鄧娟 孫偉 蘇建榮

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院臨床檢驗中心，北京 100050)

·論著·

銅綠假單胞菌脂多糖對白念珠菌生物膜形成的影響

鄧娟 孫偉 蘇建榮

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院臨床檢驗中心，北京 100050)

目的 研究銅綠假單胞菌脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)對白念珠菌生物膜形成不同時期的影響。方法 甲基四氮鹽 (XTT)減低法用于檢測銅綠假單胞菌LPS對白念珠菌生物膜形成不同階段生成量的影響，利用倒置顯微鏡觀察生物膜形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果 銅綠假單胞菌對白念珠菌生物膜形成的影響具有階段差異性和濃度差異性。結(jié)論 銅綠假單胞菌LPS抑制白念珠菌生物膜菌絲的形成。

銅綠假單胞菌；脂多糖；白念珠菌；生物膜

[Chin J Mycol，2016，11(6):337-340]

念珠菌與革蘭陰性桿菌敗血癥是危重患者重要致死原因之一。近年來，由于各種體內(nèi)植入物 (如心臟支架、口腔種植材料、導(dǎo)尿管等)、抗生素的濫用、HIV感染及應(yīng)用免疫抑制劑等因素，白念珠菌血癥感染率逐年升高[1]。白念珠菌能夠黏附在導(dǎo)尿管、心臟支架、靜脈插管、人工關(guān)節(jié)等人體植入物上形成生物膜[2]，從而對機體造成損害及對抗真菌藥物產(chǎn)生明顯耐藥性[3]。因此，減少或阻斷生物膜的形成可以有效提高抗真菌治療效果，提高患者生存率。

銅綠假單胞菌是人體常見的機會致病菌，也是醫(yī)院獲得性血流感染的常見致病菌，而脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)是銅綠假單胞菌的主要致病成分之一，是革蘭陰性桿菌細(xì)胞壁的特有結(jié)構(gòu)，又名內(nèi)毒素，其可通過促炎反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)機制引起發(fā)熱、糖代謝紊亂、內(nèi)毒素休克等[4]。脂多糖促炎性在膿毒癥休克致病機制中起著重要作用[5]。盡管脂多糖對白念珠菌生物膜形成的體外實驗數(shù)據(jù)較少，但許多體內(nèi)研究表明脂多糖對白念珠菌感染的影響[6-7]。

本研究通過構(gòu)建體外白念珠菌生物膜模型，采用甲基四氮鹽 (XTT)法檢測不同濃度銅綠假單胞菌脂多糖對白念珠菌生物膜形成的影響，期望能為臨床治療混合性感染提供一定幫助，也期望能為研發(fā)新型抗真菌藥物提供一定的實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株 白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 90028 1株 (受贈于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院臨床檢驗中心微生物室)，白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株SC5314 1株，臨床血培養(yǎng)陽性標(biāo)本分離的32株白念珠菌，均來自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院臨床檢驗中心細(xì)菌室，使用前脫脂牛奶-70℃保存。

培養(yǎng)基 沙氏培養(yǎng)基 (SDA)購自O(shè)xiod公司；RPMI-1640培養(yǎng)液購自Gibco公司；酵母氮源培養(yǎng)基 (Yeast nitrogen medium，YNB)購自Difco公司，稱取YNB 3.35 g、葡萄糖10 g，加蒸餾水定容至500 mL，0.45 μm微孔濾器過濾除菌，4℃保存。

主要試劑 銅綠假單胞菌LPS、甲基四氮鹽 (XTT)、甲萘醌均購自Sigma公司：LPS用RPMI-1640溶液調(diào)整成100 μg/mL～0.001 μg/mL濃度；XTT用無菌PBS緩沖液 (購自Solarbio公司)稀釋配成0.5 mg/mL飽和溶液，0.22 μm微孔濾器過濾除菌，分裝后-20℃冰箱凍存；甲萘醌用丙酮 (北京化學(xué)試劑廠，分析純)新鮮配制成濃度為10 mmol/L溶液。

儀器 恒溫?fù)u床，酶標(biāo)儀，細(xì)胞計數(shù)板，倒置顯微鏡 (Olympus，日本)。

1.2 方法

念珠菌生物膜的制備 將從-70℃冰箱保藏的待測菌株接種于SDA培養(yǎng)基上，37℃、5%CO2培養(yǎng)18 h。取一接種環(huán)菌量至YNB培養(yǎng)液中，37℃搖床 (75 r/min)培養(yǎng)過夜，離心，棄上清，PBS液離心洗滌2次 (4 000 r/min，5 min)。用含或不含有不同濃度LPS (100 μg/mL～0.001 μg/mL)RPMI-1640液體培養(yǎng)基稀釋菌液，顯微鏡下用細(xì)胞計數(shù)板將菌液濃度調(diào)整至5×106cells/mL。取100 μL上述菌液接種至無菌96孔板中，37℃搖床 (75 r/min)培養(yǎng)90 min，然后用PBS輕輕洗滌2次，以洗掉未黏附的念珠菌細(xì)胞，再加入含或不含不同濃度LPS (100 μg/mL～0.001 μg/mL)RPMI-1640液體培養(yǎng)基200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h，每隔24 h換液1次。陰性對照孔為不含LPS的RPMI-1640培養(yǎng)基。實驗在不同時間重復(fù)3遍。

XTT減低法進(jìn)行生物膜定量分析 在90 min、24 h、48 h時刻點，棄去96孔板中培養(yǎng)液，每孔用200 μL PBS緩沖液洗2遍，然后每孔加入40 μL XTT、2 μL甲萘醌、158 μL PBS緩沖液，37℃避光孵育3 h后，用酶標(biāo)儀測定念珠菌生物膜在490 nm處的吸光度值 (A值)。

倒置相差顯微鏡觀察生物膜形態(tài) 按上述方法進(jìn)行念珠菌生物被膜的制備，24 h后于倒置顯微鏡下觀察念珠菌生物膜形態(tài)并拍攝照片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)用均值±SD表示，白念珠菌生物膜量實驗組與對照組的比較用Student'st檢驗，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度銅綠假單胞菌LPS對念珠菌生物膜形成的影響

本實驗選取了一系列不同濃度的銅綠假單胞菌脂多糖，研究顯示：與對照組相比，實驗組在黏附階段 (90 min)，銅綠假單胞菌脂多糖對白念珠菌生物膜生成量具有菌株差異性和脂多糖濃度差異性；在生物膜形成階段 (24 h)和生物膜成熟階段 (48 h),銅綠假單胞菌脂多糖100 μg/mL濃度對白念珠菌生物膜形成抑制率最高，分別為94.1% (32/34)和82.4% (28/34)(見表1)。

表1 不同濃度銅綠假單胞菌LPS影響白念珠菌生物膜形成的菌株數(shù)

Tab.1 The effect of different concentrations ofPseudomonasaeruginosaLPS influenceCandidaalbicansbiofilms formation (strains)

階段影響銅綠假單胞菌LPS(μg/mL)1001010.10.010.00190min+463535-181612787/12121922232224h+000000-3230211864/241316283048h+000000-2822181220/61216223234

注："+"表示刺激；"-"表示抑制；"/"表示無影響

2.2 銅綠假單胞菌脂多糖對白念珠菌生物膜形態(tài)的影響

用包含不同濃度銅綠假單胞菌脂多糖的RPMI-1640溶液培養(yǎng)24 h后，通過倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，白念珠菌對照組形成的生物膜中含有大量呈交織狀態(tài)的菌絲，而實驗抑制組生物膜多數(shù)為酵母相，偶見少量菌絲形成 (見圖1)。

圖1 銅綠假單胞菌脂多糖對白念珠菌ATCC 90028菌株生物膜形成的影響：a.對照組 (×40倍),b.脂多糖100 μg/mL (×40倍)

Fig.1 Effect of 100 μg/mLPseudomonasaeruginosalipopolysaccharide onC.albicansATCC 90028 hyphal growth.C.albicansATCC 90028 cells were grown in RPMI-1640 medium at the 100 μg/mL concentration ofPseudomonasaeruginosaLPS at 37℃ for 24h.At the end of incubation an aliquot was withdrawn from each sample and photographed at 40×magnification

3 討 論

白念珠菌是一種二相型真菌，可在孢子相和菌絲相間進(jìn)行形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)換。它在自然界中以浮游狀態(tài)或者生物膜狀態(tài)生長，不同的生長狀態(tài)呈現(xiàn)出不同的生物學(xué)特性。臨床上，大部分白念珠菌感染以生物膜形態(tài)發(fā)生。成熟的白念珠菌生物膜是一個由孢子、假菌絲及菌絲形成的致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可使得白念珠菌致病性增強[8]，導(dǎo)致生物膜狀態(tài)白念珠菌血癥成為臨床治療的難點。

1994年，Kerr[9]首次描述了銅綠假單胞菌的體內(nèi)抗真菌活性。他隨訪了3位術(shù)后肺部感染患者，發(fā)現(xiàn)當(dāng)患者感染銅綠假單胞菌時，痰培養(yǎng)中并未分離出白念珠菌；但當(dāng)用有效抗生素治療銅綠假單胞菌感染后，患者痰中可分離培養(yǎng)出白念珠菌，由此認(rèn)為銅綠假單胞菌對白念珠菌的生長抑制作用。Gupta等[10]對300位燒傷患者進(jìn)行了長達(dá)2 a時間的隨訪，通過從燒傷創(chuàng)面上收集的不同種類的細(xì)菌對白念珠生長的影響確定體內(nèi)細(xì)菌的存在是否影響念珠菌的生長，結(jié)果觀察到銅綠假單胞菌對念珠菌的抑制作用。Azoulay等[11]報道了機械通氣患者白念珠菌的定植與銅綠假單胞菌肺炎發(fā)生的正相關(guān)性。Sabra等[12]闡述了2種不同化學(xué)類型的銅綠假單胞菌脂多糖在一定生存條件下，脂多糖表型的改變可能在細(xì)菌黏附和存活過程中起著重要作用。Bandara等[13]報道了通過共聚焦熒光顯微鏡和掃描電鏡觀察到銅綠假單胞菌脂多糖抑制白念珠菌菌絲的形成從而影響白念珠菌生物膜的形成。

念珠菌生物膜的形成階段，可人為地劃分為3個階段：黏附階段 (1～2 h)、生物膜形成階段 (12～24 h)和生物膜成熟階段 (30～72 h)[14]。本實驗結(jié)果顯示，銅綠假單胞菌脂多糖對白念珠菌生物膜的形成具有抑制作用，并具有濃度依賴性。倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)改變，可發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌脂多糖抑制白念珠菌菌絲形成。本實驗結(jié)果，與Bandara等[13]所報道有所差異，可能與實驗對照組設(shè)置及試驗方法不同有關(guān)。本研究不足之處在于尚未驗證不同濃度銅綠假單胞菌脂多糖對白念珠菌的毒性作用。

Bandara等[13]的發(fā)現(xiàn)及本實驗結(jié)果提示銅綠假單胞菌脂多糖具有一定的抗真菌效果。銅綠假單胞菌脂多糖對白念珠菌菌絲及生物膜影響的分子機制，值得進(jìn)一步研究，從而揭示去毒性的銅綠假單胞菌脂多糖是否可以成為抗真菌藥物。

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[本文編輯] 衛(wèi)鳳蓮

·消息·

Effect ofPseudomonasaeruginosalipopolysaccharide on biofilm formation ofCandidaalbicans

DENG Juan，SUN Wei，SU Jian-rong

(ClinicalLaboratoryCenter，BeijingFriendshipHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050)

Objective To explore the effect ofPseudomonasaeruginosalipopolysaccharide onCandidaalbicansbiofilm formation.Methods XTT reduction assay was used to elucidate the effect ofPseudomonasaeruginosalipopolysaccharide on biofilm formation ofCandidaalbicans.Result These date are indicative thatPseudomonasaeruginosalipopolysaccharide modulateCandidabiofilm formation in a time-dependent and concentration-dependent manner.ConclusionPseudomonasaeruginosalipopolysaccharide could modulateCandidaalbicansbiofilm formation by inhibit the hyphal development.

Pseudomonasaeruginosa；lipopolysaccharide；Candidaalbicans；biofilm

鄧娟，女 (漢族)，碩士，住院醫(yī)師.E-mail:dsy6241999@163.com

蘇建榮,E-mail:yysujianrong@163.com

R 379.4

A

1673-3827(2016)11-0337-04

2016-09-18