沈飚吳剛胡興娟王忠發(fā)滕躍

（舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局浙江舟山316000）

TaqMan熒光定量RT-PCR快速檢測(cè)腹地病毒方法的建立

沈飚吳剛胡興娟王忠發(fā)*滕躍

（舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局浙江舟山316000）

為建立特異、快速、靈敏的TaqMan熒光定量RT-PCR方法用于腹地病毒核酸檢測(cè)，利用腹地病毒核衣殼蛋白編碼基因的特異性序列設(shè)計(jì)引物和探針，建立熒光定量RT-PCR快速檢測(cè)體系。對(duì)含有目的基因的質(zhì)粒、80份發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒陽性血清樣本以及80份流行性出血熱病毒陽性鼠肺樣本進(jìn)行核酸檢測(cè)，驗(yàn)證方法的靈敏度、特異度和重復(fù)性。結(jié)果顯示，該方法所檢測(cè)的80份發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒核酸陽性血清與80份流行性出血熱病毒陽性鼠肺樣本均為陰性，對(duì)目的基因的檢測(cè)靈敏度達(dá)50拷貝/反應(yīng)；重復(fù)性測(cè)試中的變異系數(shù)為0.09%-0.87%，從樣本核酸提取至檢測(cè)完成的全過程僅需2 h。證明建立的腹地病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法具有快速、特異、靈敏及重復(fù)性好的特點(diǎn)，有助于進(jìn)口貨物中昆蟲、嚙齒類動(dòng)物、外輪上工作的疑似病人檢疫以及對(duì)腹地病毒流行病學(xué)監(jiān)測(cè)工作的開展。

腹地病毒；發(fā)熱伴血小板減少綜合征；實(shí)時(shí)熒光RT-PCR

1 前言

發(fā)熱伴血小板減少綜合征（Fever with Thrombocytopenia Syndromes，SFTS）是由兩種布尼亞病毒即發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（Fever with Thrombocytopenia Syndromes Virus，SFTSV）和腹地病毒（Heartland Virus，HRTV）引起的一種急性蟲媒傳染病[1-3]。該病潛伏期短，死亡率高[4，5]，目前尚無有效疫苗或藥物對(duì)其進(jìn)行預(yù)防和治療，因此SFTSV與HRTV已成為全球公共安全威脅。SFTSV流行于中國(guó)、韓國(guó)、日本等東北亞地區(qū)，HRTV流行于美國(guó)密蘇里、田納西和俄克拉荷馬等美國(guó)中部各州。目前，我國(guó)雖尚無HRTV感染病例的報(bào)道，但存在其流行所需的生態(tài)學(xué)條件，因此面臨HRTV隨時(shí)輸入和流行的威脅。近年來國(guó)內(nèi)對(duì)SFTSV的檢測(cè)研究報(bào)道甚多，但對(duì)HRTV的檢測(cè)研究報(bào)道甚少，且無商品化試劑供應(yīng)，一旦疫情輸入局面將十分被動(dòng)。而SFTSV與HRTV在遺傳進(jìn)化上有高度的親緣性，傳播途徑與臨床癥狀也十分相似；HRTV的基因組與SFTSV相同均分為L(zhǎng)、M、S 3個(gè)節(jié)段，其中以S節(jié)段中的編碼核蛋白基因片段（NP）最為保守，是PCR方法研制中的首選靶基因序列。因此積極開展HRTV分子生物學(xué)快速診斷技術(shù)的研究，可為進(jìn)出口檢疫、疑似病例快速診斷及流行病學(xué)監(jiān)測(cè)工作開展奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

ViiA7型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

2.1.2 試劑

一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR試劑盒（RR064A）：購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，批號(hào)AK6001，有效期2017年7月；HRTV核衣殼蛋白編碼基因（NP）特異性序列重組質(zhì)粒：委托寶生物工程（大連）有限公司構(gòu)建。

2.1.3 病毒株

80份SFTSV核酸陽性血清：由舟山、寧波、杭州各醫(yī)院委托本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，陽性血樣進(jìn)行病毒分離，陽性血清及病毒株由本實(shí)驗(yàn)室保存；80份流行性出血熱病毒（EHFV）陽性鼠肺：由寧波市疾病預(yù)防控制中心饋贈(zèng)。

2.2 方法

2.2.1 引物與探針設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI已公布的HRTV S基因節(jié)段的核酸序列特點(diǎn)，選取核蛋白編碼基因（NP）中保守性較高的核酸為靶序列，從GenBank下載Heartland virus isolate patient 1 segment S.complete sequente（JX00 5842.1），選取1455-1558之間的序列作為靶序列，經(jīng)Blast特異度分析與已公布的HRTV核苷酸序列相似度在98%-100%，而與已知的人DNA序列及其他病毒核苷酸序列無明顯的相似度。依照待檢靶分子序列設(shè)計(jì)一條靠近前引物位置1483-1506區(qū)間片段與負(fù)鏈互補(bǔ)的熒光標(biāo)記探針。引物和探針均委托寶生物工程（大連）有限公司合成，序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)HRTV引物探針序列

2.2.2 重組質(zhì)粒（定量標(biāo)準(zhǔn)品）的構(gòu)建

將HRTV核蛋白基因中特異性片段（全長(zhǎng)104 bp）進(jìn)行寡核苷酸合成，合成片段克隆鏈接到載體pMD19-T上，再導(dǎo)入到工程菌JM109內(nèi)增殖，重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定確認(rèn)準(zhǔn)確無誤。寡核苷酸合成、質(zhì)粒構(gòu)建、鑒定及拷貝數(shù)量測(cè)定均由寶生物工程（大連）有限公司完成。

2.2.3 HRTV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增體系與反應(yīng)條件

總反應(yīng)體系為25 μL，包括2×One Step RT-PCR Buffer 12.5 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.5 μL，EX Taq HS 0.5 μL，ROX ReferenceDyeⅡ0.5 μL，10μmol/L的上、下游引物各0.5μL，5μmol/L的探針0.5 μL，RNase Free 4.5 μL，RNA模版5 μL。反應(yīng)條件為42℃5min；95℃10s，95℃5s，60℃30 s，45個(gè)循環(huán)；60℃HEX或VIC通道采集熒光信號(hào)。

2.2.4 特異度評(píng)估

80份SFTSV陽性血清與80份EHFV陽性鼠肺樣本的RNA以及陰性對(duì)照與陽性對(duì)照進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。

2.2.5 靈敏度評(píng)估

將標(biāo)準(zhǔn)品重組質(zhì)粒從5×1010拷貝/μL為起始濃度作10倍梯度稀釋至5×100拷貝/μL，取5×107拷貝/μL至5×100拷貝/μL的8個(gè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)，以確定該方法能檢出的最低RNA拷貝數(shù)量/反應(yīng)。

2.2.6 重復(fù)性評(píng)估

選取5×101拷貝/μL-5×106拷貝/μL 6個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品重組質(zhì)粒作為模板，每個(gè)濃度模板作3次重復(fù)，計(jì)算每個(gè)濃度Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差（S）與變異系數(shù)（CV）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.2.7 陽性結(jié)果判定方法

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果以Ct值<40且擴(kuò)增曲線呈典型的S型為陽性判定原則。其中，Ct值<35且擴(kuò)增曲線典型可直接判定為陽性；Ct值在35-40之間的需重復(fù)實(shí)驗(yàn)，兩次實(shí)驗(yàn)均能得到典型的擴(kuò)增曲線可判定為陽性；若有需要建議對(duì)這類樣本作巢式PCR檢測(cè)并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序予以確認(rèn)。

3 結(jié)果

3.1 方法的擴(kuò)增體系與反應(yīng)條件

該方法總反應(yīng)體系為25 μL，優(yōu)化后各反應(yīng)物的終濃度為：校正液（ROX）0.5 μL，Taq酶和逆轉(zhuǎn)錄酶各0.5 μL（5 U/μL），模板核酸5 μL，上、下游引物的終濃度0.2 μmol/L，TaqMan探針終濃度0.1 μmol/L，最后用RNase Free水補(bǔ)至25 μL。最佳反應(yīng)條件為42℃5 min；95℃10 s，95℃5 s，60℃30 s，45個(gè)循環(huán)；60℃在HEX或VIC通道采集熒光信號(hào)。在上述條件下不同濃度的HRTV核酸重組質(zhì)粒均能獲得有規(guī)律的典型擴(kuò)增曲線。

3.2 特異度評(píng)價(jià)結(jié)果

80份SFTSV陽性血清與80份EHFV陽性鼠肺樣本，2個(gè)不同濃度的HRTV重組質(zhì)粒（106拷貝/μL與102拷貝/μL）作為HRTV的陽性對(duì)照。用建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法同時(shí)檢測(cè)上述樣本，觀察是否有非特異的擴(kuò)增現(xiàn)象產(chǎn)生。除了2個(gè)濃度HRTV重組質(zhì)粒出現(xiàn)陽性結(jié)果外，其余樣本檢測(cè)結(jié)果均為陰性，檢測(cè)結(jié)果顯示該方法具有良好的特異性，見圖1。

圖1 HRTV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)SFTSV與EHFV的特異度

3.3 靈敏度評(píng)估結(jié)果

將構(gòu)建的質(zhì)粒外標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度，用HRTV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示HRTV重組質(zhì)粒的靈敏度達(dá)到5×101拷貝/反應(yīng)，7個(gè)濃度的擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)典型的S型，見圖2。

圖2 HRTV熒光定量RT-PCR的檢測(cè)靈敏度

以重組質(zhì)粒模板濃度的對(duì)數(shù)值為橫橫坐標(biāo)，循環(huán)數(shù)（Ct值）為縱坐標(biāo)作圖，得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，斜率（slop）=-3.397，y-Inter=44.651，相關(guān)系數(shù)（R2）= 0.999，擴(kuò)增效率（Eff%）=96.964。檢測(cè)得到的熒光曲線與所檢測(cè)的靶基因濃度之間具有良好的相關(guān)性，見圖3。

圖3 HRTV熒光定量RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.4 重復(fù)性評(píng)估

取5×106拷貝/μL至5×101拷貝/μL的6個(gè)濃度外標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算各重復(fù)樣本Ct值之間的變異系數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果顯示從高濃度到低濃度的標(biāo)準(zhǔn)差（S）分布在0.02-0.30，變異系數(shù)分布在0.09%-0.87%，該方法具有較好的重復(fù)性，見表2。

表2 HRTV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的重復(fù)性試驗(yàn)

4 討論

2009年，在美國(guó)密蘇里州西北部的2個(gè)農(nóng)場(chǎng)里發(fā)生了病毒性出血熱，從2個(gè)患者的血樣中分離出1株新型布尼亞病毒，并命名為HRTV[6]。經(jīng)序列分析，該病毒與中國(guó)發(fā)現(xiàn)的SFTSV同屬布尼亞病毒科白蛉病毒屬，病毒形態(tài)與蛋白結(jié)構(gòu)、核酸序列與核酸長(zhǎng)度等方面均極為相似。

當(dāng)前，發(fā)熱伴血小板減少綜合征的發(fā)病機(jī)理尚不明確，但SFTSV與HRTV均具有泛嗜性，對(duì)血液系統(tǒng)、內(nèi)臟、消化道等都有侵犯，主要臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、疲乏、腹瀉、血小板顯著減少、白細(xì)胞減少，嚴(yán)重者出現(xiàn)多臟器衰竭而死亡。蜱蟲是主要傳播媒介，與病人血液接觸也可能是其傳播途徑之一。除人之外，SFTSV與HRTV還可感染牛、羊、豬、鹿、雞等家畜，造成病毒血癥及特異性抗體[7，8]。

隨著日益頻繁的國(guó)際貿(mào)易、人員旅游等增加，豬流感、登革熱、中東SARS及寨卡等病毒流入我國(guó)境內(nèi)并引起不同規(guī)模的流行，HRTV也有可能隨著進(jìn)口農(nóng)產(chǎn)品中的有害昆蟲、易感動(dòng)物以及旅游人群中的病毒攜帶者傳入我國(guó)。目前國(guó)內(nèi)對(duì)HRTV檢測(cè)技術(shù)的相關(guān)報(bào)道唯一可見的是中國(guó)CDC對(duì)HRTV抗體診斷方法的初步研究[9]，因此建立快速準(zhǔn)確的HRTV核酸檢測(cè)方法作為技術(shù)儲(chǔ)備，應(yīng)對(duì)今后可能發(fā)生的疑似病例早期診斷與有效控制疫情傳播具有非常重要的意義。本研究將實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)應(yīng)用于HRTV核酸的快速檢測(cè)，能在2 h內(nèi)（包括RNA提?。┩瓿刹煌瑯颖镜腍RTV核酸的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，具有高特異度、高靈敏度及較好重復(fù)性。雖然目前國(guó)內(nèi)尚無HRTV引起的發(fā)熱伴血小板減少綜合征確診病例，也無臨床陽性血清樣本進(jìn)行校驗(yàn)，但根據(jù)既往經(jīng)驗(yàn)，本研究仍可為完善發(fā)熱伴血小板減少綜合征的檢測(cè)方法和建立診斷標(biāo)準(zhǔn)提供參考，也可為今后HRTV臨床感染的早期診斷和環(huán)境中昆蟲攜帶狀況的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支持。

5 結(jié)論

建立的腹地病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法具有快速、特異、靈敏及重復(fù)性好的特點(diǎn)，有助于進(jìn)口貨物中昆蟲、嚙齒類動(dòng)物、外輪上工作的疑似病人檢疫以及對(duì)腹地病毒流行病學(xué)監(jiān)測(cè)工作的開展。

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TaqMan-Based Real-Time RT-PCR Assay for Quick Detection of Heartland Virus

SHEN Biao，WU Gang，HU Xingjuan，WANG Zhongfa*，TENG Yue
（Zhoushan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhoushan，Zhejiang，316000）

To establish a specific，rapid and sensitive TaqMan RT-PCR for the detection of Heartland Virus，according to nucleocapsid protein coding genes（NP）specific sequence in Heartland Virus，primers and probe were designed for real-time RT-PCR assay.Sensitivity，specificity and repeatability were tested bydetectingplasmidcontainingthetargetgene，80positiveserumsamplesofFeverwith Thrombocytopenia Syndromes Virus and 80 positive rat lung samples of epidemic hemorrhagic fever virus. Tests showed that plasmid containing the target gene were positive，others negative，and the limitation was 50 copies/reaction.The coefficient of variation in the repeatability test was 0.09%-0.87%，and the whole process from the sample nucleic acid extraction to detection is only 2 hours.This assay was rapid，specific，sensitive and reproducible characteristics，contribute to quarantine of the imported goods in insect，rodent animals，ocean shipping suspected patients and epidemiological surveillance of heartland virus.

Heartland Virus；Fever with Thrombocytopenia Syndromes；Real-Time RT-PCR

R512.8；Q789

E-mail：sb@zs.ziq.gov.cn；通訊作者E-mail：13325807588@163.com

浙江省科技廳公益技術(shù)研究社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（2015C33245）

2016-08-23