張 恩， 楊昌貴， 江維克*， 周 濤， 肖承鴻， 張光文

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550002； 2.貴州烏蒙騰菌業(yè)有限公司， 貴州 畢節(jié) 551660)

冬竹蓀多糖及氨基酸含量的測定與分析

張 恩1， 楊昌貴1， 江維克1*， 周 濤1， 肖承鴻1， 張光文2

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550002； 2.貴州烏蒙騰菌業(yè)有限公司， 貴州 畢節(jié) 551660)

為進(jìn)一步開發(fā)利用冬竹蓀，采用顯色比色法、柱前衍生化-HPLC法測定冬竹蓀中多糖和氨基酸的含量，并用氨基酸比值系數(shù)法評價其蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值。結(jié)果表明：冬竹蓀中多糖含量為10.82%，冬竹蓀的17種氨基酸中包含了8種必需氨基酸，氨基酸總量為8.72%，必需氨基酸總量為3.59%；必需氨基酸與氨基酸總量的百分比(E/T)為40.4%、必需氨基酸與非必需氨基酸的比值(E/N)為0.68；第一限制性氨基酸為蛋氨酸+胱氨酸，氨基酸比值系數(shù)分(SRC)為70.61。冬竹蓀具有較高的營養(yǎng)價值，是一種極具市場和開發(fā)價值的食藥兩用真菌。

冬竹蓀； 多糖； 氨基酸

冬竹蓀(PhallusimpudicusL.)與紅托竹蓀(DictyophorarubrovolvataZang,Ji et Liou.)、長裙竹蓀〔Dictyophoraindusia(Ven et Pers) Fisch.〕和短裙竹蓀〔Dictyophoraduplicate(Bosc)Fisch.〕均是傳統(tǒng)的食藥兩用真菌[1-2]。其中，竹蓀品質(zhì)評價、藥理藥效及產(chǎn)品研發(fā)的研究報道較多，并產(chǎn)生了良好的經(jīng)濟(jì)價值，貴州的織金縣也因此被譽(yù)為中國竹蓀之鄉(xiāng)。近年來，隨著同科真菌資源的開發(fā)，冬竹蓀也成為人們關(guān)注的食用菌類，貴州省畢節(jié)地區(qū)成立了冬竹蓀種植協(xié)會，冬竹蓀的研發(fā)已變得十分緊迫。

冬竹蓀為鬼筆科鬼筆屬真菌白鬼筆(PhallusimpudicusL.)的子實體，又名鬼筆菌、竹下菌、竹菌、無裙蓀等。冬竹蓀藥食兩用，入藥具有祛風(fēng)除濕、活血止痛的功效，用于治療風(fēng)濕疼痛等癥[1]，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)冬竹蓀還含有多種抗腫瘤活性物質(zhì)，有防病保健的作用[3]。作為食用菌，其滋味鮮美、口感嫩滑爽脆，還具有特異菇香，是人們喜愛的菌類食品之一。冬竹蓀適宜在林下腐殖土中生長[4]，出菇溫度較低，在貴州畢節(jié)地區(qū)已大面積栽培。但目前對冬竹蓀的研究主要集中在栽培方法[5]和生物學(xué)特性[6]方面，尚未見對其多糖、氨基酸等有效成分或營養(yǎng)成分的研究報道。多糖和氨基酸是菌類食品重要的營養(yǎng)成分、鮮味成分，也是衡量菌類資源是否具有開發(fā)利用價值的重要指標(biāo)。為進(jìn)一步開發(fā)利用冬竹蓀，筆者對冬竹蓀的多糖和氨基酸含量進(jìn)行測定與評價，為冬竹蓀資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

冬竹蓀樣品：采自貴州畢節(jié)地區(qū)織金縣的城關(guān)鎮(zhèn)、官寨鄉(xiāng)、板橋鄉(xiāng)，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院鑒定為鬼筆科白鬼筆屬(PhallusimpudicusL.)的子實體。

儀器：紫外可見分光光度計(CBC-Cintra20型，澳大利亞照生公司)，高效液相色譜儀(日本島津LC-20AD)。

試劑：葡萄糖對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-200904)，氨基酸測定試劑包(天津博納艾杰爾科技有限公司，包括：三乙胺，異硫氰酸苯酯，正亮氨酸)，氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(天津博納艾杰爾科技有限公司，含17種氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、組氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和纈氨酸，其中胱氨酸含量為1.25 μmol/mL，其余氨基酸含量均為2.5 μmol/mL)。

1.2 多糖測定

1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精密稱取無水葡萄糖對照品，加蒸餾水制成濃度為0.34 mg/mL的對照品溶液，分別量取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL置于具塞試管中，加蒸餾水補(bǔ)足至2.0 mL，精密加入4.0%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入5 mL濃硫酸，搖勻，放置至室溫，以蒸餾水為空白，用紫外分光光度計在490 nm的波長處測定吸光度值，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程y=0.057 1x-0.013 5(R2=0.999 5)。

2) 多糖含量測定。精密稱取樣品粗粉1 g，加入40 mL蒸餾水，于60℃水浴加熱提取2 h，取出，濾過，取藥渣在相同條件下提取2 h，濾過，合并2次濾液，放冷，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，精密吸取2 mL，置于具塞試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項下自“精密加入4.0%苯酚溶液1 mL”起操作，測定吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出供試品中葡萄糖的含量(μg/mL)，并計算多糖含量。

1.3 氨基酸的測定

1) 色譜條件。色譜柱：pntulipsTMQS-C18氨基酸分析專用柱(4.6×250 nm，5 μm)，以0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH 5.4)-乙腈(93∶7)為流動相A，80%乙腈為流動相B，進(jìn)行梯度洗脫(表1)。檢測波長：254 nm；流速：1 mL/min；柱溫：柱溫30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序

2) 供試液的制備。取樣品粉末0.5 g，精密稱定，置于水解管中，加入6 mol/L含0.1%苯酚的鹽酸10 mL，融封。于(110±1)℃的恒溫干燥箱內(nèi)水解24 h，取出，冷卻，取水解液5 mL于水浴上揮干，用水溶解，定容于5 mL容量瓶中，備用。

3) 供試液及氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的衍生。取供試液及氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各200 μL，分別加入正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，三乙胺乙腈溶液100 μL，異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，混勻，室溫放置3 h，加入正己烷400 μL，振搖，放置10 min，取下層液，用0.45 μm濾膜濾過。取濾液200 μL加800 μL水稀釋，混勻，備用。

4) 供試品測定。精密吸取制備的供試液10 μL注入高效液相色譜儀，按色譜條件項下方法進(jìn)樣檢測，并計算氨氨基酸含量(%)=f1CV×10-6/f2W。式中，f1為樣品溶液中氨基酸峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積，f2為混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中各氨基酸峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積，C為氨基酸對照品溶液濃度(μg/mL)，V為稀釋倍數(shù)，W為樣品質(zhì)量(g)。

1.4 氨基酸營養(yǎng)價值評價

采用氨基酸比值系數(shù)法[7]計算上述樣品中必需氨基酸(EAA)的氨基酸比值(RAA)，氨基酸比值系數(shù)(RC)及比值系數(shù)分(SRC)，RAA=冬竹蓀必需氨基酸含量/模式譜相應(yīng)氨基酸含量，RC=RAA/RAA的平均值，SRC=100-CV×100；其中RC(氨基酸比值系數(shù))越接近1，表明該氨基酸越接近模式氨基酸，SRC(氨基酸比值系數(shù)分)越接近100，表明其營養(yǎng)價值越高，SRC越小營養(yǎng)價值越低。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬竹蓀多糖及氨基酸含量

多糖作為真菌重要的活性成分，主要存在于真菌菌絲、子實體及其發(fā)酵液中，一般是由10個以上的單糖以糖苷鍵連接而成的高分子聚合物[8]，在提高免疫力、抗腫瘤、抗氧化活性、降血糖、抗衰老等方面具有良好的療效[9]，其含量的高低也是衡量真菌藥用價值的一項重要指標(biāo)，《中國藥典》2010版中就規(guī)定了靈芝的多糖含量不得低于0.5%。經(jīng)測定，冬竹蓀多糖含量為9.64%，明顯高于常見真菌如靈芝(2.88%)[10]、香菇(6.92%)、牛肝菌(7.67)[11]的多糖含量，提示冬竹蓀多糖有著很好的開發(fā)利用前景。

從表2可知，冬竹蓀中含有17種氨基酸，總量為8.72%，必需氨基酸含量為3.59%；必需氨基酸占氨基酸總量比值(E/T)約為40.4%；必需氨基酸占非必需氨基酸比值(E/N)為0.68。E/T、E/N值達(dá)到了FAO/WHO提出的理想蛋白質(zhì)E/T=40.0%、E/N=0.60的標(biāo)準(zhǔn)[12]。含量較高的有谷氨酸(0.94～1.14%)、天冬氨酸(0.86～0.95%)。谷氨酸是腦組織生化代謝中的首要氨基酸，參與多種生理活性物質(zhì)的合成，在大腦，肝臟等組織中起解毒作用，天冬氨酸在降血壓、治療心臟病等方面有很好的療效[13]。因此，推測經(jīng)常食用冬竹蓀對心腦血管系統(tǒng)和肝臟方面應(yīng)具有良好的營養(yǎng)保健功效。冬竹蓀中F/T(谷氨酸和天冬氨酸含量占氨基酸總量的比值)約為21.8%(≥20%)，這也是冬竹蓀口感鮮美的原因。

表2 冬竹蓀多糖與氨基酸的含量

注：*為必需氨基酸，E/N為必需氨基酸與非必需氨基酸含量的比值，E/T為必需氨基酸與氨基酸總量的百分比，F(xiàn)/T為鮮味氨基酸與氨基酸總量的百分比。

Note:*, essential amino-acid; E/N, The ratio of essential amino acids to non-essential amino acid content; E/T, The ratio of the total amino acid to essential amino acid; F/T, The percentage of the total amino acid to flavor amino acid.

2.2 冬竹蓀的氨基酸評價

蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的評價有生物價、蛋白質(zhì)功效比值、氨基酸評分法和氨基酸比值系數(shù)法等，氨基酸比值系數(shù)法是根據(jù)氨基酸平衡理論，利用FAO/WHO的氨基酸模式進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)量評價[7]。通過氨基酸比值系數(shù)法對冬竹蓀營養(yǎng)價值進(jìn)行評價顯示(表3)，冬竹蓀中第一限制性氨基酸為蛋氨酸+半胱氨酸(RC=0.54)，其他氨基酸含量與模式氨基酸含量相當(dāng)，尤其是蘇氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸的含量較高(RC=1.43)，若將冬竹蓀與富含蛋氨酸+半胱氨酸的食品一起食用，或與缺乏蘇氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸的食品一起食用，可以實現(xiàn)營養(yǎng)平衡，或提高食品營養(yǎng)價值。另外，冬竹蓀的SRC值為70.61，高于樟芝(42.08)、靈芝(51.83)[14]和黑木耳(66.65)[15]等常見真菌的SRC值，表明冬竹蓀有著較高營養(yǎng)價值。

表3 冬竹蓀氨基酸的RAA、RC和SRC值

3 結(jié)論

冬竹蓀含有較豐富的多糖和氨基酸，其氨基酸種類齊全，E/T和E/N分別為40.4%和0.68，達(dá)到FAO/WHO提出的理想蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)，是較為理想的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源；冬竹蓀第一限制性氨基酸是蛋氨酸+半胱氨酸，氨基酸比值系數(shù)為70.61，具有較高的營養(yǎng)價值，是一種極具市場和開發(fā)價值的食藥兩用真菌。

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(責(zé)任編輯： 孫小嵐)

Determination and Analysis of Polysaccharide and Amino Acid inPhallusimpudicus

ZHANG En1, YANG Changgui1, JIANG Weike1*, ZHOU Tao1, XIAO Chenghong1,ZHANG Guangwen2

(1.GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang,Guizhou550002； 2.GuizhouWumengtengFungusIndustryLimitedCompany,Bijie,Guizhou551660,China)

To further exploit and utilizeP.impudicus, colorimetric method and pre-column derivatization RP-HPLC method were employed to determine polysaccharide and amino acid respectively, and protein nutritional value was evaluated by using the amino acid ratio coefficient method. Results: Content of polysaccharide inP.impudicuswas 10.82%. The 17 kinds of amino acids determined contained eight kinds of essential amino acids. Meanwhile, the total content of amino acids was 8.72%, and the total content of essential amino acid was 3.59%. The ratio of essential amino acids to total amino acid (E/T) was 40.4%, and the ratio of essential amino acids to non-essential amino acid (E/N) was 0.68. The first restrictive amino acids in this fungus fruiting body were methionine and cystine, and the score of ratio coefficient of amino acid (SRC) was 70.61. Therefore,P.impudicushas extremely high nutritional value and market development value.

Phallusimpudicus； polysaccharides； amino acid

2015-08-21； 2016-03-20修回

貴州省教育廳自然科學(xué)研究項目“中藥、民族藥質(zhì)量控制及新藥研究專業(yè)學(xué)位貴州省研究生工作站”[黔教研合JYSZ字(2014)016]；貴陽市科技計劃項目“醫(yī)院制劑蓮龍膠囊、花紅膠囊、康胃膠囊、參黛膠囊和萸藿膠囊的研制和申報”[筑科合同(20151001)藥01號]；貴州省普通高等學(xué)校特色重點實驗室建設(shè)項目“貴州分子生藥特色重點實驗室”[黔教合KY字(2013)108]

張 恩(1991-)，男，在讀碩士，研究方向：中藥資源分類與質(zhì)量控制。E-mail：gzyzhangen520@sina.com

*通訊作者：江維克(1962-)，男，教授，從事中藥資源調(diào)查與質(zhì)量評價研究。E-mail：jwk_88@163.com

1001-3601(2016)05-0223-0140-04

S38； R284.1

A