任　靜綜述，蔣孝華審校（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南衡陽(yáng)421000）

Plk1和Cdk1在細(xì)胞周期和腫瘤中的研究進(jìn)展

任靜綜述，蔣孝華審校
（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南衡陽(yáng)421000）

蛋白激酶類(lèi)；細(xì)胞周期蛋白質(zhì)類(lèi)；細(xì)胞周期，腫瘤；綜述

保羅樣激酶（polo-like kinase，Plk）1和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（cyclin dependent kinase，Cdk）1均屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族中的成員，在細(xì)胞周期進(jìn)程中，尤其是在G2/M期中具有重要調(diào)控作用。Plk1和Cdk1在增殖活躍細(xì)胞中呈高表達(dá)，Plk1和Cdk1高表達(dá)均與腫瘤患者預(yù)后差密切相關(guān)。

細(xì)胞周期是一個(gè)細(xì)胞復(fù)制其基因組、生長(zhǎng)和分裂的有序事件，受多個(gè)蛋白調(diào)節(jié)包括細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期蛋白激酶和細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑，是生命生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖的基礎(chǔ)。細(xì)胞周期包括G1、S、G2、M期。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展通過(guò)調(diào)控某些細(xì)胞周期因子，使細(xì)胞周期紊亂。Plk1和Cdk1作為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子在G2期向M期轉(zhuǎn)換過(guò)程中具有重要作用。通過(guò)了解Plk1和Cdk1在腫瘤細(xì)胞周期中的作用有望成為腫瘤標(biāo)志物和腫瘤治療靶點(diǎn)。本文就近年來(lái)Plk1和Cdk1的生物特性和與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的研究作一綜述。

1　Plk1

1.1Plk1的分子結(jié)構(gòu)及功能Plk是一類(lèi)表達(dá)于真核生物中高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。保羅樣基因最早在1988年發(fā)現(xiàn)于黑腹果蠅的基因組中。在有絲分裂中該基因功能突變可導(dǎo)致異常紡錘體兩極形成及染色體分離等。2010后Strebhardt［1］在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了保羅的同源基因，即Plk1、Plk2、Plk3、Plk4、Plk5。其在細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)期中具有重要作用，目前，關(guān)于Plk1的研究最早、最深入、最為透徹。所有的Plk具有相類(lèi)似的分子結(jié)構(gòu)，其中Plk1 N-端包含1個(gè)高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域，激酶活性受其調(diào)節(jié)，C-端包含3個(gè)保羅盒結(jié)構(gòu)域（polo-box domain，PB）D、PB1、PB2，同時(shí)作為自動(dòng)抑制結(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位域，Plk1的PBD晶體結(jié)構(gòu)表明PB1、PB2含有一段結(jié)構(gòu)完全相同的β6α折疊［2］。通過(guò)磷酸化不同底物，Plk1在細(xì)胞周期進(jìn)程中具有重要作用包括中心體成熟、有絲分裂的啟動(dòng)、染色體分離和包漿分離等［3］。

1.2Plk1與細(xì)胞周期的關(guān)系Plk1作為細(xì)胞周期調(diào)控中一個(gè)很關(guān)鍵的基因，受磷酸化［4］和蛋白降解［5］的調(diào)控。Plk1最顯著的特征是隨著細(xì)胞周期過(guò)程變化定位于不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，主要定位于中心體。此外，在G2期和有絲分裂期富集于著絲粒上，在有絲分裂后期隨著染色體分離，Plk1易位于紡錘體中央?yún)^(qū)。Plk1能有效預(yù)磷酸化底物結(jié)合位點(diǎn)和有序的在這些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)位點(diǎn)上遷移，與PBD有關(guān)。

1.2.1Plk1促進(jìn)中心體成熟前期γ-tubulin復(fù)合物募集于中心體上，稱(chēng)為中心體成熟，該過(guò)程對(duì)有絲分裂微管至核至關(guān)重要。Plk1通過(guò)磷酸化中心蛋白Nip，從而使γ-tubulin募集于中心體上，促進(jìn)中心體成熟。除Nip外，近來(lái)還發(fā)現(xiàn)另一個(gè)Plk1作用底物——Kizuna，也被證明是中心體形成所需物質(zhì)，尤其是對(duì)其結(jié)構(gòu)維持具有重要作用。Oshimori等［6］研究發(fā)現(xiàn)，去除Kizuna或抑制Plk1對(duì)其磷酸化會(huì)導(dǎo)致中心體失去穩(wěn)定性，最終使紡錘體微管產(chǎn)生的力分散而導(dǎo)致紡錘體多極化。

1.2.2Plk1促進(jìn)細(xì)胞周期由G2期進(jìn)入M期Plk1通過(guò)激活細(xì)胞因子B-Cdk1復(fù)合物啟動(dòng)有絲分裂，即由G2期進(jìn)入M期。在G2期，由于Cdk1的腺苷三磷酸結(jié)合域上的殘基處于磷酸化狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞因子B-Cdk1復(fù)合物處于失活狀態(tài)。目前發(fā)現(xiàn)，至少有2種激酶發(fā)揮這種磷酸化作用，Weel激酶和Myt1激酶分別磷酸化蘇氨酸殘基（threomine，Thr）14和Tyr15，這樣可避免在DNA復(fù)制完成前提前進(jìn)入有絲分裂期，破壞基因組完整性。Cdc25C能去磷酸化Thr14和Tyr15，從而激活細(xì)胞因子B-Cdk1復(fù)合物啟動(dòng)有絲分裂。抑制激酶Weel/Myt1和磷酸化Cdc25C之間的平衡對(duì)細(xì)胞因子B-Cdk1復(fù)合物的激活至關(guān)重要，從而影響有絲分裂的啟動(dòng)。Plk1能磷酸化并激活Cdc25C。Qian等［7］對(duì)非洲蟾蜍進(jìn)行的研究證明，敲除Plk1基因后能延遲G2/M期的進(jìn)展。表明Plk1 的PBD與Cdc25C特異性結(jié)合，磷酸化后的Cdc25C激活細(xì)胞因子B-Cdk1復(fù)合物從而啟動(dòng)有絲分裂。

1.2.3Plk1促進(jìn)染色體分離有絲分裂染色體分離是由著絲粒與紡錘體微管之間動(dòng)態(tài)作用共同介導(dǎo)的，在這一過(guò)程中有絲分裂著絲粒相關(guān)驅(qū)動(dòng)蛋白（the mitotic centromere-associated kinesin，MCAK）具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。在有絲分裂中MCAK的活性及定位受相關(guān)有絲分裂激酶調(diào)控包括Plk1和Aurora B。Sanhaji等［8］研究證明，MCAK的C-末端結(jié)構(gòu)域S621結(jié)構(gòu)位點(diǎn)是Plk1的主要磷酸化位點(diǎn)，Plk1通過(guò)磷酸化S621能促進(jìn)MCAK的降解，從而促進(jìn)染色體分離。

1.2.4Plk1促進(jìn)有絲分裂退出Plk1除在促進(jìn)中心體成熟、紡錘體形成和激活細(xì)胞因子B-Cdk1復(fù)合物觸發(fā)有絲分裂等方面具有重要作用外，還可通過(guò)激活A(yù)PC/C退出有絲分裂。APC/C通過(guò)泛素化特異性細(xì)胞周期調(diào)控蛋白和靶向這些蛋白的蛋白水解泛素-蛋白酶系統(tǒng)調(diào)控細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換［9］。對(duì)APC/C的適當(dāng)調(diào)節(jié)在整個(gè)細(xì)胞周期中具有重要作用，在特定的細(xì)胞周期進(jìn)程中有著特定的調(diào)節(jié)因子抑制APC/C活性，其中早期有絲分裂抑制劑1（early mitotic inhibitor 1，Emi1）作用最為突出。細(xì)胞因子B-Cdk1復(fù)合物在（S/P）P共識(shí)點(diǎn)磷酸化Emi1，然后再次被Plk1磷酸化，Plk1磷酸后的Emi1被泛素連接酶復(fù)合體SCFβ-TrCP識(shí)別并結(jié)合，促進(jìn)Emi1降解，從而激活A(yù)PC/C［10］，最終促進(jìn)有絲分裂退出。

1.3Plk1與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系Plk1與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，因此，不難想象，Plk1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。大量研究表明，Plk1在非小細(xì)胞肺癌、頭頸部癌、食管癌、胃癌、惡性黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、大腸癌、膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌等腫瘤中高表達(dá)［11］，并常與預(yù)后不良有關(guān)。因此，Plk1有望成為治療癌癥的新靶點(diǎn)。確實(shí)，許多Plk1抑制劑已被開(kāi)發(fā)并作為癌癥治療藥物，如BI2536、BI6727（Volasertib）、GSK461364A、HMN-214、ON01910.Na、NMS-P937和TKM-080301［12］。Choi等［13］研究證明，用Plk1抑制劑——BI2536處理非小細(xì)胞肺癌后G2/M期比例較對(duì)照組明顯升高，提示細(xì)胞有絲分裂期受到阻滯，從而使細(xì)胞增值率下降。Russo等［14］研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺未分化癌和低分化甲狀腺癌細(xì)胞經(jīng)Plk1抑制劑——GSK461364A孵育后細(xì)胞增殖受到抑制，且可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，采用流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，G2/M期阻滯，該研究也發(fā)現(xiàn)，GSK461364A在體內(nèi)同樣發(fā)揮作用，在成功構(gòu)建的ATC129SV小鼠雌性野生型模型中隔天給予GSK461364A處理后結(jié)果表明，處理組腫瘤體積較對(duì)照組明顯縮小，表明Plk1基因靶向有望成為治療腫瘤的有效方法。Zhang等［15］通過(guò)對(duì)比原發(fā)性腎細(xì)胞癌與正常腎組織中Plk1的表達(dá)量，采用免疫印跡和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)等檢測(cè)均顯示Plk1表達(dá)量在癌組織中明顯高于正常組織，表明Plk1與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。Yeap等［16］用一種合成蒽醌衍生物——DHAQC（2）處理MCF-7細(xì)胞48 h后采用流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)處理后的細(xì)胞提示G2/M期阻滯，蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，DHAQC （2）處理后的MCF-7細(xì)胞Plk1表達(dá)降低，p53、Bax、細(xì)胞色素C表達(dá)增加，表明DHAQC（2）可通過(guò)下調(diào)Plk1，上調(diào)p53、Bax/Bcl-2比值、細(xì)胞色素C后誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞G2/M期阻滯及內(nèi)源性凋亡。此外，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)了一種新的非編碼微小RNA（microRNA，miR）在生物過(guò)程中具有重要作用包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和凋亡，其中有研究發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌、肝癌和人上皮卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）中miR-100可能通過(guò)作用于Plk1靶基因而具有抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用［17-18］。

2　Cdk1

2.1Cdk1的結(jié)構(gòu)及功能Cdk屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族另一成員，首次在調(diào)節(jié)真核細(xì)胞周期進(jìn)程中被發(fā)現(xiàn)。其中Cdk1是Cdk的創(chuàng)始成員，最先從非洲爪蟾未受精卵的成熟促進(jìn)因子中純化出來(lái)。Cdk1又名為Cdc2、Cdc28A，編碼的蛋白是1個(gè)高度保守的蛋白激酶復(fù)合物的催化亞基，與細(xì)胞因子B結(jié)合后被稱(chēng)為M期促進(jìn)因子。Cdk1在細(xì)胞周期調(diào)控，尤其是有絲分裂過(guò)程中是重要的一員，Neganova等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在人類(lèi)多能干細(xì)胞的多個(gè)事件中Cdk1具有調(diào)控有絲分裂、G2/M期檢查點(diǎn)執(zhí)行維護(hù)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞多能性和基因組穩(wěn)定性維護(hù)等作用。

2.2Cdk1與細(xì)胞周期Cdk1與調(diào)節(jié)亞基細(xì)胞因子B1結(jié)合形成復(fù)合物后能促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂。在有絲分裂前的細(xì)胞間期，細(xì)胞因子B1-Cdk1復(fù)合物由于Cdk1的Thr14和Tyr15位點(diǎn)磷酸化而處于失活狀態(tài)，這是由蛋白激酶Wee1和Myt1催化所致［20］。在有絲分裂和G2/M期轉(zhuǎn)換過(guò)程中Tyr15去磷酸化是Cdk1激活的一個(gè)重要限速步驟，而Thr14和Tyr15的去磷酸化由雙特異性蛋白激酶——Cdc25C催化［20］。Wee1通過(guò)抑制Cdk1磷酸化延遲有絲分裂，而Cdc25C通過(guò)去磷酸化促進(jìn)有絲分裂［21］。在黑穗病真菌玉米黑粉菌中發(fā)現(xiàn)，Wee1過(guò)表達(dá)和Cdc25C活性抑制使Cdk1 Tyr15磷酸化水平升高，導(dǎo)致G2期阻滯［22］。Liu等［23］研究發(fā)現(xiàn)，MJ-66誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，通過(guò)中斷與周期細(xì)胞因子B1-Cdk1復(fù)合體活性所介導(dǎo)。Liu等［24］用不同濃度NOAD（一種新型的一氧化氮供體）處理人肝癌細(xì)胞Bel-7402發(fā)現(xiàn)，NOAD能誘導(dǎo)G2/M期阻滯，細(xì)胞周期調(diào)控蛋白分析表明，NOAD通過(guò)降低Cdk1和Cdc25C蛋白表達(dá)而抑制Bel-7402細(xì)胞增殖。由此可知，催化亞基Cdk1通過(guò)調(diào)節(jié)G2/M期在整個(gè)細(xì)胞周期進(jìn)程中具有重要作用。

2.3Cdk1與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系Cdks在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程和RNA轉(zhuǎn)錄中具有至關(guān)重要的作用，各種遺傳及表觀(guān)遺傳事件均顯示，在許多腫瘤中細(xì)胞周期激酶表達(dá)活躍，且相應(yīng)抑制劑的應(yīng)用可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡［25］。目前，細(xì)胞周期調(diào)控因子作為潛在的預(yù)后和治療的腫瘤標(biāo)志物已吸引了許多學(xué)者的關(guān)注。其中Cdk1在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌及乳腺癌中已被確定為一個(gè)有用的臨床預(yù)后標(biāo)志物［26］。Xi等［27］收集了119例包括主要臨床表現(xiàn)和幾種病理分級(jí)的EOC組織，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Cdk1和Ki-67在低分化卵巢癌組織中有較強(qiáng)的表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，Cdk1和Ki-67主要在細(xì)胞核中表達(dá)，Kaplan-Meier分析表明，高表達(dá)Cdk1與預(yù)后差密切相關(guān)，證實(shí)了較強(qiáng)Cdk1表達(dá)能降低EOC患者生存率，可能與其能促進(jìn)細(xì)胞周期G2/M期有關(guān)。Feng等［28］用最佳濃度HDAC抑制劑——TSA和水飛薊賓聯(lián)合處理2種不同株系的胰腺癌細(xì)胞Panc1和Capan2發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合處理細(xì)胞后通過(guò)下調(diào)survivin和激活胱門(mén)蛋白酶促進(jìn)細(xì)胞凋亡，下調(diào)細(xì)胞因子B1-Cdk1復(fù)合物和細(xì)胞因子A2誘導(dǎo)G2/M期阻滯，表明HDAC抑制劑和水飛薊賓聯(lián)合治療可能是一種新的有效的治療胰腺癌的方法。Zhang等［29］發(fā)現(xiàn)，BA-j作為一種新型廣譜抗癌活性Cdk1抑制劑，其抗癌分子生化機(jī)制可能是直接抑制Cdk1和捕獲氧離子，然后選擇性增加癌細(xì)胞中的過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2），高水平H2O2通過(guò)氧化Cdc2而滅活Cdk1，最終抑制細(xì)胞增殖。Liu等［23］采用免疫熒光分析結(jié)果顯示，MJ-66誘導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251、T98G、U373呈多核表型和多極紡錘體，流式細(xì)胞儀分析表明，MJ-66誘導(dǎo)細(xì)胞后細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，可能與MJ-66中斷細(xì)胞因子B-Cdk1復(fù)合物活性介導(dǎo)有關(guān)，在U87細(xì)胞移植瘤動(dòng)物模型中用MJ-66 （1.36 μg/kg生理鹽水）或生理鹽水注射到腫瘤部位每2天1次，共10次，治療停止觀(guān)察腫瘤生長(zhǎng)情況共20 d，結(jié)果顯示，MJ-66能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，通過(guò)中斷細(xì)胞因子B-Cdk1復(fù)合物活性與在異種移植動(dòng)物模型的腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用使MJ-66成為治療惡性腫瘤很有前途的新靶點(diǎn)。

3　小　結(jié)

Plk1和Cdk1與腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)，2個(gè)基因的相互作用共同調(diào)節(jié)細(xì)胞由G2期向M期轉(zhuǎn)換。失調(diào)的Plk1和Cdk1基因?qū)е轮行捏w異常分離，致染色體不穩(wěn)定和細(xì)胞非整倍體的形成，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。大量研究證明，Plk1和Cdk1在多種腫瘤中過(guò)表達(dá)，如乳腺癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食管癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、口咽癌等。有研究證明，通過(guò)使用體內(nèi)的小干擾RNA傳送系統(tǒng)和新的小分子抑制劑靶向Plk1和Cdk1基因能使腫瘤生長(zhǎng)顯著減少［30］。

總之，Plk1和Cdk1將成為治療癌癥的一個(gè)很有吸引力的方法，成為判斷腫瘤預(yù)后的標(biāo)志物。然而，尚需進(jìn)一步在臨床中評(píng)估Plk1和Cdk1抑制劑的效果。

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1009-5519（2016）06-0872-04

（2015-11-12）