吳晶 王亮 曹永兵 閻瀾 姜遠(yuǎn)英

(中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433)

·論著·

《中藥大辭典》記載的抗真菌中藥體外藥效再評(píng)價(jià)

吳晶 王亮 曹永兵 閻瀾 姜遠(yuǎn)英

(中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433)

目的 對(duì)《中藥大辭典》中記載有抗真菌藥理作用的127種中藥醇提物進(jìn)行體外抗深部感染真菌 (白念珠菌、新生隱球菌、煙曲霉)的研究。方法 采用75%乙醇超聲提取法對(duì)127種中藥進(jìn)行統(tǒng)一提取，參考CLSI微量液基稀釋法M27-A3和M38-A2方案進(jìn)行抗白念珠菌、新生隱球菌、煙曲霉的最低抑菌濃度 (MIC)測(cè)定，并進(jìn)一步考察其抗菌譜及抑制菌絲作用。結(jié)果 在2 mg/mL濃度下，僅博落回等17種中藥、月季花等34種中藥、黃柏等5種中藥分別對(duì)白念珠菌、新生隱球菌、煙曲霉有抑制作用，其中博落回和粉萆薢的抗菌譜廣；在4 mg/mL濃度下，127種中藥中僅粉萆薢和藜蘆能完全抑制菌絲生長(zhǎng)，最低濃度分別為200 μg/mL和500 μg/mL。結(jié)論 首次用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)對(duì)《中藥大辭典》中記載的抗真菌中藥進(jìn)行體外活性篩選，并對(duì)其藥效進(jìn)行再評(píng)價(jià)，為新型抗真菌藥物開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)和參考。

《中藥大辭典》；抗真菌；中藥；白念珠菌；新生隱球菌；煙曲霉

[Chin J Mycol，2016，11(6):348-353]

深部真菌感染的發(fā)病率和死亡率日益增加，臨床上常見(jiàn)的抗真菌藥物 (兩性霉素B脂質(zhì)體、氟康唑、棘白菌素類等)存在抗菌譜窄、耐藥性嚴(yán)重、價(jià)格高且均有不同程度毒副作用等問(wèn)題[1-2]。傳統(tǒng)中藥是中華民族的偉大寶庫(kù)，歷史悠久、臨床療效顯著，在化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制方面均存在多樣性，值得我們?nèi)ド钊胪诰颉！吨兴幋筠o典 (第二版)》對(duì)中藥的抗真菌藥理活性和臨床療效有較為全面的收錄，如收錄的一枝黃花對(duì)紅色毛癬菌有極強(qiáng)殺菌作用，其水煎醇提液有抗白念珠菌作用，其療效與制菌霉素相當(dāng)；丁香中丁香酚體外對(duì)多種皮膚癬菌有抑殺作用；白屈菜中白屈菜紅堿和血根堿混合物具抗真菌作用，對(duì)犬小孢子菌和絮狀表皮癬菌及煙曲霉有抗真菌活性；黃柏其水煎劑對(duì)多種致病性皮膚癬菌均有不同程度抑制作用；黃連其水煎劑對(duì)紫色毛癬菌、白念珠菌、絮狀表皮癬菌等14種皮膚真菌呈抑制作用等。但其收錄標(biāo)準(zhǔn)不一，對(duì)應(yīng)的參考文獻(xiàn)較為零散，且年代較早，不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)中藥的提取方法不一、篩選方法未能標(biāo)準(zhǔn)化，不能在同一水平進(jìn)行活性強(qiáng)弱的比較，有些中藥產(chǎn)生抗真菌活性的濃度較高，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值較低；且研究多數(shù)限于淺表部感染真菌，對(duì)深部真菌感染的探究較少[3-4]。目前日益嚴(yán)重的侵襲性真菌感染致死率高，從資源豐富的中藥中尋找有臨床應(yīng)用價(jià)值的抗深部真菌感染藥物有重要意義[5-7]。因此，本研究對(duì)《中藥大辭典》中報(bào)道的具有抗真菌作用的中藥再次進(jìn)行考證，旨在建立科學(xué)、規(guī)范、實(shí)用、統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)抗深部真菌作用進(jìn)行體外藥效再評(píng)價(jià)，并研究其對(duì)白念珠菌菌絲的抑制作用。活性較好的中藥進(jìn)一步擴(kuò)大抗菌譜，探究其對(duì)非白念珠菌和常見(jiàn)皮膚癬菌的抑制作用，為中藥現(xiàn)代化和新型抗真菌藥物的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株 白念珠菌 (Candidaalbicans)標(biāo)準(zhǔn)菌SC5314、敏感菌Y0109由美國(guó)華盛頓喬治敦大學(xué)的WilliamA.Fonzi教授惠贈(zèng)，白念珠菌耐藥菌 (Candidaalbicans)102、103、近平滑念珠菌 (Candidaparapsilosis)ATCC 22019、光滑念珠菌 (Candidaglabrata)537、新生隱球菌 (Cryptococcusneoformans)32609、石膏樣小孢子菌 (Microsporumgypseum)、紅色毛癬菌 (Trichophytonrubrum)、煙曲霉 (Aspergillusfumigatus)7544均由長(zhǎng)海醫(yī)院真菌室提供。所有菌株已經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子鑒定。

藥物 127種中藥材購(gòu)自上海雷允上大藥店、上海虹橋飲片廠、亳州同仁堂大藥店；氟康唑 (Fluconazole，F(xiàn)LC)、伏立康唑 (Voriconazole，VCZ)及酮康唑 (Ketoconazole，KCZ)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)試劑。

培養(yǎng)基 RPMI 1640液體培養(yǎng)液：RPMI 1640 10 g，NaHCO32.0 g，嗎啡啉丙磺酸34.5 g，NaOH調(diào)pH至7.0，三蒸水定容1 000 mL，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌；4℃保存?zhèn)溆?。Spider培養(yǎng)液 (pH 7.2)：營(yíng)養(yǎng)肉湯10 g，甘露醇10 g，K2HPO42 g，三蒸水定容1 000 mL，高壓滅菌，保存于4℃?zhèn)溆?。YEPD培養(yǎng)液：酵母浸膏10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g，加三蒸水900 mL溶解，加入2 mg/mL氯霉素水溶液50 mL，三蒸水定容至1 000 mL，高壓滅菌，于4℃保存。沙堡葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (SDA)：蛋白胨10 g、葡萄糖40 g、瓊脂18 g，加三蒸水900 mL溶解，加入2 mg/mL氯霉素水溶液50 mL，調(diào)整pH值至7.0，定容至1 000 mL，高壓滅菌，4℃保存[8]。

儀器 DL-1000B智能超聲波清洗器 (上海之信儀器有限公司)，SW-CT-IF型單人雙面超凈化工作臺(tái) (蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 (丹麥Nunclon公司)，12孔細(xì)胞培養(yǎng)板 (美國(guó)Corning公司)，80A漩渦混合器 (上海琪特分析儀器有限公司)，THZ-82A臺(tái)式恒溫振蕩器 (上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 (上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，XW-Multiskan MK3型酶標(biāo)儀 (芬蘭Labsystems公司)，倒置顯微鏡 (美國(guó)AMG○REVOS公司)，單反相機(jī) (日本Nikon公司)。

1.2 方法

中藥的提取[9]中藥材50 g研磨成粉末，過(guò)20目篩，5倍量的75%乙醇50℃浸泡24 h，超聲提取30 min，2次，合并2次提取液，離心取上清液，得終濃度為200 mg/mL的生藥提取液，置于4℃冰箱備用[1]。

陽(yáng)性對(duì)照藥物的配制 二甲亞砜 (DMSO)溶解FLC、VCZ、KCZ，配制成6.4 μg/mL藥物母液，置于4℃冰箱備用。

酵母菌活化 于35℃ SDA，孵育24～48 h，挑取單個(gè)菌落接種至YEPD培養(yǎng)液，于30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h后，使其處于指數(shù)生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，以保證菌的純度和活力；絲狀菌煙曲霉35℃馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基孵育7 d，無(wú)菌紗布過(guò)濾。

菌懸液配制[10-11]血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整酵母菌液濃度至 (0.5～2.5)×103CFU/mL、絲狀菌液濃度 (0.5～2.5)×104CFU/mL用于藥敏實(shí)驗(yàn)。離心收集生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期白念珠菌，用滅菌的PBS緩沖溶液 (pH 7.2)清洗3次，將白念珠菌細(xì)胞混懸于1 mL Spider培養(yǎng)液中，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)菌濃度為1.0×106cells/mL用于菌絲生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)[10-11]。

藥物敏感測(cè)試板的制備 按2009年和2008年CLSI推薦標(biāo)準(zhǔn)M27-A3和M38-A2方案[10-12]：取無(wú)菌96孔板，于每排1號(hào)孔加RPMI 1640液體培養(yǎng)基100 μL作空白對(duì)照；3～12號(hào)孔各加新鮮配制的菌液100 μL；2號(hào)孔分別加菌液198 μL和中藥粗體物2 μL；2～11號(hào)孔進(jìn)行2倍倍比稀釋，使各孔的最終藥物濃度分別為2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.813、3.906 μg/mL，各孔中乙醇的含量均低于1%。12號(hào)孔不含藥物，只加菌液100 μL作生長(zhǎng)對(duì)照。作為陽(yáng)性對(duì)照藥的FLC、VCZ和KCZ的終濃度分別為16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5和0.031 3 μg/mL。各孔中DMSO的含量均低于1%。藥敏板于35℃隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，念珠菌和煙曲霉孵育48 h、新生隱球菌孵育72 h，用酶標(biāo)分析儀于630 nm測(cè)各孔OD值，并輔以目測(cè)。

最低抑菌濃度 (MIC值) 與生長(zhǎng)對(duì)照孔比較≥90%生長(zhǎng)抑制所對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度為氟康唑和中藥提取物的MIC90。生長(zhǎng)對(duì)照孔的OD值控制在0.2左右，與生長(zhǎng)對(duì)照孔比，以O(shè)D值下降90%以上的最低濃度孔中的藥物濃度為MIC90(真菌生長(zhǎng)90%被抑制時(shí)的藥物濃度)。中藥提取物大多顏色較深可能產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，輔以目測(cè)，以肉眼觀察無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度為最低抑菌濃度。每塊藥敏板均設(shè)有質(zhì)控菌株及質(zhì)控化合物，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中質(zhì)控株近平滑念珠菌ATCC22019、質(zhì)控化合物氟康唑、伏立康唑、酮康唑MIC波動(dòng)范圍不超過(guò)1個(gè)藥物梯度濃度，且均在CLSI-M27-A3和CLSI-M38-A2公布的質(zhì)控菌株MIC標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，即本研究中實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)可靠。實(shí)驗(yàn)在不同時(shí)間段重復(fù)3次，3次結(jié)果不超過(guò)一個(gè)濃度差則可信，且以高濃度MIC為準(zhǔn)，若不符，再次重復(fù)測(cè)定。

菌絲生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn) 在無(wú)菌12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入1 mL菌懸液，加入含有不同藥物濃度中藥醇提取液 (乙醇含量低于5%)，37℃隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)3 h，在EVOS xl型倒置顯微鏡下觀察菌絲生長(zhǎng)狀況并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 127種中藥醇提物體外抗深部真菌結(jié)果

考慮到體外藥敏實(shí)驗(yàn)MIC值與臨床用藥劑量的相關(guān)性，我們將MIC>2 000 μg/mL的中藥視為沒(méi)有抗真菌活性。按此標(biāo)準(zhǔn)，《中藥大辭典》中收錄的127種中藥醇提物中，以下92種對(duì)白念珠菌、煙曲霉、新生隱球菌的MIC均>2 000 μg/mL，視為無(wú)效：八角科 (八角茴香)百部科 (百部)百合科 (黃精、石刁柏、知母、浙貝母)敗醬科 (甘松)車前科 (車前草)唇形科 (薄荷、迷迭香)動(dòng)物界 (蜈蚣)豆科 (番瀉葉、黑大豆、苦豆子、望江南、皂莢、廣金錢草)鳳尾蕨科 (鳳尾草)鳳仙花科 (鳳仙花、鳳仙透骨草)橄欖科 (沒(méi)藥)谷精草科 (谷精草)禾本科 (麥芽)胡椒科 (胡椒)姜科 (山奈、生姜)堇菜科 (紫花地丁)桔?？?(半邊蓮、沙參)菊科 (款冬花、艾葉、白術(shù)、蒼耳子、蒼術(shù)、菊花、蒲公英、一枝黃花)礦物 (白礬、雌黃、硫黃、硼砂、輕粉、自然銅)蘭科 (白及)藜科 (地膚子、土荊芥)楝科 (苦楝皮)蓼科 (萹蓄、辣蓼、靈芝、蓼大青葉)麻黃科 (麻黃)馬齒莧科 (馬齒莧)馬兜鈴科 (馬兜鈴、細(xì)辛)毛茛科 (白頭翁、石龍芮、唐松草、威靈仙)木通科 (木通、連翹)薔薇科 (烏梅)茄科 (枸杞子)忍冬科 (金銀花)傘形科 (防風(fēng)、蛇床子、小茴香)?？?(桑白皮、桑葉)莎草科 (香附)商陸科 (商陸)十字花科 (萊菔子、青黛)石榴科 (石榴皮)松科 (松節(jié))天南星科 (水菖蒲)五加科 (海桐皮、刺人參)仙人掌科 (仙人掌)莧科 (倒扣草)繡線菊亞科 (木瓜)玄參科 (玄參、地黃)鳶尾科 (射干)蕓香科 (白鮮皮、花椒、浙桐皮、枳實(shí))樟科 (香葉)真菌界 (馬勃)紫草科 (紫草)檳榔科 (檳榔)。

<2 000 μg/mL濃度下，博落回等17種中藥對(duì)白念珠菌有抑制作用，月季花等34種中藥對(duì)新生隱球菌有抑制作用，黃柏等5種中藥對(duì)煙曲霉有抑制作用；月季花、丁香、肉桂對(duì)3株深部真菌均有抑制作用；博落回、月季花、藜蘆、粉萆薢、硬水黃連、黃柏6種中藥對(duì)白念珠菌抑制作用明顯，MIC在31.25～250 μg/mL之間，且僅月季花和黃柏對(duì)煙曲霉有抑制作用，MIC為1 000 μg/mL和500 μg/mL。詳見(jiàn)表1 (按白念珠菌抑制作用從大到小排序)。

2.2 抗菌效果較好的中藥對(duì)10種常見(jiàn)致病真菌的MIC

博落回、月季花、藜蘆、粉萆薢、硬水黃連、黃柏6種中藥醇提物的白念珠菌MIC值均<250 μg/mL，抑制效果較好。因此，擴(kuò)大其抗菌譜，對(duì)白念珠菌耐藥菌株、非白念珠菌和常見(jiàn)皮膚癬菌進(jìn)行探究。研究表明：博落回和月季花抑制白念珠菌效果較其他藥材強(qiáng)，MIC在15.625～31.25 μg/mL；博落回和粉萆薢抗菌譜廣，對(duì)7種真菌均有抑制作用。詳見(jiàn)表2。

表1 35種中藥醇提物對(duì)3種深部真菌的MIC值

Tab.1 The MICs of antifungal activity of ethanol extracts from 35 traditional Chinese medicine

編號(hào)中藥名藥材批號(hào)新生隱球菌32609(μg/mL)煙曲霉7544(μg/mL)白念標(biāo)準(zhǔn)菌sc5314(μg/mL)白念敏感菌Y0109(μg/mL)VCZ陽(yáng)性對(duì)照藥0.01560.250.01560.0625KCZ陽(yáng)性對(duì)照藥0.12540.1250.0625FCZ陽(yáng)性對(duì)照藥2>640.50.251博落回484915.625-31.2515.6252月季花09637.813100031.2515.6253藜蘆588162.5-12562.54粉萆薢433062.5-2502505硬水黃連42007.813-2502506黃柏4202-5002502507丁香002231.2510005002508厚樸3430250-5002509白蘞1427250-100050010羊蹄197331.25-100025011大黃0181500-2000200012孩兒茶36741000-2000200013蘆薈22302000-2000200014木香1501000-2000100015肉桂181612510002000200016土荊皮0160125-2000200017梔子33561000-2000100018白果1418500---19白屈菜14715001000--20藏茴香58331000---21草果3177250---22澄茄子5743250---23大風(fēng)子0188500---24大蒜01832000---25廣玉蘭0450500---26紅豆蔻20801000---27紅毛七20681000---28槐花52751000---29藿香59222000---30決明子19472000---31牛蒡根08722000---32啤酒花45682000---33野升麻44411000---34使君子28782000---35香茅35062000---

注：-表示>2 000 μg/mL

2.3 考察對(duì)白念珠菌菌絲形成的影響

前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)75%乙醇含量高于10%能完全抑制菌絲形成，3%菌絲則正常生長(zhǎng)。因此，我們選取最大測(cè)試體積為20 μL/孔 (乙醇含量為2%)，即最高藥物濃度為4 mg/mL，作為粗步篩選最高濃度。通過(guò)考察127種中藥醇提物對(duì)白念珠菌菌絲形成的影響我們發(fā)現(xiàn)：在4 mg/mL濃度下，這127種中藥醇提物，僅粉萆薢和藜蘆能完全抑制菌絲生長(zhǎng)，完全抑制菌絲最低濃度分別為200 μg/mL和500 μg/mL (見(jiàn)圖1)。

3 討 論

《中藥大辭典》載藥6 008種，是收載藥物較為全面的中醫(yī)藥領(lǐng)域工具書，對(duì)傳統(tǒng)中藥主要藥理作用和臨床應(yīng)用均有較為詳細(xì)的收錄，其中以抗真菌藥理作用進(jìn)行檢索，共收錄202種。相比散見(jiàn)于各醫(yī)藥雜志和綜合性醫(yī)藥書籍的藥理作用研究，其收錄較為全面，參閱便捷，但收載標(biāo)準(zhǔn)不一，無(wú)法比較抗菌作用強(qiáng)弱，以便更好發(fā)掘抗真菌新藥[3-4]。因此我們首次針對(duì)3種常見(jiàn)深部感染真菌，用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)對(duì)《中藥大辭典》中記載的具有抗真菌藥理活性的中藥醇提物進(jìn)行了體外抗真菌作用再評(píng)價(jià)。但由于部分中藥為冷背藥材，獲得渠道有限，目前我們僅研究其中127種。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，我們將盡力完善剩余中藥的抗真菌活性評(píng)價(jià)。

目前，抗真菌中藥研究的標(biāo)準(zhǔn)比較混亂，為保證方法上的統(tǒng)一性，在中藥提取方面，實(shí)驗(yàn)前期我們將文獻(xiàn)報(bào)道較好的中藥 (黃連、黃柏等18味中藥)進(jìn)行了水提物、30%醇提、75%醇提的抗白念珠菌活性測(cè)定，以及參考部分研究[13]，發(fā)現(xiàn)同批中藥75%乙醇提取物的抗真菌效果較好，且75%醇提物抗菌效果最好，能避免中藥提取液被細(xì)菌污染，能保證實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性，同時(shí)超聲提取法與傳統(tǒng)中藥水煎提取相比，具有提取效率高、適應(yīng)性廣、簡(jiǎn)單易行、重復(fù)性高的優(yōu)勢(shì)，因此本實(shí)驗(yàn)研究我們僅選取75%乙醇超聲提取液來(lái)進(jìn)行抗真菌作用的考察。為減少溫度及操作誤差對(duì)結(jié)果的影響，我們也盡量保證藥物集中干燥、粉碎、恒溫箱50℃浸泡24 h后提取。體外活性篩選方面，本研究采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì) (CLSI)推薦的M27-A3和M38-A2微量稀釋法，該方法簡(jiǎn)單易行，結(jié)果可靠、重復(fù)性好，便于實(shí)驗(yàn)室之間比較；MIC結(jié)構(gòu)判定方面，采用機(jī)測(cè)與目測(cè)相結(jié)合的判定方法，以避免中藥本身顏色可能對(duì)吸光度的影響。本研究結(jié)果均平行測(cè)試了3次以上，每次3個(gè)復(fù)孔，以保證結(jié)果的可重現(xiàn)性。誠(chéng)然藥材的產(chǎn)地不同、批號(hào)不同、亞種不同也會(huì)對(duì)其抗真菌活性造成誤差，我們盡量確保來(lái)源的正規(guī)性，對(duì)有效中藥進(jìn)行不同來(lái)源的活性篩選，盡量減少偶然誤差，以保證結(jié)果的可靠性。

表2 6種中藥醇提物對(duì)10種常見(jiàn)致病真菌的抑制作用

注：-表示>2 000 μg/mL

圖1 粉萆薢和藜蘆對(duì)白念珠菌菌絲形成的影響

本實(shí)驗(yàn)部分結(jié)果與《中藥大辭典》中報(bào)道的活性存在差異，如白礬、白鮮皮、連翹、山柰等藥材報(bào)道中具有殺菌作用[3-4]，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果并未檢測(cè)到活性，表明部分傳統(tǒng)認(rèn)為具有抗真菌活性的中藥可能并無(wú)抗菌活性。但同時(shí)我們也應(yīng)考慮由于不同的提取方法、測(cè)試菌株、實(shí)驗(yàn)方法以及有效濃度判定標(biāo)準(zhǔn)不一等因素所造成的體外藥敏結(jié)果差異[13-15]和某些體外無(wú)抗真菌作用的中藥，通過(guò)體內(nèi)代謝或增強(qiáng)機(jī)體免疫力以達(dá)到抗菌作用的可能性，后續(xù)研究也從體內(nèi)外兩方面同時(shí)考察其抗菌活性。

同一中藥對(duì)不同的菌株影響也不同，在擴(kuò)大抗菌譜試驗(yàn)中，博落回、月季花、藜蘆、粉萆薢、硬水黃連、黃柏對(duì)白念珠菌臨床耐藥菌也有較好的活性，其中博落回、粉萆薢、黃柏對(duì)白念標(biāo)準(zhǔn)菌和臨床耐藥菌MIC并無(wú)差異，表明了中藥耐藥性低的優(yōu)勢(shì)。博落回和粉萆薢對(duì)9株真菌有抑制作用，博落回對(duì)酵母菌的抑制作用強(qiáng)于粉萆薢，但對(duì)絲狀菌的抑制作用弱于粉萆薢；對(duì)酵母菌抑制作用較好的藜蘆、硬水黃連在測(cè)定濃度下對(duì)絲狀菌并無(wú)作用，該結(jié)果提示我們深部真菌與淺部真菌的作用靶點(diǎn)可能不同。

本實(shí)驗(yàn)還探究了中藥醇提物對(duì)白念珠菌菌絲形成的抑制作用，初步考察了中藥對(duì)菌絲毒力的影響，發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍下，僅粉萆薢和藜蘆能完全抑制菌絲生長(zhǎng)，進(jìn)一步豐富了中藥抗真菌的理論基礎(chǔ)。

中藥資源豐富、療效好、毒副作用小、在我國(guó)有上千年的實(shí)踐基礎(chǔ)，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)、科學(xué)、現(xiàn)代化的基礎(chǔ)研究，有助于理論數(shù)據(jù)的更新，更好的進(jìn)行抗真菌新藥的深入挖掘。但中藥種類繁多，提取物中的化學(xué)成分及藥理活性尚不能完全明確，致使抗真菌的物質(zhì)基礎(chǔ)和毒理反應(yīng)亦不能明確。因此，下一步工作重點(diǎn)包括：橫向方面，擴(kuò)大篩選范圍，對(duì)未報(bào)道具有抗真菌中藥的空白領(lǐng)域進(jìn)行活性考察，尋找高效低毒抗真菌中藥；縱向方面，將體外活性較好的中藥進(jìn)行體內(nèi)活性驗(yàn)證，并活性導(dǎo)向分離其有效成分，為研制新型抗真菌藥物奠定基礎(chǔ)。

[1] Denning DW，BromLey MJ.Infectious disease.How to bolster the antifungal pipeline[J].Science,2015,347(6229)：1414-1416.

[2] Eschenauer GA，Nguyen MH，Clancy CJ.Is fluconazole or an echinocandin the agent of choice for candidemia[J].Ann Pharmacother,2015,49(9)：1068-1074.

[3] 南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典[M].第二版.上海：上?？萍汲霭嫔?2013：1-15.

[4] 南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典附編[M].第二版.上海：上海科技出版社,2013：713-967.

[5] Sharma J,Gairola S，Sharma YP，et al.Ethnomedicinal plants used to treat skin diseases by Tharu community of district Udham Singh Nagar,Uttarakhand,India[J].J Ethnopharmacol,2014,158：140-206.

[6] Yang F,Ding S，Liu W，et al.Antifungal activity of 40 TCMs used individually and in combination for treatment of superficial fungal infections[J].J Ethnopharmacol,2015,163：88-93.

[7] Masevhe NA，McGaw LJ，Eloff JN.The traditional use of plants to manage candidiasis and related infections in Venda,South Africa[J].J Ethnopharmacol,2015,168:364-72.

[8] 張璐璐，苗琦，葉招澆，等.不同制法納米銀的抗真菌活性研究[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志,2015,33(4)：328-330.

[9] 韓冰，林輝，陳佳，等.覆盆子抗耐藥真菌活性成分提取方法比較及活性部位初步篩選[J].中國(guó)真菌學(xué)雜志,2012,7(6)：326-329.

[10] Clinical and Laboratory Standards Institute/National Committee for Clinical Laboratory Standards:Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of Yeast[S].Approved Standard,edn 3;Document M27-A3.Wayne,PA:Clinical and Laboratory Standards Institute;2009.

[11] Clinical and Laboratory Standards Institute/National Committee for Clinical Laboratory Standards:Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of Yeast[S].Approved Standard,edn 3;Document M38-A2.Wayne,PA:Clinical and Laboratory Standards Institute;2008.

[12] 胡小平，萬(wàn)喆，李若瑜.應(yīng)用CLSI M38-A2方案測(cè)定須癬毛癬菌對(duì)抗真菌藥物敏感性[J].中國(guó)真菌學(xué)雜志,2011,6(3):149-153.

[13] Liu Q,Luyten W,Pellens K，et al.Antifungal activity in plants from Chinese traditional and folk medicine[J].J Ethnopharmacol,2012,143(3):772-778.

[14] 宮毓靜，安汝國(guó)，虞慧，等.164種中藥乙醇提取物抗真菌作用研究[J].中草藥,2002,33(1)：42-47.

[15] 唐金鳳，李莉，左國(guó)營(yíng).51種常見(jiàn)中草藥抗菌活性篩選[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2016,27 (4)：788-791.

[本文編輯] 施 慧

《中國(guó)真菌學(xué)雜志》醫(yī)學(xué)名詞著錄規(guī)范

以1989年及其以后由全國(guó)自然科學(xué)名詞審定委員會(huì)審定、公布，科學(xué)出版社出版的《醫(yī)學(xué)名詞》和相關(guān)學(xué)科的名詞為準(zhǔn)，暫未公布者仍以人民衛(wèi)生出版社編輯的《英漢醫(yī)學(xué)詞匯》為準(zhǔn)。中文藥物名稱應(yīng)使用1995年版藥典 (法定藥物)或衛(wèi)生部藥典委員會(huì)編輯的《藥名詞匯》(非法定藥物)中的名稱，英文藥物名稱則采用國(guó)際非專利藥名，不用商品名。

Re-evaluation of the traditional Chinese medicines (TCMs) with antifungal activities recorded in ‘Zhong Yao Da Ci Dian’

WU Jing,WANG Liang,CAO Yong-bing,YAN Lan,JIANG Yuan-ying
(CenterforNewDrugResearch,CollegeofPharmacy,TheSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

Objective To investigate the antifungal activity of 127 types of the traditional Chinese medicines (TCMs) with the so-called antifungal activities recorded in ‘Zhong Yao Da Ci Dian’ againstCandidaalbicans,CryptococcusneoformansandAspergillusfumigatusinvitro.Methods The portion from each TCM by 75% alcohol extracts were determined for antifungal activity againstC.albicans,C.neoformansandA.fumigatusby using the standard CLSI M27-A3 and M38-A2 broth microdilution assays,and further to study the antifungal spectrum and inhibition of hyphae.Results The ethanol extracts from 17 TCMs exhibited the inhibitory activity againstC.albicanswith MICs ranged from 15.625 to 2 000 μg/mL.34 kinds of ethanol extracts from TCMs had the inhibitory effect againstC.neoformans.5 ethanol extracts from TCMs had the inhibitory activity of inhibitingA.fumigatus.Conclusion The antifungal activities of TCMs which has been recorded in ‘Zhong Yao Da Ci Dian’ are measuredinvitroby the consistent standard method for the first time,providing the experimental basis for investigation of new antifungal agents.

‘Zhong Yao Da Ci Dian’；antifungal agents；minimal inhibitory concentration；Candidaalbicans；Cryptococcusneoformans；Aspergillusfumigatus

國(guó)家自然基金 (81273556)

吳晶，女 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:wjinghb69@163.com

姜遠(yuǎn)英,E-mail:13761571578@163.com

R 978.5

A

1673-3827(2016)11-0348-06

2016-09-22