王愛蓮，周蕾，李寧

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1眼科，2病理科，蚌埠 233003）

乙醛脫氫酶1和抗癌一號在眼瞼板腺癌中的表達(dá)及臨床意義

王愛蓮1，周蕾2*，李寧1

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1眼科，2病理科，蚌埠 233003）

目的檢測眼瞼板腺癌（meibomian gland carcinoma，MGC）中乙醛脫氫酶1（aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1）和抗癌一號（Kangai1，KAI1）的免疫組織化學(xué)表達(dá)及其與MGC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)ElivisionTMplus法檢測60例MGC和10例眼炎性假瘤組織中ALDH1和KAI1免疫反應(yīng)性。結(jié)果在MGC組織中，ALDH1的陽性表達(dá)率為38.3%，明顯高于炎性假瘤組織（10.0%）；KAI1的陽性表達(dá)率為45.0%，明顯低于炎性假瘤組織（100%）。ALDH1陽性率在腫瘤直徑≥2.0cm組、伴有周圍組織浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組以及Ⅲ+Ⅳ組明顯增高；而KAI1陽性率在腫瘤直徑≥2. 0cm組、伴有周圍組織浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、腫瘤低分化組以及Ⅲ+Ⅳ組明顯降低。二者的陽性率均與MGC患者的年齡、性別、腫瘤位置等無關(guān)。此外，ALDH1的表達(dá)與KAI1表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論ALDH1陽性和KAI1陰性的MGC更易浸潤和轉(zhuǎn)移；在MGC患者中聯(lián)合檢測ALDH1和KAI1蛋白的表達(dá)有助于預(yù)測其浸潤和轉(zhuǎn)移。

眼瞼板腺癌；ALDH1；KAI1；免疫組織化學(xué)；轉(zhuǎn)移

眼瞼板腺癌（meibomian gland carcinoma，MGC）又名麥?zhǔn)舷侔?，是眼科較常見的惡性腫瘤［1］，其來源可以是瞼板腺，也可以是睫毛的皮脂腺。瞼板腺癌的好發(fā)年齡為50～70歲，女性常見，上瞼多于下瞼。瞼板腺癌可因惡性程度的不同而預(yù)后差別很大，惡性程度低的患者可歷時多年，惡性程度高的患者可能會出現(xiàn)早期轉(zhuǎn)移。瞼板腺癌發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移的機(jī)制目前還尚不清楚，可能與腫瘤起源細(xì)胞（tumor initiating cells，TICs）即腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）有關(guān)。所謂CSCs是指腫瘤細(xì)胞群體中一小部分能夠自我更新、促進(jìn)腫瘤分化、浸襲轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的細(xì)胞群［2］。乙醛脫氫酶1（Aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1）是乙醛脫氫酶家族重要成員之一，該家族成員是一組主要位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和線粒體內(nèi)的酶。ALDH1不僅參與體內(nèi)的乙醛的代謝解毒作用，還是腫瘤干細(xì)胞的重要標(biāo)記物之一［3-5］。ALDH1主要參與視黃醛向視黃酸轉(zhuǎn)化的反應(yīng)，其表達(dá)異常增高，可以促進(jìn)惡性腫瘤的形成及侵襲。腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的另一種機(jī)制可能與腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因表達(dá)缺失有關(guān)?？拱┮惶枺↘angai1，KAI1）屬于腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因家族，最早發(fā)現(xiàn)于前列腺癌中，其基因位于人染色體11p11. 2。KAI1通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動、黏附、聚合及增殖而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移［6］。KAI1基因異常會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，患者通常預(yù)后不佳［7］。本研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測60例眼瞼板腺癌組織中ALDH1和KAI1的表達(dá)，并分析它們之間的相互關(guān)系及其與MGC浸潤和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

材料與方法

1 材料

收集安徽省蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科2002年1月-2010年12月間存檔石蠟包埋眼瞼板腺癌組織標(biāo)本60例（活檢前未行任何放、化療及其它抗腫瘤治療等）和眼眶炎性假瘤組織標(biāo)本10例（對照組）。在60例瞼板腺癌患者中，男性24例，女性36例；年齡48～78歲，中位年齡58歲。位于上眼瞼者35例，下眼瞼者25例；腫瘤長徑＜2.0cm有50例，≥2.0cm有10例；分化好的有40例，分化差的有20例；浸潤周圍組織的有12例，未浸潤周圍組織的有48例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有10例，淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移的有10例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期有50例，Ⅲ+Ⅳ期有10例。

2 試劑

鼠抗人單克隆KAI1購自美國Santa Cruz公司，鼠抗人ALDH1購自美國Abcam公司，ElivisionTMplus試劑盒和DAB試劑盒均購自福州邁新生物開發(fā)有限公司。

3 ElivisionTMplus法免疫組織化學(xué)染色

所有的MGC標(biāo)本和眼眶炎性假瘤標(biāo)本均經(jīng)4%中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，于二甲苯溶液及梯度濃度的乙醇溶液中脫蠟至水洗。免疫組織化學(xué)染色按照ElivisionTMplus試劑盒說明書步驟進(jìn)行。使用高壓對抗原進(jìn)行修復(fù)，修復(fù)液為pH6.0的檸檬酸緩沖液，一抗按1：100稀釋后滴加。DAB顯色后水洗，再經(jīng)蘇木素染細(xì)胞核、分化、返藍(lán)、脫水透明和樹膠封片等。用加了同一抗相同種屬的非免疫IgG的PBS液作陰性對照，采用已知陽性片作陽性對照。

4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判讀

ALDH1主要是以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性；KAI1主要是以細(xì)胞膜和漿內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性。ALDH1和KAI1的陽性結(jié)果主要通過著色的強(qiáng)度和范圍的乘積綜合計(jì)分得出。具體計(jì)分步驟如下，先計(jì)算著色強(qiáng)度，0分無著色，1分淡黃色，2分黃色，3分為棕黃色；再計(jì)算范圍，隨機(jī)選取10個高倍視野，計(jì)算陽性細(xì)胞所占百分比，＜10%為0分，11%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，＞75%為4分，最后將兩次計(jì)分相乘，得出積分結(jié)果，若積分＜3分為陰性，若積分≥3分則為陽性。免疫組化染色結(jié)果由兩位病理醫(yī)師通過獨(dú)立雙盲法來判定。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)所獲得的所有數(shù)據(jù)均通過統(tǒng)計(jì)軟件SPSS20.0進(jìn)行分析。在MGC組中，ALDH1和KAI1的表達(dá)與對照組及各臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性采用χ2、Spearman等級相關(guān)等方法檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 表達(dá)ALDH1的MGC更易浸潤和轉(zhuǎn)移

為了明確ALDH1在MGC和對照組眼眶炎性假瘤組織中的表達(dá)情況，我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測MGC和對照組ALDH1的表達(dá)。結(jié)果顯示：在對照組中，ALDH1主要表達(dá)在黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，ALDH1表達(dá)陽性率為10.0%（1／10）；在MGC組中，ALDH1主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，ALDH1表達(dá)陽性率為38.3%（23／60）（圖1），提示在MGC中ALDH1陽性率顯著高于對照組。接著，我們應(yīng)用卡方檢驗(yàn)對ALDH1蛋白的陽性率與MGC腫瘤周圍組織浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期等相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果提示：ALDH1表達(dá)陽性的MGC更易浸潤周圍組織及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤生長更大及TNM分期更高，但ALDH1的表達(dá)與否與MGC患者的性別、年齡、腫瘤位置及分化程度等無明顯相關(guān)性（表1）。

圖1 ALDH1在MGC和炎性假瘤組織中的表達(dá)。A，ALDH1染色陽性的MGC組織，ALDH1定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)；B，ALDH1陰性的MGC組織；C，ALDH1染色陽性的炎性假瘤組織，ALDH1定位于黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)；D，ALDH1染色陰性的炎性假瘤組織；比例尺：A和B，100μm；C和D，100μmFig.1 ALDH1 expression in MGC and OIPT.A，ALDH1-positive MGC，ALDH1 located in the cytoplasm of the tumor cells；B，ALDH1-negative MGC；C，ALDH1-positive OIPT，ALDH1 located in the cytoplasm of themucosal epithelial cells；D，ALDH1-negative OIPT；scale bar，100μm

圖2 KAI1在MGC和炎性假瘤組織中的表達(dá)。A，KAI1染色陽性的MGC組織，KAI1定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)；B，KAI1染色陰性的MGC組織；C，KAI1染色陽性的炎性假瘤組織，KAI1定位于黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)；D，KAI1染色陰性的炎性假瘤組織；比例尺：A和B，100μm；C和D，100μmFig.2 KAI1 expression in MGC and OIPT.A，KAI1-positive MGC，KAI1 located in themembrane and cytoplasm of the tumor cells；B，KAI1-negative MGC；C，KAI1-positive OIPT，KAI1 located in themembrane and cytoplasm of themucosal epithelial cells；D，KAI1-negative OIPT；scale bar，100μm

表1 MGC中ALDH1和KAI1的表達(dá)及其與臨床各病理因素之間的關(guān)系Tab.1 The expression of ALDH1 and KAI1 in MGC and their correlation w ith clinicopathological characteristics

2 KAI1表達(dá)呈陰性的MGC更易浸潤和轉(zhuǎn)移

為了明確KAI1在MGC和對照組眼眶炎性假瘤組織中的表達(dá)情況，我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測MGC和對照組KAI1的表達(dá)。結(jié)果顯示：在對照組中，所有的組織塊均為KAI1免疫反應(yīng)陽性，KAI1主要表達(dá)在黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜中；而在MGC組，僅45.0%（27／60）的組織塊中可見KAI1免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物，主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜中（圖2）。這些結(jié)果提示在MGC中KAI1蛋白表達(dá)陽性率顯著降低。應(yīng)用卡方檢驗(yàn)對KAI1的陽性率與MGC腫瘤周圍組織浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期等相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果提示：KAI1免疫反應(yīng)呈陰性的EDMG更易浸潤其周圍組織及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤生長更大、分化更差及TNM分期更高（表1）；此外，KAI1的表達(dá)與否與MGC患者的性別、年齡及腫瘤位置等均無相關(guān)性（表1）。

3 MGC組織中ALDH1和KAI1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)

Spearman等級相關(guān)分析顯示，EDMG組織中ALDH1的陽性表達(dá)率與KAI1的陽性表達(dá)率呈負(fù)相關(guān)（表1）。

討 論

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特征，同時也是惡性腫瘤治療失敗和術(shù)后復(fù)發(fā)的主要原因。近年來，大量研究表明，腫瘤組織中存在腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）［8-10］。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中的一群可以自我更新和無限復(fù)制，并可以導(dǎo)致腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及抵抗放、化療的細(xì)胞。ALDH1是CSCs的重要標(biāo)記物之一，廣泛分布于人體組織中，與干細(xì)胞分化及增殖相關(guān)。ALDH1通過參與視黃醇氧化為視黃酸的反應(yīng)而參與細(xì)胞的增殖與分化［11，12］，從而維持正常組織的發(fā)育和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。ALDH1基因突變可引起細(xì)胞的異常增殖和分化，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。自從ALDH1在乳腺癌中被證實(shí)為具有干細(xì)胞特性后［13］，后來在結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌和肺癌等惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)其可以作為干細(xì)胞的標(biāo)記物。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在MGC組織中ALDH1蛋白的陽性率顯著高于其在對照組中的陽性率，并且隨著ALDH1的陽性率的增高，MGC患者越容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵犯其周圍組織、腫瘤增長越大以及TNM分期越高，說明ALDH1蛋白表達(dá)的異常增高可能參與了MGC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移等過程，與文獻(xiàn)報道一致［14］。

腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的一個重要基礎(chǔ)是腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的表達(dá)降低或缺失，導(dǎo)致其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的功能喪失。常見的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因有nm23，KAI1和KISS-1等。KAI1基因曾被認(rèn)為是前列腺癌特異性的轉(zhuǎn)移抑制基因，后來在多種腫瘤均可發(fā)現(xiàn)其表達(dá)降低或缺失。KAI1發(fā)揮功能主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞表面的黏附分子的結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)［15］。KAI1可通過抑制β-catenin酪氨酸激酶的活性來穩(wěn)定E-cadherin／β-catenin復(fù)合體的穩(wěn)定性而阻止腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫離［16］。KAI1在腫瘤中的異常形式主要有基因突變、等位基因缺失和表達(dá)水平的改變等，其中表達(dá)水平異常最為常見。本研究發(fā)現(xiàn)KAI1蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著低于其在對照組中的表達(dá)水平，且隨著腫瘤分化越差、TNM分期越高，其表達(dá)水平也越低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。侵犯周圍組織和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的MGC患者KAI1表達(dá)水平均較沒有侵犯周圍組織和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的低，提升KAI1蛋白表達(dá)降低或缺失參與了MGC的發(fā)生、發(fā)展及侵襲和轉(zhuǎn)移，與其他學(xué)者研究結(jié)果一致［7，15，16］。

Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)ALDH1的表達(dá)與KAI1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示在MGC的發(fā)生、發(fā)展過程中它們之間可能存在某種聯(lián)系。在各種致瘤因素的作用下，導(dǎo)致ALDH1被異常激活，導(dǎo)致MGC的發(fā)生，由于CSCs的存在，可以促進(jìn)MGC的進(jìn)一步發(fā)展；此時KAI1的表達(dá)降低或缺失，喪失了穩(wěn)定E-cadherin／β-catenin復(fù)合體的功能，從而導(dǎo)致細(xì)胞間的黏附力降低，使腫瘤細(xì)胞易于脫離原發(fā)腫瘤而發(fā)生局部浸潤甚至淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［7］。

綜上所述，ALDH1的表達(dá)異常增高和KAI1的表達(dá)降低或缺失均促進(jìn)了MGC的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲和轉(zhuǎn)移等過程。因此，可以通過聯(lián)合檢測MGC患者中ALDH1和KAI1蛋白的表達(dá)，作為預(yù)測MGC患者侵襲和轉(zhuǎn)移的指標(biāo)之一。

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The expression and clinicopathological significance of ALDH1 and KAI1 in meibom ian gland carcinoma

Wang Ailian1，Zhou Lei2*，Li Ning1
（1Department of Ophthalmology；2Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233003，China）

ObjectiveTo investigate the immunohistochemicalexpression of aldehyde dehydrogenase 1（ALDH1）and Kangai1（KAI1）inmeibomian gland carcinoma（MGC）and their association with the clinicopathological characteristics ofMGC.M ethodsThe expression of ALDH1 and KAI1 was detected by ElivisionTM plus immunohistochemistry in 60 cases of MGC tissue and 10 cases of ophthalmic inflammatory pseudo tumor（OIPT）tissue.ResultsThe positive rate of ALDH1 was 38.3%in MGC tissue，significantly higher than that in OIPT tissue（10.0%），while the positive rate of KAI1 was 45.0%in MGC，which was obviously lower than in OIPT（100%）.The positive rate of ALDH1 wasmuch higher in the groups of tumor≥2.0cm in diameter，infiltrating adjacent tissue，with lymph nodemetastasis or belonging to TNM stage IIIand IV，while thatof KAI1 was significantly lower in these groups.The positive rates of ALDH1 and KAI1 were negatively associated，and both were unrelated to the gender and age ofMGC patients aswellas the location of the tumor.ConclusionALDH1-positive and KAI1-negative MGC has a larger tendency towards invasion and metastasis. The combined detection of ALDH1 and KAI1 expressionmay facilitate the estimation of MGC invasion and metastasis.

Meibomian gland carcinoma；ALDH1；KAI1；immunohistochemistry；metastasis

R730.21

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.06.010

2015-10-01

2016-12-14

王愛蓮，女（1975年），漢族，副主任醫(yī)師

*通訊作者（To whom correspondence should be addressed）：zhou_lei03＠163.com