李志營 夏云 王占偉 楊偉科 焦繼超

·實驗研究·

mTOR信號通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞樣細胞中激活的意義研究

李志營 夏云 王占偉 楊偉科 焦繼超

目的探討哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞樣細胞中激活的意義。方法通過Hoechst33342染色流式細胞儀,利用Western blot法和熒光定量-PC R法對非側(cè)群(NSP)細胞和側(cè)群(SP)細胞中的mTOR信號通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞樣細胞中激活的意義進行分析研究。結(jié)果光定量PCR檢測NSP和SP細胞中,mTOR基因的2-△Ct值為(0.289±0.042)和(0.623±0.021),兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),Western blot檢測結(jié)果證實,SP細胞的mTOR蛋白表達也明顯高于NSP細胞(P＜0.05)。結(jié)論神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞中存在mTOR高表達現(xiàn)象。

mTOR信號通路；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；干細胞

惡性腫瘤是除心血管疾病以外,人類健康的第二大殺手,而神經(jīng)膠質(zhì)瘤又是惡性腫瘤中最為常見的一種類型,主要治療方式為手術(shù)治療,但患者存在一定的術(shù)后復(fù)發(fā)率,術(shù)后死亡率也相對較高。腫瘤干細胞理論研究結(jié)果提出,腫瘤內(nèi)存在的部分腫瘤起始細胞是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)的主要原因,而這也為腫瘤的預(yù)防和治療提供了新的途徑。本次醫(yī)學(xué)研究就對mTOR信號通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞樣細胞中激活的意義進行了研究,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1細胞系及培養(yǎng) 細胞系及其培養(yǎng)方法: 用5%二氧化碳在37℃條件下進行神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細胞的培養(yǎng),PRMI 1640培養(yǎng)液中含有100 IU/ml鏈霉素、100 IU/ml青霉素及10%胎牛血。

1.2試劑 本研究所用試劑包括: 美國 cell signalling 公司生產(chǎn)的mTOR、GAPDH抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗,北京天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的Trizol、SYBR Green 熒光定量檢測 PCR 試劑盒,美國 Santa Cruz 公司生產(chǎn)的特異性mTOR 靶向 siRNA,英韋創(chuàng)津公司生產(chǎn)的Lipofectin2000、PRMI 1640 培養(yǎng)基,美國Millopore 公司生產(chǎn)的干細胞培養(yǎng)基,美國 Gibco 公司生產(chǎn)的胎牛血清,美國Sigma 公司生產(chǎn)的Hoechst33342和維拉帕米、鏈霉素、青霉素。

1.3熒光定量 PCR 檢測mTOR 基因表達 分別選擇NSP和SP細胞,PBS進行2次洗滌,根據(jù)Trizol 說明書要求對細胞總 RNA進行提取,反轉(zhuǎn)錄出第 1 鏈cDNA,根據(jù) SYBR Green 熒光定量 PCR 檢測試劑盒說明書要求,進行 mTOR 基因表達量的檢測。使用2-△Ct值表示基因的表達量,Ct值表示基因擴增達到閾值的循環(huán)數(shù),△Ct值越小,則證實基因的表達就越多,相應(yīng)的2-△Ct值越小就說明該基因的表達就越少,△Ct值=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值。

1.4側(cè)群(SP)細胞的流式細胞儀分選 按照Goodell等研究人員提出的方案,對SP細胞的流式細胞儀進行分選,具體如下方法: 選擇對數(shù)生長期的神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細胞,在5 mg/L的Hoechst 33342中加入106/ml單細胞懸液,同時,提前30 min選擇1 ml細胞,并加入50 mg/L維拉帕米,后加入Hoechst 33342 作為對照,選擇相應(yīng)的SP亞群,連續(xù)90 min在37℃的水浴避光染色。通過美國BD 公司生產(chǎn)的IL6 和 IL7 雙通道做門FACS AriaⅡ流式細胞儀,參考維拉帕米對照樣品對SP細胞群進行選擇,并在37℃無菌條件下分選。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,采用t檢驗;計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

熒光定量PCR檢測結(jié)果證實,在NSP和SP細胞中,mTOR基因的2-△Ct值為(0.289±0.042)和(0.623±0.021),兩個檢測結(jié)果比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖1。Western blot檢測結(jié)果證實,SP細胞的mTOR蛋白表達也明顯高于NSP細胞。見圖2。

圖1 熒光定量PCR檢測,NSP和SP細胞的mTOR表達

圖2 Western blot檢測,NSP和SP細胞的mTOR表達

3 討論

腫瘤干細胞是一種具有自我更新潛能和高增生潛能的一小群腫瘤起始細胞,現(xiàn)階段臨床常用的腫瘤干細胞分選方法包括Hoechst 33342 染色流式細胞儀SP 細胞分選、無血清球囊懸浮培養(yǎng)富集、免疫標記分選幾種［1］,其主要原因是特異性標記的腫瘤干細胞蛋白在特定的腫瘤中并不顯著,血清懸浮培養(yǎng)條件較為嚴苛,但耗時相對較少［2］,因此,SP細胞分選也是腫瘤干細胞的常見分選方法,已有的醫(yī)學(xué)研究結(jié)果證實,SP細胞分選是一種最為簡便且有效的富集神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤干細胞分選技術(shù)［3］。

mTOR信號通路對于細胞周期的調(diào)節(jié)、細胞的增值和生長具有十分重要的作用,其存在于腫瘤及其基因的發(fā)生和發(fā)展的全過程之中,且這一過程中mTOR 通路的激活起到了明顯的促進作用［4,5］。mTOR屬于核心絲氨酸 /蘇氨酸蛋白激酶的一種,能夠使其底物 pS6K和 4E-BPl磷酸化,產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄因子效應(yīng),進而加速蛋白質(zhì)的翻譯,其中包括一些促生長、細胞周期調(diào)控、抗凋亡等蛋白的表達。

［1］張宇,傘永志,朱玉蘭.mTOR信號通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用機制研究進展.卒中與神經(jīng)疾病,2013,20(6):381-382.

［2］王通,劉玉光,張良文,等.阻斷EGFR和mTOR信號通路對C6膠質(zhì)瘤及其干細胞的影響.山東大學(xué)學(xué)報,2013,7(5):37-38.

［3］周福安,古麗娜爾·阿布拉江,張志明,等.PI3K/AKT/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白在腦膠質(zhì)瘤中的表達及臨床意義.臨床神經(jīng)病學(xué)雜志,2012,25(4):278-279.

［4］李雪源,賈愛華,任玉波,等.mTOR 信號通路蛋白在人腦膠質(zhì)瘤中的表達及其臨床意義.中國腫瘤生物治療雜志,2011,18(1):75-76.

［5］李進軍,劉顯志,王雪峰,等.mTOR /eIF4E信號通路在不同級別人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達及臨床意義.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2010,32(23):2549-2550.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.08.224

2016-12-29］

450000 河南省鄭州市第七人民醫(yī)院神經(jīng)外科