紀(jì)志華，鐘貞浩，孟志斌

(海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科，海南 ?？?570102)

LIM礦化蛋白-1發(fā)揮成骨效應(yīng)的機(jī)制探討

紀(jì)志華，鐘貞浩，孟志斌

(海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科，海南 ?？?570102)

近來大量研究證實，LIM礦化蛋白-1(LMP-1)是一種細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白，屬于PDZ-LIM蛋白家族，參與細(xì)胞成骨分化的早期階段；其不同結(jié)構(gòu)域各有其獨(dú)特的作用，它們可通過招募多種成骨因子、促進(jìn)細(xì)胞增殖、上調(diào)成骨相關(guān)基因表達(dá)、減少炎性骨丟失等多種途徑發(fā)揮其促成骨效應(yīng)。LMP-1可通過其不同結(jié)構(gòu)域的協(xié)同作用發(fā)揮強(qiáng)大的促成骨效應(yīng)。本文對LMP-1發(fā)揮成骨效應(yīng)的機(jī)制探討作一綜述。

LIM礦化蛋白-1；結(jié)構(gòu)域；成骨分化；機(jī)制

LIM礦化蛋白-1(LIM mineralization protein-1，LMP-1)是一種細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白，屬于PDZ-LIM蛋白家族[1]。PDZ-LIM蛋白家族以它們結(jié)構(gòu)中的PDZ和LIM結(jié)構(gòu)域為特征，因其結(jié)合了兩個功能結(jié)構(gòu)域，使其對細(xì)胞發(fā)育及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有廣泛的作用[2-3]。LMP-1在N端和C端分別由在進(jìn)化上高度保守的一個PDZ結(jié)構(gòu)域和三個LIM結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，兩端的結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)域為獨(dú)特區(qū)[4]。越來越多的證據(jù)表明，LMP-1作為一種細(xì)胞內(nèi)非分泌蛋白，其在調(diào)控骨形成及骨分化方面起到重要作用，但其確切的成骨機(jī)制各有見解，至今仍未達(dá)成一致共識。本文檢索近年來有關(guān)LMP-1在成骨效應(yīng)及其分子機(jī)制方面的文章，從PDZ-LIM蛋白家族的分子結(jié)構(gòu)出發(fā)，分析LMP-1的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與其成骨效應(yīng)的相關(guān)性，并進(jìn)一步對其成骨效應(yīng)的分子機(jī)制作一歸納分析。

1 PDZ-LIM蛋白家族

PDZ-LIM蛋白家族所有成員都由一個PDZ結(jié)構(gòu)域及至少一個LIM結(jié)構(gòu)域組成[5]。PDZ結(jié)構(gòu)域由80～100個氨基酸組成，其命名來源于最早發(fā)現(xiàn)含有此結(jié)構(gòu)域的三個蛋白質(zhì)(PSD-95，DLG及Zo-1)首字母的縮寫[6]。LIM結(jié)構(gòu)域是由半胱氨酸和組氨酸重復(fù)出現(xiàn)形成的鋅指結(jié)構(gòu)在Lin-11、IsI-1和Mec-3這三種同源蛋白中發(fā)現(xiàn)，故把含有這種結(jié)構(gòu)的蛋白統(tǒng)稱為LIM結(jié)構(gòu)蛋白[7-8]。在PDZ-LIM蛋白家族中，PDZ和LIM結(jié)構(gòu)域主要起支架作用，通過與纖絲狀肌動蛋白的相關(guān)蛋白、各種胞質(zhì)信號分子及胞核蛋白結(jié)合發(fā)揮其廣泛作用[9-12]。在PDZ-LIM蛋白家族的進(jìn)化過程中，某些結(jié)構(gòu)域發(fā)生拷貝與重排，便產(chǎn)生了功能各異的亞家族及某些獨(dú)特的蛋白，如ALP亞家族ALP、Clp-36/Elfin、Mystique及RIL、Enigma亞家族Enigma/ LMP，Enigma Homolog和Cypher/Zasp、LMO-7、LIM激酶亞家族LIMK-1和LIMK-2[5]。所有的家族成員都可以通過與肌動蛋白細(xì)胞骨架相互作用而發(fā)揮其生物學(xué)作用[12-13]。其中ALP、Enigma亞家族和LMO-7可以通過它們的PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合α-輔肌動蛋白[14-16]。Zasp和ALP在肌肉及心臟的發(fā)展中起到重要的生物學(xué)作用[17-18]，Enigma則在骨的形態(tài)發(fā)生中起到了尤為重要的作用[19]，而LIM激酶亞家族在神經(jīng)系統(tǒng)及生殖細(xì)胞的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[20-21]。此外，LMO-7和Mystique、RIL、LIM激酶亞家族都與腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系[22-24]。

2 LMP-1 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

LMP-1屬于PDZ-LIM蛋白家族中的Enigma亞家族，它是由Boden等[19]在研究糖皮質(zhì)激素對成骨細(xì)胞的分化影響時發(fā)現(xiàn)的一種新的蛋白質(zhì)分子。Boden等[19]通過差異顯示多聚酶聯(lián)反應(yīng)比較糖皮質(zhì)激素刺激和未刺激培養(yǎng)的小鼠傳代成骨細(xì)胞mRNA差別后，得到全長1 696 bp的cDNA片段，其中1 374 bp的翻譯區(qū)編碼一個新的457個氨基酸的蛋白質(zhì)，它就是LMP-1。之后人類陸續(xù)發(fā)現(xiàn)有3種不同的LMP剪接變異體：LMP-1、LMP-2和LMP-3。其中，LMP-1由N端的一個PDZ結(jié)構(gòu)域和C端的三個LIM結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，而PDZ和LIM結(jié)構(gòu)域高度保守，但它們在兩端的結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)域形成獨(dú)特區(qū)，對LMP-1發(fā)揮成骨效應(yīng)發(fā)揮必不可少的作用[25-26]。LMP-2在獨(dú)特區(qū)的325 bp和444 bp之間缺失了119 bp，而在444 bp處插入了17 bp，最終形成的蛋白長度為423個氨基酸，但它有完整的PDZ和LIM結(jié)構(gòu)域。LMP-3則在444 bp處插入了17 bp，由于這導(dǎo)致了讀碼框的轉(zhuǎn)變，故在505～507 bp出現(xiàn)了一個終止子，最終形成的蛋白長度為152個氨基酸，它雖有完整的PDZ結(jié)構(gòu)域，但丟失了約30%的獨(dú)特區(qū)而且沒有LIM結(jié)構(gòu)域[27]。

3 LMP-1 的成骨效應(yīng)及其分子機(jī)制

3.1 LMP-1參與成骨分化的早期階段 LMP-1作為一種細(xì)胞內(nèi)信號分子，直接參與成骨細(xì)胞的分化。在體外實驗中，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、顱蓋骨成骨細(xì)胞、表皮成纖維細(xì)胞中LMP-1的表達(dá)并促進(jìn)骨譜系細(xì)胞的分化。而在體內(nèi)，通過轉(zhuǎn)染LMP-1基因能發(fā)現(xiàn)高效異位皮下及肌肉內(nèi)及原位脊柱融合及骨折愈合骨形成[25,28-29]。Lin等[30]在研究牙周膜細(xì)胞的成骨分化時發(fā)現(xiàn)，LMP-1在其成骨分化的早期階段上調(diào)。另外，Boden等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎骨的發(fā)育過程中，軟骨始基中心成骨細(xì)胞出現(xiàn)前，就可在肥大的軟骨細(xì)胞附近的間充質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)LMP-1的轉(zhuǎn)錄物，這也提示LMP-1與早期成骨細(xì)胞分化相關(guān)。而Barnes等[31]通過組織原位雜交研究也提示了LMP-1均于軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨的早期階段表達(dá)。

3.2 LMP-1與成骨因子協(xié)同作用促進(jìn)成骨 Sangadala等發(fā)現(xiàn)LMP-1可以與Smad 1/5競爭性結(jié)合Smurf 1-WW2結(jié)構(gòu)域，有效地減少了Smurf 1介導(dǎo)的Smad 1/5泛素化及降解，促進(jìn)細(xì)胞對BMPs敏感性的增加因而有效地促進(jìn)了成骨分化。此外，作者發(fā)現(xiàn)LMP-1獨(dú)特區(qū)中的WW2結(jié)構(gòu)域-作用位點(diǎn)是其與Smad 1/5競爭性結(jié)合Smurf 1并發(fā)揮成骨誘導(dǎo)作用的關(guān)鍵位點(diǎn)[32-33]。Kato等[34]根據(jù)以上機(jī)制，通過用一種低分子量的復(fù)合物SVAK-12作用于成肌細(xì)胞性的C2C12細(xì)胞，因為它能與Smurf 1-WW2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而替代了LMP-1，發(fā)揮了增強(qiáng)細(xì)胞對BMP-2反應(yīng)性的作用。作者通過檢測BMP特異性指示物、BMP-2誘導(dǎo)的骨鈣蛋白及堿性磷酸酶的mRNA的表達(dá)，證實SVAK-12起到促進(jìn)C2C12成肌細(xì)胞向成骨分化的作用，這也大大減少了臨床治療時使用BMPs促進(jìn)骨生成的劑量。LMP-3作為LMP-1的變構(gòu)體的有完整的PDZ結(jié)構(gòu)域，而沒有LIM結(jié)構(gòu)域，但其同樣在獨(dú)特區(qū)中含有WW結(jié)構(gòu)域-作用位點(diǎn)。但有體外研究證實，轉(zhuǎn)染LMP-3表達(dá)質(zhì)粒到成骨細(xì)胞中可檢測到，其有與hLMP-1類似的誘導(dǎo)骨形成的作用[35-36]。與LMP-1及LMP-3不同的是，LMP-2雖然有完整的LIM結(jié)構(gòu)域，但卻沒有骨誘導(dǎo)作用。這表明，LMP-1可通過抑制Smad 1/5的降解而協(xié)同成骨因子BMPs發(fā)揮其促進(jìn)成骨作用，且通過與LMP-2及LMP-3比較分析表明，LMP-1獨(dú)特區(qū)的WW結(jié)構(gòu)域-作用位點(diǎn)在其成骨誘導(dǎo)作用中是不可或缺的，而非LIM結(jié)構(gòu)域。

3.3 LMP-1通過促細(xì)胞增殖間接促進(jìn)成骨 Lin等[30]發(fā)現(xiàn)用完整長度的LMP-1基因轉(zhuǎn)染PDL細(xì)胞具有多向分化潛能包括成骨分化的祖細(xì)胞能夠增強(qiáng)PDL細(xì)胞的增殖，采用RNA干擾使LMP-1沉默時，則抑制了PDL細(xì)胞的增殖。而用切除了LIM結(jié)構(gòu)域的LMP-1即僅含有PDZ及WW相互作用結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)染PDL細(xì)胞時，其顯著減弱了促進(jìn)PDL細(xì)胞增殖的效果，這表明PDZ及WW結(jié)構(gòu)域-作用位點(diǎn)不足以誘導(dǎo)LMP-1的促絲裂原作用及接下來的分裂增殖，即LIM結(jié)構(gòu)域在促進(jìn)細(xì)胞的增殖作用中起到關(guān)鍵作用。類似地，有研究表明，LMP-1可發(fā)揮其作為骨架蛋白的作用，它可調(diào)控由生長因子活化的絲裂原信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。Durick等[37]發(fā)現(xiàn)在鼠10T1/2成纖維細(xì)胞中，LMP-1通過Ret/ptc2調(diào)控絲裂原信號通路，并通過其第二個LIM結(jié)構(gòu)域結(jié)合到Ret/ptc2上，而它的PDZ結(jié)構(gòu)域則將LMP-1-Ret/ptc2復(fù)合體錨定到細(xì)胞的外圍結(jié)構(gòu)。另外，研究者發(fā)現(xiàn)倘若切除了LIM結(jié)構(gòu)域的LMP-1的表達(dá)，則會抑制Ret/ptc2的促絲裂原作用。由此可見，LMP-1蛋白可通過促進(jìn)細(xì)胞的增殖，從另外一方面間接地促進(jìn)了成骨效應(yīng)。其中，LMP-1蛋白的LIM結(jié)構(gòu)域起著特異性結(jié)合絲裂原相關(guān)調(diào)控蛋白并起了分裂增殖的作用。

3.4 LMP-1可上調(diào)成骨相關(guān)基因的表達(dá)及成骨因子的合成 Boden等[19]在1998年就闡述了LMP-1可上調(diào)BMP-6等多種細(xì)胞因子的表達(dá)。Komori等[38]發(fā)現(xiàn)通過轉(zhuǎn)移LMP-1基因后，細(xì)胞BMP-2和核結(jié)合因子α1(Core Binding Factor α1，CBFα1)，即RUNX2基因的表達(dá)及蛋白質(zhì)的合成明顯增加。其中，BMP-2是促成骨誘導(dǎo)分化能力最強(qiáng)胞外蛋白，而RUNX2則是成骨細(xì)胞分化關(guān)鍵的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子。Minamide等[39]在體內(nèi)外研究中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染LMP-1可誘導(dǎo)A549細(xì)胞上調(diào)多種BMPs，如BMP-2、4、6、7和TGF-β1轉(zhuǎn)化生長因子-β1的表達(dá)，并進(jìn)一步促進(jìn)骨形成。與LMP-1類似，LMP-3也可以通過上調(diào)成骨相關(guān)因子的基因表達(dá)和蛋白合成而實現(xiàn)促成骨作用[40]。Pola等[35]用LMP-3轉(zhuǎn)染NIH3T3及MC3T3-E1細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，成骨特異性基因如骨鈣蛋白、骨橋蛋白、骨唾液酸糖蛋白基因的表達(dá)上調(diào)，且這與用BMP-2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH3T3或MC3T3-E1細(xì)胞時具有相似的效果。LMP-1與LMP-3可通過上調(diào)多種成骨相關(guān)基因的表達(dá)及蛋白的合成進(jìn)而促進(jìn)成骨分化。已知LMP-3有完整的PDZ結(jié)構(gòu)域，獨(dú)特區(qū)中含有WW結(jié)構(gòu)域-作用位點(diǎn)，而沒有LIM結(jié)構(gòu)域。因此，我們認(rèn)為LMP-1通過此途徑促進(jìn)成骨作用可能與其PDZ結(jié)構(gòu)域和或獨(dú)特區(qū)的功能有關(guān)，但確切的生物學(xué)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

3.5 LMP-1能抑制NO的生成而減少炎性骨丟失 Liu等[41]發(fā)現(xiàn)LMP-1在前破骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中可通過抑制NF-κB的活化及選擇性調(diào)控絲裂原活化的蛋白激酶MAPK通路，導(dǎo)致了NO的生成減少而起到抗炎癥效果，從而減少炎性骨丟失，這從另一方面闡明了LMP-1的成骨機(jī)制。作者在經(jīng)LPS脂多糖刺激的RAW264.7前破骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，LMP-1通過抑制iNOS基因的表達(dá)、NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性及核轉(zhuǎn)位、IKB (Inhibitor of Kappa B)的磷酸化從而顯著減少NO產(chǎn)生量。而作者在對照組中，LMP-2則不能抑制iNOS基因的表達(dá)。由此可見，LMP-1中的獨(dú)特區(qū)通過抑制NO生成而起到了減少炎性骨丟失的作用。

4 展望

LMP-1是由N端的一個PDZ結(jié)構(gòu)域和C端的三個LIM結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，正是由于其特殊的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，決定了其廣泛的生物學(xué)作用。已有研究表明，PDZ和LIM結(jié)構(gòu)域各自發(fā)揮著自己的作用，而它們之間又相互協(xié)調(diào)。其中，LIM結(jié)構(gòu)域與具有特定生物學(xué)活性的蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，而PDZ結(jié)構(gòu)域則將該復(fù)合物結(jié)合至肌動蛋白微絲并由后者轉(zhuǎn)運(yùn)至特定的區(qū)域發(fā)揮作用。同樣，在此我們通過分析文獻(xiàn)也可發(fā)現(xiàn)，無論是LMP-1其N端的PDZ結(jié)構(gòu)域，或是處于獨(dú)特區(qū)的WW結(jié)構(gòu)域-作用位點(diǎn)，還是C端的LIM結(jié)構(gòu)域，對其發(fā)揮成骨效應(yīng)都起到獨(dú)特的作用。其中，獨(dú)特區(qū)的WW結(jié)構(gòu)域-作用位點(diǎn)對其發(fā)揮協(xié)同BMPs促成骨作用必不可少；LIM結(jié)構(gòu)域則在促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂及增殖方面起關(guān)鍵作用，這也間接地促進(jìn)了成骨效果；而PDZ結(jié)構(gòu)域則作為介導(dǎo)蛋白之間相互作用的重要結(jié)構(gòu)域之一，更廣泛地參與蛋白在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸及各種信號通路的傳導(dǎo)過程，并對細(xì)胞成骨分化有著影響。

綜上可知，LMP-1在成骨方面具有巨大的潛能，隨著分子生物學(xué)及組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展，對LMP-1結(jié)構(gòu)功能的研究不斷深入，相信在不久的將來，LMP-1的成骨作用機(jī)制將被闡明，其將更廣泛的應(yīng)用于臨床治療領(lǐng)域并將發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

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R329.2+6

A

1003—6350（2016）15—2507—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.15.033

2015-06-23)

孟志斌。E-mail：zhongzhenhao2011@163.com