譚婭，史開志，王婧，尚以順

(貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005)

豬鏈球菌病的檢測方法研究進(jìn)展

譚婭，史開志，王婧，尚以順*

(貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005)

豬鏈球菌病是一種重要的人畜共患病，對豬鏈球菌進(jìn)行快速而特異性檢測具有重要的流行病學(xué)意義和臨床應(yīng)用價值。文章分別對豬鏈球菌的微生物學(xué)檢測、免疫學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測方法進(jìn)行了綜述，以期為豬鏈球菌檢測提供參考。

豬鏈球菌;免疫學(xué)檢測方法;分子生物學(xué)檢測方法

豬鏈球菌病是由豬鏈球菌(Streptococcus suis，SS)引起。豬鏈球菌革蘭氏染色呈陽性，按其莢膜多糖不同可以分為35個血清型:1～34型和特殊型1/2型，其中1、2、1/2、7、9、14型等均具有致病性，以2型(SS2)致病能力最強(qiáng)，影響范圍最大。此外，仍有大量豬鏈球菌未分型。豬鏈球菌病是我國養(yǎng)豬業(yè)面臨的重大傳染病之一，此病分布范圍極廣，世界各地均有發(fā)生，并且發(fā)病急、病程短、死亡率高，各種年齡和品種的豬都可以發(fā)病，豬鏈球菌不僅可以侵入血液循環(huán)而造成肺炎、關(guān)節(jié)炎、淋巴結(jié)炎等，而且可以穿過血腦屏障和胎盤屏障導(dǎo)致腦膜炎及母豬流產(chǎn)［1］。同時豬鏈球菌2型通過傷口及呼吸道等途徑可以感染人，引發(fā)人的關(guān)節(jié)化膿性炎癥、腦膜腦炎及心內(nèi)膜炎等，嚴(yán)重的可致死亡，已被列為國家二類動物疫病。

目前對豬鏈球菌病的鑒定方法有微生物學(xué)鑒定、血清學(xué)鑒定及分子生物學(xué)鑒定等技術(shù)手段，生化鑒定方法一般作為補(bǔ)充。血清學(xué)的鑒定方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、協(xié)同凝集試驗(yàn)、毛細(xì)沉淀或平板凝聚試驗(yàn)，其中ELISA與協(xié)同凝集試驗(yàn)的應(yīng)用最為廣泛;分子生物學(xué)方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)、基因芯片技術(shù)、核糖體分型技術(shù)、分子伴侶(Cpn60)基因?qū)S進(jìn)行基因分群、隨機(jī)擴(kuò)增DNA片段多態(tài)性分析、脈沖場凝膠電泳等［2］。

1 微生物學(xué)方法

豬鏈球菌可根據(jù)細(xì)菌的形態(tài)、培養(yǎng)特性和生化特性等進(jìn)行鑒定。鏈球菌在顯微鏡下呈圓形或卵圓形，直徑小于0．2 μm，一般呈鏈狀或雙排列。革蘭氏染色陽性，除D群個別細(xì)菌外，均無鞭毛，多數(shù)有莢膜。血瓊脂平板上可長成直徑0．1～1．0 mm、灰白色、表面光滑、邊緣整齊的小菌落，多數(shù)致病菌株具有溶血能力，溶血環(huán)的大小和類型因菌株而異。凡具有α－溶血、淀粉酶陽性和V－P試驗(yàn)陰性的鏈球菌可認(rèn)為是豬鏈球菌。對于生化反應(yīng)，認(rèn)為鑒別意義較大的有:6．5%NaCl生長，精氨酸雙水解酶陽性，V－P試驗(yàn)陰性，乳糖、蔗糖、甘露醇、纖維二糖、水楊素、甘油和山梨醇均為陽性。

2 免疫學(xué)方法

2．1 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)

2．1．1 針對以全菌、莢膜多糖為抗原的間接ELISA方法所得結(jié)論不一。Vecht U等［3］利用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對豬鏈球菌2型致病菌株與非致病菌株進(jìn)行研究，試驗(yàn)結(jié)果表明，建立的2個DAS－ELISAs在診斷豬鏈球菌2型致病菌株方面具有快速、可靠、簡單等優(yōu)點(diǎn)，mrp和epf的DAS檢測結(jié)果與western blot的檢測結(jié)果幾乎一致。李明等［4］選用SEZ與SS2的全菌(WAC)、超聲波抗原(UA)、莢膜多糖(CPS)作為抗原，建立起檢測2種抗體的間接ELISA方法。通過比較發(fā)現(xiàn)，檢測SS2抗體的3種抗原中，CPS陽性率最高，特異性、穩(wěn)定性好，在診斷和流行病學(xué)調(diào)查方面有重要應(yīng)用價值。孫智遠(yuǎn)等［5］用酶標(biāo)SPA代替二抗，建立PPAELISA，并同時對豚鼠、家兔、豬血清進(jìn)行檢測，結(jié)果反應(yīng)靈敏，避免了使用多種二抗造成的麻煩，具有敏感性強(qiáng)、簡便、快速等優(yōu)點(diǎn)，適于基層養(yǎng)殖場大批豬血清樣品抗體水平的普查。徐敏等［6］以純化的原核表達(dá)的豬鏈球菌谷氨酸脫氫酶蛋白(GDH)為抗原，建立了檢測豬鏈球菌抗體的間接ELISA診斷方法，結(jié)果表明該方法特異性、敏感性和重復(fù)性均較好，適用于豬鏈球菌所有亞型的抗體檢測。大量的試驗(yàn)結(jié)果表明，ELISA方法操作簡便、經(jīng)濟(jì)、快速，且該方法在中國各級獸醫(yī)檢測部門已應(yīng)用多年，適合推廣應(yīng)用。

2．1．2 斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附法(Dot－ELISA)的原理與常規(guī)ELISA法相同，但該方法的操作更為簡單、快速，結(jié)果易于觀察，無需任何特殊的儀器設(shè)備，適用于基層獸醫(yī)及養(yǎng)殖場。歐瑜等［7］提純豬鏈球菌的毒力相關(guān)蛋白溶菌酶釋放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)并制備其抗體，用此抗體建立了Dot－ELISA和間接ELISA檢測法，對17株豬源鏈球菌和1株豬鏈球菌2型人分離株進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，2種ELISA的檢測結(jié)果一致，MRP和EF的陽性率均為61%(11/18)。李金海等［8］以高壓法提取抗原作為診斷抗原建立Dot－PPA－ELISA法用于檢測豬鏈球菌抗體。馮朝興［9］以HRP－SPA代替第二抗體，建立起Dot－PPA－ELISA用于聯(lián)合檢測豬瘟、豬鏈球菌、豬巴氏桿菌血清IgG。

2．2 膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)膠體金免疫層析技術(shù)是近十年來迅速發(fā)展的一種將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測技術(shù)、層析分析技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)和新材料技術(shù)等多種方法有機(jī)結(jié)合在一起的新型體外診斷技術(shù)。GICA具有簡單快速、結(jié)果明確、無需復(fù)雜操作技巧和特殊設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，已成為臨床及檢疫診斷領(lǐng)域發(fā)展的一個新方向。楊俊興等［10］用膠體金標(biāo)記葡萄球菌蛋白A(SPA)作探針，用純化的SS2 CPS和健康豬IgG分別作為檢測線試劑和對照線試劑，研制了一種SS2抗體快速檢測試紙條，用該試紙條檢測16份SS2感染康復(fù)豬血清抗體和24份SS2高免豬血清，試紙條檢測為100%陽性，與ELISA法檢測結(jié)果完全一致。鞠瑩等［11］用檸檬酸鹽還原法制備膠體金顆粒，標(biāo)記SS2多克隆抗體，通過免疫層析作用對SS2型進(jìn)行檢測，并對試紙條的敏感性、特異性、穩(wěn)定性進(jìn)行評價，確定膠體金最佳抗體標(biāo)記量為22 μg/mL，最佳包被抗體濃度為2 μg/mL，建立的膠體金免疫層析試紙條檢出SS2型的下限為106CFU/mL，從檢測到結(jié)果判斷時間為5～15 min，與其他常見致病菌及鏈球菌屬中15個群無交叉反應(yīng)，表明該法操作簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)，可用于SS的快速初篩和檢測。

2．3 熒光檢測技術(shù)免疫熒光技術(shù)是在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。于新和等［12］將所提取兔抗豬鏈球菌IgG用FITC標(biāo)記后并進(jìn)一步用G50過濾，制備出兔抗豬鏈球菌熒抗體。同時利用吸收試驗(yàn)、特異性抑制試驗(yàn)對自制的熒光抗體進(jìn)行了檢驗(yàn)。結(jié)果表明，利用自制熒光抗體進(jìn)行鏈球菌病的診斷可在2～3 h內(nèi)對鏈球菌作出診斷，比直接鏡檢更具有特異性和敏感性。武紅敏等［13］通過合成具有高發(fā)光效率的巰基乙酸修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)，制備基于豬鏈球菌2型的重要致病毒力相關(guān)因子——溶菌酶釋放蛋白(MRP)抗體的CdSe/ZnS量子點(diǎn)熒光探針，利用這種探針建立起1種檢測MRP抗原的新方法，該方法的線性檢測范圍為5．0×10－8～1．5×10－6mol/L，檢測限為1．9×10－8mol/L，為豬鏈球菌病的檢測提供了一種新方法。

3 分子生物學(xué)方法

3．1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

3．1．1 PCR是近年來畜禽疾病診斷的常用技術(shù)，具有很強(qiáng)的特異性和高度敏感性。谷氨酸脫氫酶(gdh)、莢膜多糖(cps2J)、溶菌酶釋放蛋白(mrp)、胞外因子(epf)、溶血素(sly)、纖連蛋白/血纖蛋白原結(jié)合蛋白(fpbs)和毒力相關(guān)序列orf2等具有特異性，在SS不同分離菌株間有一定保守性。為檢測所有血清型或致病性菌株，Okwumabua等［14］根據(jù)2型菌株sly序列設(shè)計(jì)引物建立了PCR方法，但試驗(yàn)結(jié)果顯示該法不能檢出所有血清型或致病性菌株。依賴2型菌株gdh序列設(shè)計(jì)引物可建立SS分型PCR，能特異性地檢測SS所有血清型菌株［15］。由于莢膜多糖是SS 35個血清型鑒別的直接依據(jù)，Smith HE等［16］針對SS主要致病菌株莢膜基因的DNA序列設(shè)計(jì)引物，建立了血清型特異性PCR鑒定方法。

3．1．2 多重PCR能夠同時擴(kuò)增不同片段，具有普通PCR方法不可比擬的優(yōu)勢。Sliva LM等［17］根據(jù)gdh、cps基因序列設(shè)計(jì)引物，可鑒定SS并進(jìn)行分型，還首次證實(shí)了cps9菌株的毒力相關(guān)基因。聶小想等［18］建立了多重PCR檢測體系實(shí)現(xiàn)了對SS毒力相關(guān)因子基因mrp、epf和sly的同步檢測。對16株種屬背景明確的試驗(yàn)菌株及14株豬臨床分離的鏈球菌樣本進(jìn)行檢測分析，結(jié)果16株SS中mrp檢出率為25%，epf檢出率為12．5%，sly檢出率為31．2%，陰性對照毒力因子檢測結(jié)果均為陰性。

3．1．3 實(shí)時熒光定量PCR(Q－PCR)能夠方便、快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行病原體的檢測。利用Q－PCR檢測病原體可以判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)，以及解決抗體檢測不能判定是現(xiàn)癥感染還是既往感染的疑難診斷問題。孫洋等［19］以莢膜抗原編碼基因簇中的特異性基因cps2J為靶基因，建立了豬鏈球菌2型的SYBR Green熒光實(shí)時定量PCR檢測方法。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，實(shí)現(xiàn)了對目的菌的實(shí)時定量檢測。該方法能夠準(zhǔn)確反映出感染或污染的強(qiáng)度，在很大程度上避免了假陽性的檢測結(jié)果，進(jìn)一步完善了豬鏈球菌的檢測方法。

3．2環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)LAMP技術(shù)是一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，因其具有特異性強(qiáng)、敏感性高、簡單、快捷及不需要昂貴的儀器設(shè)備等特點(diǎn)，受到了研究者的高度關(guān)注。朱水榮等［20］根據(jù)SS2中國分離株89K毒力島中基因序列設(shè)計(jì)4條引物，應(yīng)用LAMP技術(shù)對21株SS2、18株其他鏈球菌、9株葡萄球菌、5株其他菌株及49份未知樣本進(jìn)行檢測，并對LAMP的最低檢測限進(jìn)行測試，通過肉眼目測或電泳檢測結(jié)果，并將結(jié)果與PCR/定量PCR結(jié)果比較，結(jié)果表明，該方法僅對含89K毒力島的中國SS2特有株檢測為陽性，而其他菌株經(jīng)LAMP檢測均為陰性，表明建立的方法特異性好，其最低檢測限為24CFU/反應(yīng)。應(yīng)用建立的方法對49份不同來源樣本進(jìn)行檢測，其中32份不明發(fā)熱病人呼吸道咽拭子應(yīng)急樣本及15份正常豬扁桃體咽拭子樣本經(jīng)檢測89K毒力島基因均為陰性，2份疑似SS2病人血液應(yīng)急樣本中1份檢測到該毒力島基因，該結(jié)果與普通PCR/定量PCR檢測結(jié)果一致。張鳳玉等［21］建立針對高致病性SS2 89K毒力島Ⅳ型分泌系統(tǒng)的LAMP方法并進(jìn)行了優(yōu)化，其檢測靈敏度為1．53×10－1拷貝/反應(yīng)，全部擴(kuò)增檢測可在60 min內(nèi)完成，可用于高致病性SS2快速檢測。

3．3 基因芯片技術(shù)基因芯片是通過將大量核酸探針以微列陣固定于支持物上，當(dāng)熒光標(biāo)記的靶分子與芯片上的探針分子結(jié)合后，可通過檢測熒光信號強(qiáng)度來分析獲得待檢樣本的基因信息，因而可實(shí)現(xiàn)高通量、多靶基因的檢測和分析。隨著大量病原微生物基因組序列測定的完成，基因芯片在致病微生物快速檢測中得到廣泛應(yīng)用。鄭峰等［22］根據(jù)SS cps1(檢測SS1和SS14)、cps2(檢測SS2和SS1/2)及cps9基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)型特異性寡核苷酸探針，達(dá)到了對SS主要致病血清型的鑒別，而針對不同菌株設(shè)計(jì)的特異性探針未獲得預(yù)期檢測效果。該芯片體系作為一種檢測SS種、致病血清型和毒力因子的新方法，具有較好的特異性和敏感性，對于高通量鑒定SS菌種及其毒力有重要價值。

3．4 利用核糖體(16S)基因和分子伴侶(Cpn60)基因分型技術(shù)

3．4．1 核糖體分型技術(shù)(Ribotyping)是在RFLPDNA印跡的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的1個分型方法。菌體16S rRNA具有群間特異性，且其序列高度保守，可以為細(xì)菌的診斷及流行病學(xué)調(diào)查提供幫助。而核糖體分型技術(shù)就是選用細(xì)菌核糖體中16S和23S rRNA為雜交探針。Staats JJ等［23］運(yùn)用核糖體分型技術(shù)對豬鏈球菌毒力進(jìn)行研究，經(jīng)DNA提取、酶切、電泳分離、DNA印跡后，用地高辛標(biāo)記的16S、23S rRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA作探針雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法能同時區(qū)分SS2菌株與非致病菌株。

3．4．2 Chatellier［2］測定了豬鏈球菌35個血清型的16S rRNA序列，并對16S rRNA序列進(jìn)行了相似性分析，結(jié)果顯示各菌株之間的相似程度在93．94%～100%之間。除去親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的32、33、34型，另外的32個血清型可定為1個群。根據(jù)基因的差異，該群32個血清型的32株細(xì)菌可進(jìn)一步分成3個簇。這32個血清型16S rRNA的48～91 bp為高變區(qū)，92～1 468 bp是高度保守區(qū)。雖然不同種鏈球菌16S rRNA的差異堿基集中在相對狹小的高變區(qū)，但堿基的差異確實(shí)存在，而且16S rRNA序列的變化與分離地域、來源動物的健康狀況等無關(guān)，所以根據(jù)16S rRNA序列設(shè)計(jì)引物，先快速地鑒定SS，然后再結(jié)合其他型特異性引物進(jìn)一步鑒定基因分型，此方法己被廣泛應(yīng)用。

3．4．3 分子伴侶(Cpn60)基因具有普遍存在性，高保守性和部分變異性，可進(jìn)行SS進(jìn)行基因分群，應(yīng)用于分子診斷和分子鑒別。Brousseau R等［24］將豬鏈球菌35個血清型編碼的Cpn60的基因進(jìn)行擴(kuò)增、測序，Cpn60部分基因分析結(jié)果顯示，35個血清型Cpn60基因的分群結(jié)果與16S rRNA的分群結(jié)果相同。Cpn60的系統(tǒng)進(jìn)化樹與16S rRNA的系統(tǒng)進(jìn)化樹相似，同樣也出現(xiàn)了群聚，所以該方法也能從鏈球菌屬中鑒別出豬鏈球菌，并且還可以根據(jù)Cpn60的高變區(qū)進(jìn)一步設(shè)計(jì)特異性引物，為快速鑒定血清型提供可靠的方法。

3．5 脈沖場凝膠電泳(PFGE)脈沖場凝膠電泳是通過酶切細(xì)菌基因組，然后對酶切片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，不斷改變電場方向，從而在凝膠上獲得多態(tài)性DNA圖譜。PFGE以其重復(fù)性好、分辨力強(qiáng)而被譽(yù)為細(xì)菌分子生物學(xué)分型技術(shù)“金標(biāo)準(zhǔn)”。PFGE在分離酵母染色體獲得成功，隨后就應(yīng)用于診斷領(lǐng)域。在國內(nèi)，田云［25］為了尋找區(qū)分豬鏈球菌7型菌株的毒力株和弱毒力株的方法，對54株7型豬鏈球菌(包括24株核糖型2分離株)進(jìn)行了遺傳多樣性分析，共發(fā)現(xiàn)了50種PFGE型。可被劃分為A和B 2個群落，群落B可以被進(jìn)一步劃分為3個亞群(B1、B2和B3)。王麗麗等［26］利用PulseNet技術(shù)優(yōu)化豬鏈球菌PFGE分子分型方法，提出新的分析方案，包括膠塊的制備、內(nèi)切酶的選擇、電泳條件等。此優(yōu)化后的PFGE較原方法所需時間短、圖像清晰，更具有可重復(fù)性，基本具備推廣的條件。

4 結(jié)語

豬鏈球菌分型多并且在臨床上易發(fā)生與其他疾病混合感染，對我國養(yǎng)豬業(yè)影響重大，在生產(chǎn)實(shí)踐中，可將以上幾種方法結(jié)合起來使用，用于確診，對于豬場暴發(fā)豬鏈球菌病進(jìn)行及時診斷及防控研究具有積極意義。盡管對豬鏈球菌的鑒別診斷研究取得了一定進(jìn)展，仍有許多問題有待進(jìn)一步研究，如能否找到豬鏈球菌致病株特異性的毒力因子，盡早制造出可以對豬鏈球菌進(jìn)行有效預(yù)防的基因工程疫苗，以及對豬鏈球菌耐藥性機(jī)理的進(jìn)一步探索。

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The Research Progress of Streptococcus suis Detection Methods

Tan Ya，Shi Kaizhi，Wang Jing，Shang Yishun*
(Guizhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Guiyang Guizhou 550005，China)

Streptococcus suisis a severe zoonosis in pig industry，and the rapidity as well as specificity of detection is not onlyimportantin epidemiology but also valuable in clinical application．In our review，we summarized three methods to detect Streptococcus suis，that is microbiological detection，immunological detection and molecular biological detection．All these may provide reference methods to Streptococcus suis detection．

Streptococcus suis;Immunological Detection;Molecular Biological Detection

S858．28

A

1007－1474(2016)06－0018－05

2016－09－22

科研機(jī)構(gòu)服務(wù)企業(yè)行動計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合服企［2015］4003號);貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(黔科合NY［2013］3072號);貴州省現(xiàn)代生豬產(chǎn)業(yè)體系建設(shè)項(xiàng)目(GZCYTX2015－09)

譚婭(1989—)，女，碩士，主要從事豬遺傳與分子育種。

*通訊作者:尚以順(1969—)，男，研究員，碩士，主要研究方向?yàn)椴輼I(yè)科學(xué)和豬遺傳育種以及疫病防治。