黃志盛　何海萍　梁銳彬

【摘要】 目的 探討載體介導(dǎo)短發(fā)夾核糖核酸（shRNA）對(duì)胃癌細(xì)胞株MKN45中原癌基因C-met的抑制作用。方法 9株胃癌細(xì)胞株分為轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組， 各3侏。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)， 觀察轉(zhuǎn)染24 h和48 h后， 原癌基因C-met的信使核糖核酸（mRNA）的CT值的變化；通過(guò)免疫印跡試驗(yàn)（Western blot）， 觀察轉(zhuǎn)染后C-met的蛋白變化；通過(guò)四氮唑鹽MTT比色法， 計(jì)算細(xì)胞存活率。結(jié)果 載體介導(dǎo)的C-met shRNA轉(zhuǎn)染24 h和48 h后， RT-PCR結(jié)果顯示， C-met的mRNA抑制率分別為56%和88%；與空白對(duì)照組比較， C-met的蛋白表達(dá)水平明顯下降， 轉(zhuǎn)染后24 h [（0.812±0.105） VS （0.640±0.011）]、48 h[（0.811±0.103） VS （0.331±0.009）]， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；MTT比色法顯示， 細(xì)胞存活率均有明顯下降， 轉(zhuǎn)染后24 h為65.9%， 48 h為59.6%。結(jié)論 載體介導(dǎo)的C-met shRNA不僅可降低胃癌細(xì)胞株MKN45中原癌基因C-met的mRNA及其蛋白表達(dá)水平， 而且對(duì)癌細(xì)胞的存活有明顯的抑制作用。

【關(guān)鍵詞】 載體介導(dǎo)；胃癌；信使核糖核酸；原癌基因C-met

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.05.015

Inhibiting effect by vector-mediated shRNA on C-met in stomach cancer cell strain MKN45 HUANG Zhi-sheng， HE Hai-ping， LIANG Rui-bin. Department of Gastroenterology， Guangzhou City Panyu District Shawan Peoples Hosptal， Guangzhou 511400， China

【Abstract】 Objective To investigate inhibiting effect by vector-mediated short hairpin RNA （shRNA） on proto-oncogene C-met in stomach cancer cell strain MKN45. Methods A total of 9 stomach cancer cell strains were divided into transfection group， negative control group and blank control group， with 3 strains in each group. Real-time fluorescent quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） was applied to observe changes of CT value of messenger ribonucleic acid （mRNA） in proto-oncogene C-met after 24 and 48 h of transfection. Western blot was used to observe changes of protein in C-met after transfection. Tetrazolium-based colorimetric assay （MTT） was applied to calculate cell survival rate. Results In 24 and 48 h after vector-mediated mRNA shRNA transfection， RT-PCR showed mRNA inhibition rates by C-met were respectively 56% and 88%. Comparing with the blank control group， C-met had obviously reduce protein expression level， as [（0.812±0.105） VS （0.640±0.011）] in 24 h after transfection and [（0.811±0.103） VS （0.331±0.009）] in 48 h after transfection. Their differences all had statistical significance （P<0.05）， MTT showed obviously decreased cell survival rate， as 65.9% in 24 h after transfection and 59.6% in 48 h after transfection. Conclusion Vector-mediated C-met shRNA can not only reduce mRNA and its protein expression in proto-oncogene C-met of stomach cancer cell strain MKN45， and also show remarkable inhibiting effect for survival of cancer cell.

【Key words】 Vector-mediated； Stomach cancer； Messenger ribonucleic acid； Proto-oncogene C-met

據(jù)Roder[1]報(bào)道， 我國(guó)為胃癌的高發(fā)地區(qū)。有研究發(fā)現(xiàn)[2]， RNA干擾是人為引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列雙鏈RNA， 誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mRNA降解， 達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 胃癌細(xì)胞株MKN45購(gòu)自上海市消化疾病研究所（共9株）；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；小鼠抗人β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）一抗、小鼠抗人C-met一抗、辣根過(guò)氧化物物酶標(biāo)記兔抗小鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司； C-met shRNA和陰性對(duì)照購(gòu)自美國(guó)OPEN-BIOSYSTEMS公司。

1. 2 方法 實(shí)驗(yàn)分組：轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染shRNA）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染錯(cuò)義序列）和空白對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染shRNA）， 各3株。細(xì)胞轉(zhuǎn)染， RT-PCR檢測(cè)各組的C-met的 mRNA表達(dá)， 讀取每孔的CT值[3， 4]， 計(jì)算各分組目的基因相對(duì)定量值。Western blot法檢測(cè)C-met的蛋白表達(dá)：收集各分組細(xì)胞， 加入稀釋過(guò)的抗體（小鼠抗人β-actin一抗1∶150、小鼠抗人C-met一抗1：150）4℃孵育過(guò)夜， 漂洗后加入辣根過(guò)氧化物物酶標(biāo)記兔抗小鼠二抗， 化學(xué)發(fā)光法顯色， 用目的蛋白C-met A值與內(nèi)參β-actin A值的比值分析[5]。MTT比色試驗(yàn)法檢測(cè)490 nm的吸收值（A）， 計(jì)算細(xì)胞存活率[6， 7]。

1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 RT-PCR檢測(cè)C-met的mRNA表達(dá)情況 RT-PCR結(jié)果顯示， C-met的mRNA抑制率分別為56%和88%；RT-PCR檢測(cè)各組C-met的mRNA表達(dá)水平見(jiàn)表1。

2. 2 Western blot檢測(cè)C-met 的蛋白表達(dá)水平 與空白對(duì)照組相比， 轉(zhuǎn)染C-met shRNA 24 h MKN45細(xì)胞中的C-met蛋白含量（0.640±0.011）和48 h MKN45細(xì)胞中的C-met蛋白含量（0.331±0.009）顯著降低， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而陰性對(duì)照組C-met蛋白含量分別為（0.809±0.101）、（0.808±0.104）和空白對(duì)照組C-met蛋白（0.812±0.105）、（0.811±0.1033）無(wú)明顯抑制， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2. 3 MTT試驗(yàn)結(jié)果 轉(zhuǎn)染后MTT法檢測(cè)胃癌細(xì)胞株MKN45的細(xì)胞存活率， C-met shRNA轉(zhuǎn)染24 h后存活率為65.9%、轉(zhuǎn)染48 h后存活率為59.6%， 均低于陰性對(duì)照組的96.3%、98.4%。

3 討論

鑒于原癌基因C-met在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中的重要作用及RNAi技術(shù)在腫瘤基因治療中的巨大潛在價(jià)值。RNAi技術(shù)可有效沉默胃癌細(xì)胞株中的原癌基因C-met的表達(dá)， 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡， 但研究多數(shù)采用的是siRNA或者miRNA技術(shù)。本研究應(yīng)用shRNA技術(shù)， 通過(guò)沉默原基基因C-met的表達(dá)， 降低腫瘤細(xì)胞的存活率， 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

本研究采用的C-met shRNA， 簡(jiǎn)單、易操作， 而且該C-met shRNA轉(zhuǎn)染高， 其設(shè)計(jì)的沉默序列可保證有效、有針對(duì)性地沉默腫瘤細(xì)胞中的C-met的表達(dá)。本研究通過(guò)RT-PCR、Western blot和MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知， C-met shRNA成功沉默原癌基因C-met， 致使其mRNA及蛋白表達(dá)明顯下降， 并使腫瘤細(xì)胞存活率下降， 成功誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡；比較轉(zhuǎn)染C-met shRNA 24 h及48 h結(jié)果可知， 隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的增長(zhǎng)， C-met shRNA沉默作用也增強(qiáng)；而比較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組結(jié)果可知， 介導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的載體對(duì)原癌基因C-met無(wú)直接抑制作用， 關(guān)鍵在于C-met shRNA的直接抑制作用。

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[收稿日期：2015-10-26]