張小華　沈濤　梁海寧　李季文　畢映燕

摘要：目的 建立反相高效液相色譜法測(cè)定益氣固本顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和藁本內(nèi)酯含量的方法。方法 采用Waters SymmetryShield C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.2%甲酸梯度洗脫溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。結(jié)果 毛蕊異黃酮葡萄糖苷的線性范圍為0.162～0.810 μg（r=0.999 6），加樣回收率為99.64%（RSD=1.94%）。藁本內(nèi)酯的線性范圍為0.386～1.930 μg（r=0.999 8），加樣回收率為98.56%（RSD=1.60%）。結(jié)論 該方法可為益氣固本顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：益氣固本顆粒；反相高效液相色譜法；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；藁本內(nèi)酯

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.022

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）02-0079-03

Simultaneous Determination of Calycosin-7-glycoside and Ligustilide in Yiqi Guben Particles by RP-HPLC ZHANG Xiao-hua， SHEN Tao， LIANG Hai-ning， LI Ji-wen， BI Ying-yan （Pharmacy Department， Gansu Province Hospital of Traditional Chinese Medicine， Lanzhou 730050， China）

Abstract： Objective To develop a RP-HPLC method for determining the contents of calycosin-7-glycoside and ligustilide in Yiqi Guben Particles. Methods The contents of calycosin-7-glycoside and ligustilide were determined with a Waters SymmetryShield C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm）. The mobile phase was acetonitrile-0.2% formic acid with gradient elution. The detection wavelength was 260 nm. Results The linear range of calycosin-7-glycoside was within 0.162–0.810 μg （r=0.999 6）， and the recovery rate was 99.64% （RSD=1.94%）. The linear range of ligustilide was within 0.386–1.930 μg （r=0.999 8）， and the recovery rate was 98.56% （RSD=1.60%）. Conclusion This method can provide experimental basis for quality control of Yiqi Guben Particles.

Key words： Yiqi Guben Particles； RP-HPLC； calycosin-7-glycosidase； ligustilide

益氣固本顆粒是由本院展銳主任醫(yī)師臨床經(jīng)驗(yàn)方研制而成的顆粒劑，全方由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、當(dāng)歸等8味中藥組成，具有益氣固本、溫腎健脾、扶正祛邪功效，通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤患者免疫功能，扶正抗癌，從而提高患者生存質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期。黃芪具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、生津養(yǎng)血等功效，為方中主藥。毛蕊異黃酮葡萄糖苷是2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》[1]規(guī)定的黃芪質(zhì)量控制的特征指標(biāo)。藁本內(nèi)酯是當(dāng)歸抗腫瘤、鎮(zhèn)痛消炎的主要成分，在其揮發(fā)油中含量最高[2-3]。對(duì)處方中毛蕊異黃酮葡萄糖苷及藁本內(nèi)酯進(jìn)行準(zhǔn)確定量，是該制劑質(zhì)量控制的關(guān)鍵步驟。本試驗(yàn)建立同時(shí)測(cè)定益氣固本顆粒中毛蕊異黃酮葡萄

基金項(xiàng)目：甘肅省科技支撐計(jì)劃（1304FKCA105）

糖苷及藁本內(nèi)酯的反相高效液相色譜（RP-HPLC）方法，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的擬定提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters HPLC系統(tǒng)，包括Waters 1525二元泵（美國(guó)Waters公司），Waters 2487雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司），Bree色譜工作站；HS6150型超聲波清洗器（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）；METTLER AE240電子分析天平（賽多利斯公司）；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

益氣固本顆粒（甘肅省中醫(yī)院，批號(hào)20140319、20140514、20141106），毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（天津一方科技有限公司，批號(hào)AB019C-a，純度≥99%），藁本內(nèi)酯對(duì)照品（天津一方科技有限公司，批號(hào)AB086L，純度≥99%），乙腈為色譜純（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters SymmetryShield C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈為流動(dòng)相A，0.2%甲酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（見(jiàn)表1）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL[4-6]。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品0.81 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇適量使溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為81 ?g/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液A液。精密稱取藁本內(nèi)酯對(duì)照品38.53 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，取0.5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為193 ?g/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液B液。將上述對(duì)照品儲(chǔ)備液A液和B液按1∶1比例混合均勻，經(jīng)0.45 ?m濾膜過(guò)濾，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取益氣固本顆粒約1 g，精密稱定，研細(xì)，置具塞錐形瓶中，加甲醇定容至10 mL，超聲處理（功率150 W，頻率40 kHz）20 min，放冷，搖勻，經(jīng)0.45 ?m濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

按益氣固本顆粒的處方及制備方法，制備不含黃芪、當(dāng)歸的顆粒，作為陰性樣品。取陰性樣品約1 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液進(jìn)樣測(cè)定，毛蕊異黃酮葡萄糖苷及藁本內(nèi)酯的保留時(shí)間分別為19.8、28.5 min，分離度均>1.5。結(jié)果表明，樣品中其他成分對(duì)毛蕊異黃酮葡萄糖苷及藁本內(nèi)酯的測(cè)定無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.6 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液A液和B液適量，用甲醇稀釋成毛蕊異黃酮葡萄糖苷濃度分別為16.25、32.4、48.62、64.9、81 ?g/mL，藁本內(nèi)酯濃度分別為38.6、77.2、115.8、154.4、193 ?g/mL的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積對(duì)進(jìn)樣濃度進(jìn)行回歸分析，得回歸方程。毛蕊異黃酮葡萄糖苷Y=153 636X+3853.7（r=0.999 6），線性范圍為0.162～0.810 μg；藁本內(nèi)酯Y=2.153×106X+0.1833（r=0.999 8），線性范圍為0.386～1.930 μg。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取上述混合對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)其峰面積，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷及藁本內(nèi)酯的峰面積RSD分別為0.43%、1.22%，表明儀器精密度較好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一批號(hào)益氣固本顆粒（批號(hào)20140514）6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷及藁本內(nèi)酯濃度分別為0.21、0.89 mg/g，RSD分別為0.42%、0.77%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一批號(hào)益氣固本顆粒（批號(hào)20140514），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別在放置0、2、4、6、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算毛蕊異黃酮葡萄糖苷及藁本內(nèi)酯峰面積的RSD分別為1.31%、1.20%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的益氣固本顆粒（批號(hào)20140514）約1 g，平行6份，分別精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷及藁本內(nèi)酯對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.11 樣品含量測(cè)定

取3個(gè)批次供試品，每批平行3份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷及藁本內(nèi)酯含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

供試品溶液的制備比較了甲醇、70%甲醇、50%甲醇及乙醇為提取溶劑[7]，結(jié)果顯示，使用甲醇提取有效成分時(shí)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷及藁本內(nèi)酯提取較為完全，且雜質(zhì)峰較少，主峰分離度好。同時(shí)，比較了超聲20 min及超聲40 min，結(jié)果表明，提取時(shí)間太長(zhǎng)則藁本內(nèi)酯含量減少較明顯，故選擇甲醇超聲提取20 min的方法進(jìn)行供試品溶液的制備。

檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇，文獻(xiàn)報(bào)道毛蕊異黃酮葡萄糖苷最大吸收波長(zhǎng)為260 nm[8]，藁本內(nèi)酯多在320 nm進(jìn)行含量測(cè)定[9]。本研究測(cè)定過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，260 nm波長(zhǎng)下毛蕊異黃酮葡萄糖苷及藁本內(nèi)酯吸收度值均較高，而在320 nm波長(zhǎng)下毛蕊異黃酮葡萄糖苷幾乎無(wú)吸收度值，故選擇在260 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行2個(gè)成分的同時(shí)測(cè)定。

本試驗(yàn)曾采用乙腈-0.2%甲酸溶液（30∶70）等度洗脫方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷分離度不好，且藁本內(nèi)酯出峰時(shí)間較長(zhǎng)。隨后采用乙腈- 0.2%甲酸溶液梯度洗脫的方法，得到的色譜峰峰型和分離度較好，同時(shí)縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢驗(yàn)效率。

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（收稿日期：2015-01-19）

（修回日期：2015-01-29；編輯：陳靜）