張佳玲　付　煒　殷　猛

200127，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心心胸外科(張佳玲，殷　猛)；兒科轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所(付　煒)

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組織工程血管的體內(nèi)實驗動物模型

張佳玲付煒殷猛

200127，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心心胸外科(張佳玲，殷猛)；兒科轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所(付煒)

【摘要】在組織工程血管向臨床轉(zhuǎn)化的過程中，進(jìn)行體內(nèi)實驗是關(guān)鍵，選擇合適的動物模型尤為重要。篩選動物模型通常以血管直徑的匹配度為主要參考因素，此外還受物種差異、移植部位、促凝性等多種因素的影響。該文介紹近幾年血管移植動物模型在組織工程血管領(lǐng)域中的應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】組織工程血管；體內(nèi)實驗；動物模型

雖然已有許多生物材料以及高分子材料應(yīng)用于組織工程血管的重建，但是仍然沒有一種“完美”的移植材料可以廣泛應(yīng)用。特別是在小口徑人工血管(直徑<6 mm)的重建和再生過程中，發(fā)生血栓、感染等并發(fā)癥的概率也在上升[1]。近年來，多學(xué)科的交叉研究促進(jìn)了小口徑人工血管的發(fā)展，但是其臨床轉(zhuǎn)化和應(yīng)用仍然是一個挑戰(zhàn)[2]。通過動物實驗?zāi)M人體內(nèi)環(huán)境，對移植血管進(jìn)行合理而準(zhǔn)確的評估，是組織工程血管向臨床轉(zhuǎn)化過程中必不可少的一步，選擇合適的動物模型至關(guān)重要。

1動物模型的篩選標(biāo)準(zhǔn)

理想的血管移植動物模型需要考慮以下幾個因素：移植物直徑、植入部位、促凝性、免疫原性以及特定的臨床需求[3]。完全理想的動物模型是不存在的，應(yīng)針對具體的研究目的，根據(jù)不同動物的特性以及移植部位等，選擇合適的動物模型。在篩選過程中，除了上述條件外，還需要考慮動物的經(jīng)濟(jì)成本、實用性；手術(shù)以及術(shù)后實驗易操作；動物對麻醉和手術(shù)的反應(yīng)和耐受性；動物接受移植部位的自體血管固有直徑和流量也要作為篩選標(biāo)準(zhǔn)；實驗所用的動物模型移植部位在生理功能方面應(yīng)接近人體相對應(yīng)的部位[2-4]。

2組織工程血管動物模型的應(yīng)用

血管直徑匹配度是選擇動物模型最關(guān)鍵的因素。根據(jù)動物自體血管直徑大小，可將組織工程血管體內(nèi)實驗常用的動物分為以下幾類。

2.1直徑為0.5～2 mm的血管

直徑為0.5～2 mm的小口徑血管可應(yīng)用于周圍血管疾病，尤其是動脈系統(tǒng)疾病。由于小口徑血管遠(yuǎn)期通暢率不高，臨床應(yīng)用一直較困難，開發(fā)空間較大。

2.1.1兔兔的頸動脈和股動脈長直且分支少，適用于直徑1.5～2 mm組織工程血管的移植。

兔頸動脈是小口徑血管移植中最常用的部位。Zheng等[5]制備的直徑為2.2 mm，長度為1.5 cm的小口徑人工血管，經(jīng)多肽修飾后植入到新西蘭大白兔頸動脈中段，于術(shù)后2周和4周時分別行數(shù)字減影血管造影術(shù)(DSA)觀察人工血管在體內(nèi)的通暢性。結(jié)果顯示，經(jīng)多肽修飾后的人工血管在通暢率、內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋率等方面明顯優(yōu)于未經(jīng)修飾的對照人工血管。

兔股動脈也是建立小口徑血管動物模型的常用部位[6-8]，并且逐漸向臨床疾病模型轉(zhuǎn)化。Zhu等[9]用體外構(gòu)建的組織工程血管在兔股動脈上建立了外周血管疾病模型，在一定程度上模擬人的冠狀動脈(冠脈)慢性完全閉塞病變(CTO),可用于臨床疾病的監(jiān)測、診斷以及治療。

2.1.2大鼠大鼠的頸總動脈和腹主動脈是血管移植中常用的血管模型。尤其是大鼠的腹主動脈較長，易于操作，顯影清晰，為后續(xù)的影像學(xué)監(jiān)測提供了方便。適用于直徑0.5～1.5 mm組織工程血管的移植。

Zeng等[10]使用Wistar大鼠作為受體，將神經(jīng)生長因子(NGF)偶聯(lián)后的脫細(xì)胞血管植入大鼠右側(cè)頸總動脈，用多普勒超聲監(jiān)測和評估血管通暢情況?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α/肝素涂層的生物可降解人工血管(內(nèi)徑為1 mm,長度為6 mm)[11]和蛋白質(zhì)表面結(jié)合的組織工程血管[12]均利用SD大鼠的頸總動脈為植入位點，研究目的血管的體內(nèi)過程。

大鼠的腹主動脈也是常用的血管移植部位。將LacZ基因轉(zhuǎn)染的肌源性干細(xì)胞種植所得的組織工程血管(直徑為1.2 mm，長度為10 mm)，端端吻合于Lewis大鼠的腹主動脈，8周后行血管造影術(shù)并作組織學(xué)評價，結(jié)果顯示LacZ陽性細(xì)胞出現(xiàn)在血管重構(gòu)形成的平滑肌細(xì)胞層中[13]。轉(zhuǎn)基因動物在組織工程血管體內(nèi)實驗的應(yīng)用，可以針對性地研究分子水平的機(jī)制。

2.1.3小鼠小鼠的腹主動脈和下腔靜脈是小口徑血管較常用的移植部位，適用于直徑0.5～1 mm組織工程血管的移植。

免疫缺陷類小鼠：Roh等[14]將人的骨髓單個核細(xì)胞(BMC)種植在高分子材料支架上，制成小口徑組織工程血管，在SCID/bg小鼠的下腔靜脈中段植入，并且進(jìn)行長達(dá)24周的實驗，組織工程血管在體內(nèi)的通暢性和形態(tài)學(xué)則通過各個連續(xù)時間點的微型CT血管成像來評價。以聚乳酸為材料的內(nèi)徑為0.5～0.6 mm，長度為3 mm的小口徑血管植入SCID/Bg小鼠的腹主動脈，采用超聲波和微型CT血管造影作為移植后連續(xù)監(jiān)測的手段[15]。Nelson等[16]也用SCID/Bg小鼠的腹主動脈作為目標(biāo)位點，植入直徑約0.9 mm的組織工程小動脈，研究其在體內(nèi)血管新生組織的形成，同樣以微型CT血管造影來進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測。

活體分子成像技術(shù)也被應(yīng)用在組織工程血管在體內(nèi)監(jiān)測領(lǐng)域中，將熒光蛋白標(biāo)記的種子細(xì)胞和支架組裝而成的小口徑組織工程血管(內(nèi)徑約1 mm)植入裸鼠頸動脈中段，然后用活體分子成像技術(shù)進(jìn)行分子水平的追蹤，監(jiān)測結(jié)果與最后的組織學(xué)評價一致[17]。這種無創(chuàng)監(jiān)測方法不僅可以觀察到組織工程血管在體內(nèi)的動態(tài)重構(gòu)過程，還可以研究種子細(xì)胞的動態(tài)和走向，但是活體分子成像技術(shù)不能完全穿透整個支架壁，不能觀察移植物在體內(nèi)是否通暢。

小型動物來源廣泛，不僅手術(shù)操作簡單，而且經(jīng)濟(jì)實用，樣本量可以很大，統(tǒng)計結(jié)果可信度較高。但是小動物與人類差異太大，模擬人體疾病以及免疫反應(yīng)的相似度不高，只能用于近期實驗觀察。

2.2直徑為3～5 mm的血管

直徑為3～5 mm的小口徑血管臨床需求大，是組織工程血管領(lǐng)域研究和開發(fā)的重點。

2.2.1犬犬的心血管生理機(jī)能與人相似，且血管通路相對簡單，犬在實驗外科的應(yīng)用歷史悠久，但是它在促凝血方面有較大的個體差異性，是犬在血管移植應(yīng)用中的缺陷[4]。犬作為血管移植模型，有多個部位可供選擇，以滿足不同的血管口徑需求。

在血管組織工程體內(nèi)再生中，動物模型可以提供細(xì)胞來源，解決了種子細(xì)胞的排異反應(yīng)及免疫反應(yīng)。將犬的隱靜脈酶消化而來的細(xì)胞，與脫細(xì)胞支架在體外培養(yǎng)一段時間后回植入細(xì)胞捐贈犬的頸動脈，術(shù)后6個月通暢率良好，組織學(xué)及免疫組化分析顯示血管結(jié)構(gòu)和細(xì)胞密度接近天然血管[18]。除了生物材料支架，目前天然材料以及高分子材料在組織工程血管支架中的應(yīng)用也頗為廣泛[19-20]。Zhou等[21]用犬外周血中分離出來的生長內(nèi)皮細(xì)胞與高分子材料支架(直徑為3 mm，長度為4～5 cm)體外培養(yǎng)后，植入供體犬的頸動脈內(nèi)，并用多普勒超聲進(jìn)行監(jiān)測，3個月后實驗組的通暢率達(dá)83.3%，免疫熒光鑒定也證實種子細(xì)胞參與了體內(nèi)的血管組織再生。

由于組織工程中的體外培養(yǎng)操作要求高且周期較長，近年來有人提出了體內(nèi)組織工程的概念[2]，即省略種子細(xì)胞體外培養(yǎng)階段，僅對支架進(jìn)行抗凝血等修飾，或者將支架與天然生物材料交聯(lián)。將支架直接植入體內(nèi)受損傷部位，依靠體內(nèi)自身細(xì)胞的趨化作用以及細(xì)胞的遷移進(jìn)行局部組織重建，實現(xiàn)活體內(nèi)組織的自身修復(fù)和原位再生[22-23]。

2.2.2豬豬的心血管系統(tǒng)從解剖學(xué)和生理學(xué)方面都接近于人類，尤其是豬的冠脈系統(tǒng)在缺血再灌注和冠脈支架技術(shù)實驗中的應(yīng)用極為廣泛。由于豬的個體相對較大、生長速度過快、麻醉耐受性差、飼養(yǎng)價格較為昂貴，在3～5 mm直徑的血管組織工程的體內(nèi)實驗中，豬的應(yīng)用不及犬和羊。

Niklason等[24]以高分子材料聚乳酸作為支架制備的組織工程血管(TEBV),在生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)8周后植入豬體內(nèi)，進(jìn)行28 d的體內(nèi)實驗，首次證明了體外構(gòu)建組織工程血管的可行性。針對人工血管的快速內(nèi)皮化問題，Lu等[25]在豬的頸動脈驗證了接枝CD133抗體和肝素后的膨體聚四氟乙烯(ePTFE)血管在體內(nèi)的快速內(nèi)皮化過程。

然而，相比體內(nèi)血管的中段植入，血管的端側(cè)吻合旁路移植模型能更好地模擬旁路移植手術(shù)，但是血管內(nèi)膜增生的概率較高，對組織工程血管的評價更為嚴(yán)格。Quint等[26]在此模型上建立了一個“現(xiàn)成”的組織工程血管，他們用供體豬的平滑肌細(xì)胞和生物可降解材料制備的支架在仿生灌流裝置中進(jìn)行體外培養(yǎng)，在此過程中生物材料降解，而平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)。將得到的血管進(jìn)行脫細(xì)胞處理，最終得到由細(xì)胞外基質(zhì)組成的“現(xiàn)成”血管支架，再與受體豬的內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮祖細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，制備成組織工程血管。將此血管植入受體豬頸動脈行端側(cè)吻合旁路移植，結(jié)果顯示30 d后通暢率為100%，無明顯內(nèi)膜增生。該實驗證實了同種異體細(xì)胞產(chǎn)生的結(jié)締組織在組織工程血管體內(nèi)實驗中的有效性。

2.2.3羊羊的凝血系統(tǒng)更接近于人類,但其血液處于相對高凝狀態(tài)[4]。羊頸動脈移植在直徑3～5 mm組織工程血管體內(nèi)試驗中的應(yīng)用較廣泛。Koch等[27]將羊頸動脈作為移植部位，對種植有其自身細(xì)胞的復(fù)合支架分別進(jìn)行了短期以及中長期評價。另外,動物模型也可以對組織工程血管中的新型材料進(jìn)行測試，利用羊頸動脈移植進(jìn)行新型材料細(xì)菌纖維素的評估[28]。

對血管體內(nèi)移植后的監(jiān)測手段也在不斷地改進(jìn)和發(fā)展，其中動物模型的貢獻(xiàn)也必不可少。為了評價無創(chuàng)成像監(jiān)測過程中納米顆粒標(biāo)記材料的作用，用目的標(biāo)記物標(biāo)記的編織支架和種子細(xì)胞組裝而成的TEBV在羊頸部作動靜脈分流，進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，結(jié)果證明目的標(biāo)記物的有效性和安全性[29]。

羊、豬、犬的頸動脈和股動脈直徑為3～5 mm，與人的外周血管匹配，部位淺顯易暴露。此外，這類動物模型價格較為低廉，飼養(yǎng)和術(shù)后觀察方便。組織工程血管體內(nèi)移植后血管內(nèi)腔需要實現(xiàn)快速的內(nèi)皮化，犬和羊的血管內(nèi)皮化速度遠(yuǎn)高于人類[4]，這也是臨床前期實驗中需要考慮到的因素。

2.3直徑>5 mm的血管

大口徑組織工程血管的臨床需求和應(yīng)用也非常廣泛，如用在慢性腎病患者血液透析的動靜脈短路血管以及外周血管疾病的血管旁路治療。直徑6～10 mm的人工血管可應(yīng)用于四肢動脈及頸部動脈的人工血管轉(zhuǎn)流術(shù)。

2.3.1狒狒及非人靈長類動物狒狒等靈長類動物能很好地模擬人類，成為組織工程血管在臨床前實驗中最為準(zhǔn)確的評估模型，在基礎(chǔ)研究向臨床轉(zhuǎn)化的過程中作用重大，但是動物獲取來源困難、價格昂貴。

靈長類動物全身多個部位都可用于血管的體內(nèi)實驗。Clowes等[30]在狒狒的頸動脈和髂動脈植入長度為7～9 cm的膨體聚四氟乙烯(ePTFE)人工血管，12個月后60%的血管已經(jīng)達(dá)到完全內(nèi)皮化。

狒狒的血管動靜脈短路模型具有操作簡便、長度可控等優(yōu)點，在組織工程血管試驗中廣泛應(yīng)用。Jordan等[31]用新型材料涂層的ePTFE人工血管造成狒狒的動靜脈短路，以觀察機(jī)體對新型材料的凝血活性反應(yīng)。前文中提到的“現(xiàn)成”的組織工程血管，在狒狒動靜脈短路模型上(直徑為6 mm)也得到了證實[18]。利用狒狒上臂腋動脈和遠(yuǎn)端肱靜脈的短路模型，發(fā)現(xiàn)此類血管移植后內(nèi)膜增生減輕的機(jī)制在于血流動力學(xué)改變輕微以及炎癥反應(yīng)較弱[32]。

2.3.2犬犬的胸主動脈以及腹主動脈在早期就用于大口徑血管(直徑為6～8 mm)的置換研究。為了評價體內(nèi)組織工程血管，前人建立了胸主動脈和腹主動脈旁路[33-34]。1996年，Marois等[35]用直徑8 mm,長度為30 cm的白蛋白涂層人工血管在犬的胸主動脈和腹主動脈建立旁路，研究血管表面血栓形成以及治療效果。也有實驗利用犬的主要動靜脈以構(gòu)建大口徑血管[22,36]。Isayama等[23]用生物可降解材料制備直徑8 mm的無細(xì)胞血管支架，在犬的下腔靜脈證實了組織工程血管的原位再生。

大型動物心血管系統(tǒng)的解剖和生理更接近人類，一般用于中長期的移植研究。

3小結(jié)

隨著組織工程血管的不斷發(fā)展以及迫切的臨床需求，血管由體外培養(yǎng)和制備向體內(nèi)實驗的轉(zhuǎn)化成為趨勢。0.5～2 mm的小口徑血管的抗凝作用和快速內(nèi)皮化是研究難點和重點，小型動物模型可提供多樣本、短期的體內(nèi)實驗觀察；直徑3～5 mm的血管在冠脈搭橋術(shù)等手術(shù)中應(yīng)用廣泛，羊、豬、犬的全身多部位都可用于體內(nèi)實驗；較大的動物模型在模擬人體反應(yīng)方面更好，可用于臨床前預(yù)實驗。

由于組織工程血管的免疫原性，免疫缺陷動物模型更適宜體內(nèi)實驗，但是目前應(yīng)用較多的免疫缺陷動物只限于裸鼠、Beige小鼠以及SCID小鼠等小型動物。近年有學(xué)者用基因重組和體細(xì)胞克隆技術(shù)，培育出T細(xì)胞和NK細(xì)胞缺陷的免疫缺陷小型豬模型[37]；Song等[38]利用轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALENs)，將家兔負(fù)責(zé)T細(xì)胞和B細(xì)胞重排的重組激活基因(RAG)敲除，獲得了世界上首例免疫缺陷家兔模型。這些免疫缺陷大動物模型的應(yīng)用將會推動組織工程血管的發(fā)展。

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(收稿:2015-10-14 修回:2016-01-04)

(本文編輯：丁媛媛)

doi:10.3969/j.issn.1673-6583.2016.02.012

通信作者：殷猛, Email: yinmengmdphd@163.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81271726)，上海交通大學(xué)醫(yī)工交叉基金(YG2012MS35)