丙甲纖維素滴眼液(愛爾康)。眼底照相和OCT檢測設(shè)備為Phoenix，電生理為重慶艾爾曦公司。

1.2方法

1.2.1碘酸鈉注射適應(yīng)性喂養(yǎng)1wk后，將實驗小鼠隨機(jī)分為兩組：正常對照組和碘酸鈉組，每組30只。造模前用PBS新鮮配置1%碘酸鈉，通過鼠尾靜脈注射1%碘酸鈉(35mg/kg)，對照組注射同等劑量的PBS。

1.2.2眼底照相和OCT檢測取正常對照組和注射后6h，1、3、5、8d的碘酸鈉組小鼠，1%戊巴比妥鈉(0.6mL/100g)腹腔麻醉，麻醉后固定小鼠，復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳，右旋糖酐羥丙甲纖維素滴眼液保護(hù)角膜，置于角膜接觸鏡前，調(diào)整進(jìn)光角度，進(jìn)行眼底照相和OCT檢測(正常對照組不分時間點)。

1.2.3 ERG檢測取正常對照組和注射后6h，1、3、5、8d的碘酸鈉組小鼠，檢測前暗適應(yīng)12h，1%戊巴比妥鈉(0.6mL/100g)腹腔麻醉，麻醉后固定小鼠，復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳，右旋糖酐羥丙甲纖維素滴眼液保護(hù)角膜，安放電極，進(jìn)行ERG檢測。

1.2.4 HE染色取正常對照組和注射后6h，1、3、5、8d的碘酸鈉組小鼠，麻醉后取眼球，4%多聚甲醛固定24h，梯度酒精脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，沿平行眼軸方向進(jìn)行切片，厚4μm，脫蠟、HE染色、脫水、透明并封片。

圖3不同時間點兩組小鼠ERG a波、b波振幅比較A：a波；B：b波。

2結(jié)果

2.1眼底照相和OCT檢測正常對照組小鼠視網(wǎng)膜呈淡紅色，視盤呈黃色，視網(wǎng)膜血管呈放射狀走行。碘酸鈉注射后6h視網(wǎng)膜即出現(xiàn)散在的黃白色滲出灶，類似玻璃膜疣(drusen)的改變，但OCT中尚沒有很大的變化。注射后1d，視網(wǎng)膜病灶逐漸增多，OCT可見RPE層出現(xiàn)數(shù)個高反射點。注射3d后可見視網(wǎng)膜出現(xiàn)水腫增厚，視網(wǎng)膜顏色呈灰白色，OCT可見RPE層色素紊亂，光感受器和外核層受損。注射后5d視網(wǎng)膜水腫消失，視網(wǎng)膜顏色恢復(fù)正常，視盤顏色變白，視神經(jīng)萎縮。注射后8d視網(wǎng)膜呈青灰色，布滿黃白色類“drusen”改變，OCT可見RPE層、IS-OS層消失，視網(wǎng)膜各層出現(xiàn)高反射點，視網(wǎng)膜變薄(圖1～2)。

2.2 ERG檢測結(jié)果碘酸鈉注射后6h開始出現(xiàn)ERG改變，主要表現(xiàn)為a波、b波振幅下降，并呈時間依賴性加重，注射后3d時a波和b波的振幅下降至正常時的1/2左右，到第8d時a波、b波振幅幾乎下降到正常時的1/3(圖3)。

圖4不同時間點兩組小鼠視網(wǎng)膜石蠟切片HE染色A：正常對照組；B：碘酸鈉組6h；C：碘酸鈉組1d；D：碘酸鈉組3d；E：碘酸鈉組5d；F：碘酸鈉組8d。

2.3 HE染色結(jié)果HE染色結(jié)果顯示，對照組小鼠視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列規(guī)則整齊，密度均勻。碘酸鈉組小鼠外層視網(wǎng)膜呈波浪狀改變，RPE層正常結(jié)構(gòu)消失，可見黑色圓形沉積物，隨時間延長，黑色沉積物逐漸增多，至注射后第8d時幾乎沒有正常RPE結(jié)構(gòu)(圖4)。

3討論

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是一種中心視功能損傷為主要表現(xiàn)的“不可避免盲”性的視網(wǎng)膜疾病，是發(fā)達(dá)國家老年人群視力嚴(yán)重下降，甚至致盲的首要原因[1]。干性AMD又稱萎縮性AMD，其早期表現(xiàn)為視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞內(nèi)脂褐素沉積、RPE與脈絡(luò)膜Bruch膜之間有玻璃膜疣形成；晚期表現(xiàn)為RPE細(xì)胞及光感受器細(xì)胞的地圖樣萎縮，部分患者可出現(xiàn)脈絡(luò)膜新生血管，并發(fā)展為濕性AMD，最終導(dǎo)致失明。干性AMD被認(rèn)為是疾病的早期階段，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，臨床上對其仍缺乏有效的預(yù)防和治療手段。近年來越來越多的研究集中于干性AMD，因此找到適合疾病研究、可重復(fù)性好的動物模型十分重要。

碘酸鈉是一種無機(jī)氧化劑，可以使視網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞重要的蛋白和DNA受到破壞，使細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，甚至發(fā)生損傷和死亡。碘酸鈉可以使視網(wǎng)膜抗氧化系統(tǒng)受損，視網(wǎng)膜SOD和CAT活性下降[2]。

國外已有多項研究采用碘酸鈉鼠尾靜脈注射模擬AMD的發(fā)病過程，所采用碘酸鈉的劑量有所不同[3-6]，有學(xué)者采用60mg/kg的碘酸鈉進(jìn)行鼠尾靜脈注射，其損傷迅速、程度嚴(yán)重，注射后6h視網(wǎng)膜即出現(xiàn)不可逆性改變。另有學(xué)者試圖采用小劑量的碘酸鈉造模，研究表明15mg/kg的碘酸鈉注射不能造成視網(wǎng)膜損害，而35mg/kg能導(dǎo)致視網(wǎng)膜出現(xiàn)高反射點，進(jìn)而外核層、IS/OS層結(jié)構(gòu)損害，而這種改變在損傷后3mo有一定的恢復(fù)[7]。同樣有學(xué)者試圖用10、20、30mg/kg的碘酸鈉進(jìn)行鼠尾靜脈注射，發(fā)現(xiàn)20mg/kg和30mg/kg的劑量導(dǎo)致視網(wǎng)膜出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的顯著改變，同時RPE特異性蛋白表達(dá)減少，而10mg/kg的劑量視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能未出現(xiàn)變化[8]。大多數(shù)學(xué)者都著重研究碘酸鈉導(dǎo)致的外層視網(wǎng)膜損害，也有學(xué)者關(guān)注了碘酸鈉導(dǎo)致的視網(wǎng)膜內(nèi)層的損害。Tao等[9]研究表明：碘酸鈉導(dǎo)致視網(wǎng)膜RPE層、感光細(xì)胞層損害后，后續(xù)就會出現(xiàn)內(nèi)層視網(wǎng)膜的損害。

基于前人研究結(jié)果和我們的預(yù)實驗結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)40～75mg/kg的給藥量視網(wǎng)膜反應(yīng)過于迅速，損傷嚴(yán)重，完全不可逆，對于研究疾病的治療效果不利。而15～30mg/kg的給藥量視網(wǎng)膜損傷較輕，視網(wǎng)膜變化不明顯，模型建立時間較長，不利于實驗的重復(fù)。因此，我們選擇了35mg/kg碘酸鈉進(jìn)行鼠尾靜脈注射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)35mg/kg的給藥量在注射后6h開始出現(xiàn)眼底的改變，在1d時出現(xiàn)OCT和電生理的改變，隨時間的進(jìn)展眼底形態(tài)和視功能改變逐漸加重，呈時間依賴性。與其他學(xué)者不同的是，我們在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜在注藥后第3d出現(xiàn)水腫，注藥后5d恢復(fù)，水腫恢復(fù)后視盤顏色蒼白，視神經(jīng)萎縮，這也加重了小鼠視功能的損害。小鼠視功能的變化從碘酸鈉注射后第1d開始，a波、b波振幅下降，且隨時間的延長逐漸降低，呈典型的時間依賴性。

本研究采用碘酸鈉進(jìn)行鼠尾靜脈注射，通過眼底形態(tài)學(xué)、功能學(xué)的觀察和組織切片的染色，模擬年齡相關(guān)性黃斑變性的發(fā)病過程，為進(jìn)一步研究AMD的發(fā)病機(jī)制和治療提供適合的動物模型。但本研究的觀察時間較短，未對其眼底改變進(jìn)行長期研究，同時沒有對碘酸鈉的作用機(jī)制進(jìn)行探討，這些都將在以后的實驗中進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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Study on morphological and functional changes of mouse retina induced by NaIO3

Shuang Jiang，Hai-Yue Xu

Department of Ophthalmology，the Third Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China

Correspondence to:Shuang Jiang. Department of Ophthalmology, the Third Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China.joa810121@126.com

Received：2016-03-01Accepted：2016-05-17

Abstract

?AIM: To characterize the effects of sodium iodate on mouse retinal morphology and function.

?METHODS: Sodium iodate at 35mg/kg (body weight) was administered by tail vein injection into adult 6-8wk C57BL/6J mice. Morphological and functional changes of the retina were assessed at 6h, 1, 3, 5 and 8d after injections by fundus imaging, optical coherence tomography (OCT), ERG and histology. Mice in control group were give tail vein injection of equivalent dose of normal saline. All the eyeballs were removed for paraffin section and H-E staining.

?RESULTS: The fundus photographs images at 6h after injection showed obvious changes, which were light red in retina and showed retinal blood vessels radial arranged. At 6h after injection, off-white drusen-like change was found at fundus. While there were no observable changes in OCT image and ERG. At 1d after injection, the fundus lesion aggravated and the drusen increased gradually. There were retinal pigment epithelial (RPE) disorders, photoreceptors and outer nuclear layer (ONL) damage through OCT. At 3d after injection, the retina lesion aggravated further and the retina became edema. At 5d after injection, the retina edema cleared away, the optic nerve became white and the fundus lesions increased. At 8d after injection, the RPE layer, photoreceptors and ONL were destroyed obviously. In the process, ERG showed the amplitudes of a- and b-wave decreased in a time-dependent manner. H-E staining showed that cells in retina of mice in control group were neatly arranged and well-distributed. The outer layer retina of sodium iodate injection group was wave-like, the normal structure of RPE disappeared and black round sediment could be seen which increased with time. At 8d after injection, there were any normal RPE.

?CONCLUSION: The tail vein injection of sodium iodate can well simulate the pathogenesis of age-related macular degeneration which can provide a good animal model for AMD.

KEYWORDS:?age-related macular degeneration; sodium iodate; optical coherence tomography

作者簡介：姜雙，博士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：眼底病。

通訊作者：姜雙.joa810121@126.com

收稿日期：2016-03-01 修回日期： 2016-05-17

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.6.08