張雙翔，胡興義，唐宇，冉隆仲，李濤，王慧

(1．貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽(yáng) 550001;2．貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025;3．貴州省畜禽遺傳資源管理站，貴州 貴陽(yáng) 550001)

貴州省仔豬病毒性腹瀉病原學(xué)調(diào)查

張雙翔1，胡興義2，唐宇3，冉隆仲1，李濤1，王慧1

(1．貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽(yáng) 550001;2．貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025;3．貴州省畜禽遺傳資源管理站，貴州 貴陽(yáng) 550001)

為了解貴州省仔豬病毒性腹瀉病原流行情況，對(duì)2013—2015年貴州省7個(gè)市(州)采集的35個(gè)規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)316份仔豬腹瀉糞便樣品進(jìn)行病原核酸檢測(cè)。結(jié)果顯示，各地均存在豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬輪狀病毒(PoRV)感染，PEDV陽(yáng)性率為62．43%，TGEV陽(yáng)性率為7．91%，PoRV陽(yáng)性率為11．76%。不同病原在不同地區(qū)呈顯著流行趨勢(shì)，且存在不同程度的混合感染，PEDV與PoRV混合感染率為18．04%，PEDV與TGEV混合感染率為5．06%，TGEV與PoRV混合感染率為3．80%，PEDV、TGEV與PoRV混合感染率為1．90%，近3年主要流行病原為PEDV。為臨床防控仔豬病毒性腹瀉發(fā)生提供了理論依據(jù)。

仔豬腹瀉;豬流行性腹瀉病毒;豬傳染性胃腸炎病毒;豬輪狀病毒;病原學(xué)調(diào)查

仔豬病毒性腹瀉主要是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、豬輪狀病毒(Porcine rotavirus，PoRV)單獨(dú)或混合感染引起所致［1］。各年齡階段的豬群均易感染，其中對(duì)哺乳仔豬的危害最為嚴(yán)重，病死率最高［2］。這3種病毒引起的發(fā)病豬病理變化和臨床癥狀極其相似，并常存在混合感染，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［3］。

自2010年冬季以來(lái)，我國(guó)各省養(yǎng)殖場(chǎng)(戶)的仔豬連續(xù)發(fā)生以腹瀉為主要臨床癥狀的疫病，大量研究報(bào)道表明多種病原與當(dāng)前的疫情有關(guān)，并且藥物治療效果較差［4，5］。本研究對(duì)2013—2015年全省7個(gè)市(州)采集的35個(gè)規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)316份仔豬腹瀉糞便樣品進(jìn)行病原核酸檢測(cè)，以了解仔豬病毒性腹瀉病原地方流行情況，為防控腹瀉疫病發(fā)生提供可靠依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 腹瀉病料于2013—2015年采自貴州省7個(gè)市(州)35個(gè)規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)，臨床表現(xiàn)腹瀉癥狀仔豬1～10日齡糞便樣品共計(jì)316份，置于－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2 主要試劑總RNA提取試劑盒、DNA Marker，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;Prime ScriptR One Step RT－PCR kitVer．2，購(gòu)自TaKaRa公司。

1．3 引物設(shè)計(jì)參照GenBank上登錄的PEDV S基因(登錄號(hào):AF－353511)、TGEV S基因(登錄號(hào):FJ755618)、PoRV VP7基因序列(登錄號(hào):X04613)，按參考文獻(xiàn)［4］設(shè)計(jì)3對(duì)引物(見(jiàn)表1)，由英維捷基(上海)生物工程有限公司合成。

表1 引物序列

1．4 樣品檢測(cè)取一定量小腸內(nèi)或剛排出的新鮮糞便加入pH 7．2的滅菌PBS，反復(fù)凍融2～3次，12 000 r/min 2 min，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，最后加入洗脫液25 μL，13 000 r/min 1 min，收集管中產(chǎn)物即為提取總RNA。建立20 μL反應(yīng)體系，以設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，反應(yīng)件為:50℃30 min，95℃3 min，循環(huán):94℃30 s、60℃30 s、72℃30 s，35個(gè)循環(huán);72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1．0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果

2．1 陽(yáng)性樣本一步法RT－PCR擴(kuò)增結(jié)果以PEDV、TGEV及PoRV陽(yáng)性樣品為模板，采用一步法RT－PCR方法分別進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2、圖3，PEDV、TGEV及PoRV 3種病毒陽(yáng)性病料RTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期大小一致，表明檢測(cè)方法有效可行。

圖1 PEDV

圖2 TGEV

圖3 PoRV

2．2 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果采用3對(duì)檢測(cè)引物對(duì)316份病料樣品進(jìn)行RT－PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示:PEDV陽(yáng)性率為62．34%(197/316)，TGEV陽(yáng)性率為7．91%(25/316)，PoRV陽(yáng)性率為11．76%(37/316);PEDV發(fā)病率最高是黔南州，TGEV發(fā)病率最高是黔東南州，PoRV發(fā)病率最高是黔南州(見(jiàn)表2)。

表2 臨床病料樣品的RT－PCR檢測(cè)結(jié)果

2．3 3種病毒混合感染調(diào)查結(jié)果對(duì)采集的316份發(fā)病仔豬腹瀉糞便樣本進(jìn)行TGEV、PEDV和PoRV混合感染情況分析。結(jié)果顯示，引起貴州省仔豬病毒性腹瀉的病原除PEDV外，PEDV還與其他病毒混合感染，其中與PoRV混合感染率最高為18．04%，與TGEV混合感染率為5．06%，3種病原混合感染率為1．90%(見(jiàn)表3)。

表3 TGEV、PEDV和PoRV混合感染情況調(diào)查結(jié)果

2．4 不同時(shí)間PEDV、TGEV和PoRV病原核酸檢測(cè)結(jié)果對(duì)采集的316份發(fā)病仔豬腹瀉糞便樣本進(jìn)行PEDV、TGEV和PoRV病原檢測(cè)。結(jié)果顯示，近3年貴州省TGEV的陽(yáng)性率依次為7．50%、6．72%、9．15%，呈上升趨勢(shì);PEDV的陽(yáng)性率依次為90．00%、56．72%、59．86%，呈下降趨勢(shì);PoRV的陽(yáng)性率依次為15．00%、9．70%、12．68%。通過(guò)比較得出近3年貴州省仔豬病毒性腹瀉主要以PEDV為主(見(jiàn)表4)。

表4 不同時(shí)間TGEV、PEDV和PoRV病原核酸檢測(cè)結(jié)果

3 討論

3．1 仔豬腹瀉的普遍存在是導(dǎo)致仔豬成活率不高的重要因素，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展造成嚴(yán)重危害［6，7］。尤其自2011年冬季以來(lái)，仔豬病毒性腹瀉在貴州省部分豬場(chǎng)暴發(fā)，損失嚴(yán)重。本研究對(duì)貴州省2013—2015年從貴陽(yáng)、遵義、黔南等7個(gè)市(州)豬場(chǎng)采集腹瀉仔豬新鮮糞便進(jìn)行TGEV、PEDV和PoRV 3種病毒檢測(cè)。結(jié)果顯示，TGEV、PEDV和PoRV的陽(yáng)性率分別為7．91%、62．43%、11．76%，PEDV與TGEV混合感染率為5．06%，PEDV與PoRV混合感染率為18．04%，TGEV與PoRV混合感染率為3．80%，TGEV、PEDV和PoRV 3種病毒混合感染率為1．80%。

3．2 劉云波等［8］2013年對(duì)全國(guó)13個(gè)省1 282份臨床腹瀉糞便進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，TGEV、PEDV及PoRV的陽(yáng)性感染率分別為2．65%、24．49%、3．20%;郭旋等［9］對(duì)2011—2012年廣西自治區(qū)部分規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)的調(diào)查得出，TGEV、PEDV及PoRV的陽(yáng)性感染率分別為0、37．50%、0．03%。這些研究與本研究均表明PEDV仍是引起仔豬病毒性腹瀉的主要病原。本研究顯示較全國(guó)以及其他省的調(diào)查結(jié)果，PoRV的感染率出現(xiàn)了明顯的上升趨勢(shì)，這可能與本研究采樣的豬場(chǎng)均未免疫三聯(lián)弱毒疫苗有關(guān)。

3．3通過(guò)本調(diào)查表明，貴州省不同地區(qū)的腹瀉豬場(chǎng)均有不同程度的PEDV感染，該病原的感染多在冬春季，不同地區(qū)和時(shí)間TGEV、PEDV和PRoV的感染率均有不同，表明寒冷是激發(fā)仔豬發(fā)生腹瀉的重要因素之一。提示豬場(chǎng)管理人員在寒冷季節(jié)應(yīng)加強(qiáng)仔豬飼養(yǎng)管理，提高舍內(nèi)溫度。

［1］田沖，歐陽(yáng)金旭，等．仔豬病毒性腹瀉的流行病學(xué)研究進(jìn)展［J］．長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2013(5):57－60，63．

［2］Sun Rui－qin，Cai Ru－jian，Chen Ya－qiang，et al．Outbreak of porcine epidemic diarrhea in sucking piglets，China［J］．EmergInfect Dis，2012，18(1):161－163．

［3］Ben Salem A N，Chupin Sergei A，Bjadovskaya Olga P，et al．Multiplex nested RT－PCR for the detection of porcine enteric viruses［J］．J Virol Methods，2010，165(2):283－293．

［4］Pan Yong－fei，Tian Xiao－yan，Liu Wei，et al．Isolation and characterization of a variant porcine epidemic diarrhea virus in China［J］．Virol J，2012，12(9):195．

［5］陳蕾，朱玲，李松，等．豬流行性腹瀉病毒VP1基因的克隆及生物信息學(xué)分析［J］．中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2012，34(12):1254－1258．

［6］韓淑芳．仔豬病毒性腹瀉研究進(jìn)展［J］．北京農(nóng)業(yè)，2014(36):163．

［7］李松華．仔豬病毒性腹瀉的特點(diǎn)和防控措施［J］．湖北畜牧獸醫(yī)，2012(2):21－23．

［8］劉云波，趙洪翠，王志成，等．豬病毒性腹瀉分子流行病學(xué)調(diào)查［J］．中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2013，40(2):204－207．

［9］郭旋，陳靜，劉歡，等．廣西仔豬腹瀉病毒病原流行病學(xué)調(diào)查［J］．南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，44(1):155－160．

The Etiological Investigation on Viral Diarrhea of Piglets in Guizhou Province

Zhang Shuangxiang1，Hu Xingyi2，Tang Yu3，Ran Longzhong1，Li Tao1，Wang Hui1
(1．Animal Disease Prevention and Control Center in Guizhou Province，Guiyang Guizhou 550001，China;2．College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang Guizhou 550025，China;3．Guizhou Province Station for Livestock Genetic Resources Management，Guiyang Guizhou 550001，China)

We wished to understand the epidemic situation of piglet viral diarrhea in Guizhou province，in 35 large－scale pig farms in 7 cities(state)collected to detect pathogenic nucleic acid on 316 fecal samples of piglets during the year of 2013 to the year of 2015 in Guizhou province．The investigation results display that porcine epidemic diarrhea virus(PEDV)，transmissible gastroenteritis virus(TGEV)and porcine rotavirus(PoRV)infection in different regions，the positive rate of PEDV is on 62．43%，TGEV on 7．91%and PoRV on 11．76%．Different pathogens showed significant trends in different regions，and there are different levels of mixed infection，the mixed infection rate PEDV with PoRV is on 18．04%，PEDV with TGEV on 5．06%，TGEV with PoRV is on 3．80%，PEDV，TGEV with PoRV is on 1．90%，In the past 3 years，the main epidemic pathogen was PEDV．The investigation that provides a theoretical basis for the prevention and control of viral diarrhea in piglets．

Piglet Diarrhea;Porcine Epidemic Diarrhea Virus(PEDV);Transmissible Gastroenteritis Virus(TGEV);Porcine Rotavirus(PoRV);Etiological Investigation

S858．28

A

1007－1474(2016)06－0008－03

2016－09－19

貴州省科學(xué)技術(shù)廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(黔科合NY［2015］3009－1號(hào));“貴州省動(dòng)物疫病防控與獸醫(yī)公共衛(wèi)生保障科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)”(黔科合人才團(tuán)隊(duì)［2015］401號(hào)6)

張雙翔(1987—)，男，獸醫(yī)師，碩士，從事動(dòng)物疫病綜合防控工作。