吳璐一 顧沐恩 朱 毅 劉慧榮 秦文政 黃 艷竇傳字 袁凌松 陸 穎 周次利 李 璟

(1 上海中醫(yī)藥大學上海市氣功研究所,上海,200030; 2 上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院,上海,200437;3 上海中醫(yī)藥大學上海市針灸經絡研究所,上海,200030; 4 上海中醫(yī)藥大學,上海,201203)

基于UPLC-Q/TOF MS技術的隔藥餅灸合募配穴治療UC大鼠的尿液代謝組學研究

吳璐一1顧沐恩2朱 毅3劉慧榮3秦文政4黃 艷3竇傳字3袁凌松3陸 穎1周次利3李 璟2

(1 上海中醫(yī)藥大學上海市氣功研究所,上海,200030; 2 上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院,上海,200437;3 上海中醫(yī)藥大學上海市針灸經絡研究所,上海,200030; 4 上海中醫(yī)藥大學,上海,201203)

目的：運用代謝組學用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜(UPLC-Q/TOF MS)技術探討隔藥餅灸合募配穴治療潰瘍性結腸炎(Ulcerative Colitis，UC)的作用機制。方法：27只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、隔藥餅灸合募配穴組，采用DSS水溶液飲用法制備UC大鼠模型。隔藥餅灸合募配穴組每次每穴各灸2壯，1次/d，共灸14次。治療結束后，搜集各組尿液，UPLC-Q/TOF MS分析檢測，主成分分析(PCA)分析和偏最小二乘法分析(PLS-DA)對數(shù)據(jù)進行處理，運用Metlin(http://metlin.scripps.edu/)、KEGG(http://www.kegg.jp)、HMDB(http://www.hmdb.ca)、MetaboAnalyst 3.0(http://www.metaboanalyst.ca)數(shù)據(jù)庫和網站，確認潛在生物標志物，分析代謝物通路。結果：正、負離子模式下，正常組、模型組、隔藥餅灸合募配穴組3組大鼠尿液在PLS-DA數(shù)據(jù)模型下分離趨勢良好。隔藥餅灸合募配穴可有效回調UC模型大鼠6個差異代謝物L-Cysteine(半胱氨酸)、Atraric acid、Tocopheronic acid、Dibutyl malate(二丁基蘋果酸鹽)、L-Tyrosine(酪氨酸)、L-Pipecolic acid(哌啶酸)表達，主要參與Phenylalanine，tyrosine and tryptophan biosynthesis(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成)、Cysteine and methionine metabolism(半胱氨酸和蛋氨酸代謝)、Tyrosine metabolism(酪氨酸代謝)等氨基酸代謝通路。結論：隔藥餅灸合募配穴治療UC可能主要與氨基酸代謝有關。

灸法；代謝組學；超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜；潰瘍性結腸炎

代謝組學是系統(tǒng)生物學的一種，通過代謝過程成中小分子代謝物的變化闡釋機體的生物學奧秘[1-2]，廣泛應用于醫(yī)學、藥物學、營養(yǎng)學、環(huán)境學等領域[3-6]。近年來，基于代謝組學技術優(yōu)勢，開展中醫(yī)防治疾病作用機制的現(xiàn)代化研究，越來越得到關注。

潰瘍性結腸炎(Ulcerative Colitis，UC)是一種世界范圍的疾病，全球患病率約5.3/105～238/105，呈逐年上升之勢[7]，持續(xù)或反復發(fā)作的腹瀉、黏液膿血便伴腹痛、里急后重，以及不同程度的全身癥狀是UC的主要臨床表現(xiàn)，病程多在4～6周以上[8]。眾多臨床研究顯示[9-11]：中醫(yī)灸法可有效改善UC患者腹痛、腹瀉等臨床癥狀，改善腸黏膜。然而灸法治療UC的作用機制仍有待于進一步深入研究。我們采用UPLC-Q/TOF MS技術開展隔藥餅灸合募配穴治療UC的代謝組學研究，以期從系統(tǒng)生物學角度探討灸法治療UC的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠，27只，雄性，清潔級，體重(180±20)g，由上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。

飼養(yǎng)環(huán)境為12 h晝夜節(jié)律交替，室溫(20±2)℃，相對濕度(50±10)%，普通飼料喂養(yǎng)，自由進食與飲水。

1.2 主要試劑與儀器 1)主要實驗材料與試劑：艾絨，南陽漢醫(yī)艾絨有限責任公司；甲醇、乙腈，均為質譜級溶劑，德國Merck(Darmstadt)公司，甲酸，色譜級溶劑，瑞士Fluka(Buchs)公司。

2)主要實驗儀器：液相色譜為Agilent1290 Infinity超高效液相系統(tǒng)(Agilent，美國)；質譜為Agilent 6538 Accurate-Mass Q-TOF/MS(Agilent，美國)。

1.3 模型制備 適應性飼養(yǎng)1周后，參照Fichna等[12]方法制備UC模型。造模大鼠分別采用3%DSS水溶液飲用7 d后，繼以濃度為1% DSS水溶液飲用4 d。

1.4 動物分組與干預 27只SD大鼠隨機分為3組，即：正常組、模型組、隔藥餅灸合募配穴組，每組9只。

正常組：不進行任何治療，與治療組做相同的固定。

模型組：不進行任何治療，與治療組做相同的固定。

隔藥餅灸合募配穴組：取穴：天樞(雙)、上巨虛(雙)(穴位定位參照李忠仁主編《實驗針灸學》，中國中醫(yī)藥出版社，2007年)。藥餅配方：附子(四川)、肉桂(廣西)、木香(云南)等輾粉，加黃酒拌成厚糊狀制成直徑0.5 cm，厚0.3 cm大小藥餅。艾炷大小約90 mg，每次每穴各灸2壯，1次/d，共灸14次。

1.5 標本采集 治療結束后，正常組、模型組、隔藥餅灸合募配穴組大鼠分別置于代謝籠中，單籠飼養(yǎng)，自由飲食，收集24 h尿液，1 000 r/min離心10 min，取上清，-80 ℃保存。

1.6 UPLC-Q/TOF MS代謝組學檢測

1.6.1 前處理條件 取100 μL尿液，加入300 μL內標溶液(含5 μg/mL L-2氯苯丙氨酸的甲醇溶液)，渦旋5 min，4 ℃下13 000 r/min離心15 min，取上清液即得供試品溶液。

1.6.2 UPLC-Q/TOF MS分析檢測 1)色譜條件。流動相：A：0.1%的甲酸水溶液，B：0.1%的甲酸乙腈溶液。梯度脫洗程序：0—1 min，5% B；1—13 min，5%～95% B；13—15 min，95% B。流速：0.4 mL/min，柱溫：40 ℃，進樣量：3 μL。

2)質譜條件。正模式下毛細管電壓為4 kV，負模式下3.5 kV。氣體溫度350 ℃，流速11 L/min，。噴霧電壓45psi，碎裂電壓120V，Skimmer1電壓60V。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用Agilent Masshunter Qualitative AnalysisB.04.00 software對數(shù)據(jù)進行采集。在R軟件平臺下，使用XCMS程序(http://metlin.scripps.edu/download/)進行峰的識別，保留時間校正，自動積分等。根據(jù)80%原則進行峰的篩選后，將所有離子以內標物質的分子離子峰(正離子模式下：200.0473；負離子模式下：198.0328)為標準離子進行歸一化處理。隨后，將數(shù)據(jù)矩陣導入Simca-P軟件(版本11.0)，Par標度化處理后，進行主成分分析(PCA)分析和偏最小二乘法分析(PLS-DA)。VIP>1的代謝物，進一步通過方差分析進行統(tǒng)計學分析，P<0.05則認為是差異代謝物。

將統(tǒng)計學意義離子的精確m/z值使用網絡數(shù)據(jù)庫Metlin(http://metlin.scripps.edu/)進行鑒別，結合KEGG(http://www.kegg.jp)、HMDB(http://www.hmdb.ca)、MetaboAnalyst 3.0(http://www.metaboanalyst.ca)數(shù)據(jù)庫和網站，確認潛在生物標志物，分析代謝物通路。MetaboAnalyst 3.0(http://www.metaboanalyst.ca)代謝物通路分析顯示Impact值>0.10者為重要代謝物通路[13-15]。

2 結果

2.1 PLS-DA得分圖 正、負離子模式下，正常組、模型組、隔藥餅灸合募配穴組大鼠尿液代謝物的PLS-DA得分圖如圖1、圖2所示。從圖1、圖2可見，3組大鼠尿液代謝物在PLS-DA數(shù)據(jù)模型下分離趨勢良好，提示正常組、模型組、隔藥餅灸合募配穴組大鼠尿液在內源性代謝物層面都發(fā)生了較為明顯的變化。

圖1 正離子模式下各組大鼠尿液

注：A：正常組，B：模型組，C：隔藥餅灸合募配穴組。

圖2 負離子模式下各組大鼠尿液

注：A：正常組，B：模型組，C：隔藥餅灸合募配穴組。

2.2 差異代謝物 各組大鼠尿液差異代謝物如表1所示。與正常組比較，模型組共有19個差異代謝物表達，其中L-Cysteine、Atraric acid、Tocopheronic acid等15個差異代謝物含量在模型組表達升高，Phosphorylcholine、Phenyl glucuronide、Dopamine等4個差異代謝物含量在模型組表達降低。隔藥餅灸合募配穴干預后，可有效回調6個差異代謝物L-Cysteine(半胱氨酸)、Atraric acid、Tocopheronic acid、Dibutyl malate(二丁基蘋果酸鹽)、L-Tyrosine(酪氨酸)、L-Pipecolic acid(哌啶酸)表達。

2.3 代謝通路 將隔藥餅灸合募配穴干預后，可有效回調的6個差異代謝物L-Cysteine、Atraric acid、Tocopheronic acid、Dibutyl malate、L-Tyrosine、L-Pipecolic acid導入MetaboAnalyst 3.0(http://www.metaboanalyst.ca)，進行代謝物通路分析。如圖3、表2所示，隔藥餅灸合募配穴組對UC大鼠Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis、Aminoacyl-tRNA biosynthesis、Phenylalanine，tyrosine and tryptophan biosynthesis、Thiamine metabolism等12條代謝通路產生影響。其中，Phenylalanine，tyrosine and tryptophan biosynthesis(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成)、Cysteine and methionine metabolism(半胱氨酸和蛋氨酸代謝)、Tyrosine metabolism(酪氨酸代謝)3條代謝通路Impact值>0.10，為重要代謝物通路。

圖3 隔藥餅灸合募配穴對UC大鼠代謝通路的影響

注：表2與圖3互為補充。圖3中的圓點代表相應代謝通路，按Y軸-log(P)值大小，從上往下，依次與表2中的代謝通路相對應。圓點的顏色代表代謝通路的P值，P值越小(-log(P)值越大)，顏色越紅；圓點的半徑大小代表代謝通路Impact值，Impact值越大，半徑越大。①-③為3條重要的代謝通路，①：Phenylalanine，tyrosine and tryptophan biosynthesis，②：Cysteine and methionine metabolism，③：Tyrosine metabolism。

3 討論

UC臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便，屬于中醫(yī)“腹痛”“泄瀉”“痢疾”等范疇。課題組前期研究顯示[16-18]：艾灸對UC等腸腑病內臟痛具有良好的鎮(zhèn)痛效應，可抑制腸道炎性反應，促進病變局部組織修復和/或功能改善，提高痛閾，調節(jié)中樞/病變局部神經遞質等疼痛相關物質水平，抑制腸纖維化。上巨虛、天樞分別為大腸的下合穴、募穴，合募配穴法是中醫(yī)針灸常用的治療腑病的配穴方法。UC病變以大腸為主，大腸為六腑之一?！端貑枴た日撈酚涊d“治腑者，治其合”，《靈樞·邪氣臟腑病形》也有言“合治內腑”，上巨虛為大腸下合穴，常用于腸腑疾病的治療。天樞為大腸募穴，募穴也是針灸臨床上用于治療腑病的主要穴位?！都滓医洝酚涊d“腹脹腸鳴，氣上沖胸，不能久立，腹中(切)痛(而鳴)濯濯。冬月重感于寒則瀉，當臍而痛，胃腸間游氣切痛，食不化，不嗜食，身腫，俠臍急，天樞主之”。劉朝等[19]采用計算機數(shù)據(jù)挖掘技術，分析針灸治療UC的診療現(xiàn)狀與特點，顯示天樞、上巨虛這2個穴位的使用頻次居前3位?？梢?，天樞、上巨虛是治療UC的常用有效穴位。因此，本研究中，我們采用隔藥餅灸天樞(雙)、上巨虛(雙)治療UC，從代謝組學角度進一步探討灸法治療UC的作用機制。

表1 各組大鼠尿液差異代謝物

注：A：正常組，B：模型組，C：隔藥餅灸合募配穴組。

表2 隔藥餅灸合募配穴對UC大鼠代謝通路的影響

代謝組學是繼基因組學、蛋白質組學、轉錄組學之后發(fā)展起來的一種系統(tǒng)生物學研究方法。中醫(yī)整體觀認為：人體是一個有機的整體，各細胞、組織、器官之間相互聯(lián)系，相互影響，單一的從某一靶點、信號通路等，不足以全面闡釋中醫(yī)防病治病的作用機制。代謝組學可通過新陳代謝動態(tài)過程中得相關代謝產物，闡釋機體的整體功能狀態(tài)、病理生理機制，與中醫(yī)的整體觀高度契合，近年來，在中醫(yī)領域研究運用越來越廣泛[20-24]。部分學者運用氣相色譜-質譜聯(lián)用(GC-MS)技術、超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜(UPLC-Q/TOF MS)技術等開展了中藥治療UC的代謝組學研究[25-26]，也有學者運用1HNMR技術開展了針刺足陽明經穴與非經非穴治療UC的代謝組學研究[27]。目前，灸法治療UC的代謝組學研究較少，本研究中，我們采用UPLC-Q/TOF MS技術開展隔藥餅灸合募配穴治療UC的代謝組學研究。

本研究中，隔藥餅灸合募配穴干預后，有效回調的6個差異代謝物參與機體Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis(輔酶q和其他類萜-醌生物合成)、Aminoacyl-tRNA biosynthesis(氨?；?tRNA生物合成)、Phenylalanine，tyrosine and tryptophan biosynthesis(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成)、Thiamine metabolism(硫胺素(維生素B1)代謝)等12條氨基酸代謝、輔酶因子與維生素代謝等相關通路。其中，3條重要代謝通路Phenylalanine，tyrosine and tryptophan biosynthesis(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成)、Cysteine and methionine metabolism(半胱氨酸和蛋氨酸代謝)、Tyrosine metabolism(酪氨酸代謝)均為氨基酸代謝通路，可見，調節(jié)機體氨基酸代謝是隔藥餅灸合募配穴治療UC的重要作用機制。

本研究中，UC模型組與正常組比較有19個差異代謝物表達，隔藥餅灸合募配穴干預后，可有效回調其中6個差異代謝物L-Cysteine(半胱氨酸)、Atraric acid、Tocopheronic acid、Dibutyl malate(二丁基蘋果酸鹽)、L-Tyrosine(酪氨酸)、L-Pipecolic acid(哌啶酸)表達。上述6個差異代謝物中，L-Tyrosine(酪氨酸)與L-Cysteine(半胱氨酸)是參與機體代謝通路較多的2種差異代謝物。L-Tyrosine(酪氨酸)參與了Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis(輔酶q和其他類萜-醌生物合成)、Aminoacyl-tRNA biosynthesis(氨酰基-tRNA生物合成)、Phenylalanine，tyrosine and tryptophan biosynthesis(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成)、Phenylalanine metabolism(苯丙氨酸代謝)、Tyrosine metabolism(酪氨酸代謝)5條代謝通路。L-Cysteine(半胱氨酸)則參與了Aminoacyl-tRNA biosynthesis(氨?；?tRNA生物合成)、Thiamine metabolism[硫胺素(維生素B1)代謝)]、Taurine and hypotaurine metabolism(?；撬岷蛠喤；撬岽x)、Pantothenate and CoA biosynthesis(泛酸鹽和輔酶a生物合成)、Glutathione metabolism(谷胱甘肽代謝)、Cysteine and methionine metabolism(半胱氨酸和蛋氨酸代謝)、Glycine，serine and threonine metabolism(甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝)7條代謝通路。L-Tyrosine(酪氨酸)、L-Cysteine(半胱氨酸)參與的上述代謝通路，均與機體氨基酸代謝、輔酶因子與維生素代謝、遺傳信息翻譯相關。隔藥餅灸合募配穴干預后影響的3條重要代謝通路Phenylalanine，tyrosine and tryptophan biosynthesis(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成)、Cysteine and methionine metabolism(半胱氨酸和蛋氨酸代謝)、Tyrosine metabolism(酪氨酸代謝)，均與L-Tyrosine(酪氨酸)、L-Cysteine(半胱氨酸)相關。Phenylalanine，tyrosine and tryptophan biosynthesis(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成)代謝通路中，L-Tyrosine(酪氨酸)的Impact值為0.5，Tyrosine metabolism(酪氨酸代謝)代謝通路中，L-Tyrosine(酪氨酸)的Impact值為0.14045，Cysteine and methionine metabolism(半胱氨酸和蛋氨酸代謝)代謝通路中，L-Cysteine(半胱氨酸)的Impact值為0.12829，顯示L-Tyrosine(酪氨酸)、L-Cysteine(半胱氨酸)與上述隔藥餅灸合募配穴干預后影響的3條重要代謝通路密切相關。與正常組比較，UC模型組大鼠19個尿液差異代謝物中，L-Cysteine(半胱氨酸)變化最為顯著，排第1位，升高2.20倍；L-Tyrosine(酪氨酸)變化也很顯著，排第5位，升高1.48倍，可見，L-Cysteine(半胱氨酸)、L-Tyrosine(酪氨酸)是介導UC病理機制的重要物質。隔藥餅灸合募配穴干預后，L-Cysteine(半胱氨酸)、L-Tyrosine(酪氨酸)均顯著降低，分別為UC模型組的0.54倍、0.41倍。上述結果顯示：L-Tyrosine(酪氨酸)、L-Cysteine(半胱氨酸)可能在隔藥餅灸合募配穴治療UC的過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，L-Tyrosine(酪氨酸)、L-Cysteine(半胱氨酸)，及其相關的Phenylalanine，tyrosine and tryptophan biosynthesis(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成)、Cysteine and methionine metabolism(半胱氨酸和蛋氨酸代謝)、Tyrosine metabolism(酪氨酸代謝)3條氨基酸代謝通路，可能在隔藥餅灸合募配穴治療UC的過程中發(fā)揮重要作用。

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(2016-12-07收稿 責任編輯：洪志強)

Urine Metabonomic Research of Herbs-partition Moxibustion with Mactching Mu Points in UC Rats Based on UPLC-Q/TOF MS

Wu Luyi1,Gu Muen2,Zhu Yi2,Liu Huirong2,Qin Wenzheng3,Huang Yan2, Dou Chuanzi2,Yuan Lingsong2,Lu Ying1,Zhou Cili2,Li Jing4

(1ShanghaiQigongResearchInstitute,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200030,China; 2DepartmentofAcupuncture,YueyangHospitalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200437China; 3ShanghaiResearchInstituteofAcupunctureandMeridian,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200030,China; 4ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200437,China)

Objective:To explore the mechanism of herbs-partition moxibustion with the matching mu points in treating UC rats based on metabonomic with UPLC-Q/TOF MS. Methods:Sprague-Dawley rats of 27 cases were randomly divided into normal group, model group, herbs-partition moxibustion with the mactching mu points group. The UC rat model was established by drinking DSS aqueous solution. In herbs-partition moxibustion with the matching mu points group, each point moxibustion with 2 moxa cones, once per day, and lasting for 14 days. After moxibustion treatment, all groups urine was analyzed with UPLC-Q/TOF MS. The acquired data were analyzed using principal component analysis (PCA) and partial leastsquares discriminant analysis (PLS-DA).The potential biomarkers and metabolic pathways were analyzed by Metlin(http://metlin.scripps.edu/), KEGG(http://www.kegg.jp), HMDB (http://www.hmdb.ca), MetaboAnalyst 3.0(http://www.metaboanalyst.ca). Results:Under both positive ion model and negative ion model, the separation trends of 3 groups urine were good. Herbs-partition moxibustion with the matching mu points effectively reduced in 6 different metabolites expression, such as L-cysteine, atraric acid、tocopheronic acid, dibutyl malate、L-tyrosine、L-pipecolic acid, which increased in model group. All 6 different metabolites above were mainly related to amino acid metabolic pathways, such as phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis, cysteine and methionine metabolism, tyrosine metabolism, and so on. Conclusion:The mechanism of herbs-partition moxibustion with the matching mu points in treating UC may mainly relate to amino acid metabolism.

Moxibustion; Metabonomic; UPLC-Q/TOF MS; Ulcerative colitis

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(“973”計劃)項目(編號：2009CB522900；2015CB554501)；國家自然科學基金青年項目(編號：81303033)；上海市科技啟明星計劃基金資助項目(編號：16QA1403400)

李璟，主任醫(yī)師，研究生導師，主要研究方向：針灸胃腸疾病的臨床與基礎研究；周次利，博士，副研究員，主要研究方向：針灸作用機制與臨床研究

R245.8

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.12.009