李曉凱，喬 賢，麗 春，范一星，蘇 蕊

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

高通量測序技術(shù)在古DNA上的研究進(jìn)展

李曉凱1*，喬 賢1*，麗 春2，范一星1，蘇 蕊1

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

古DNA研究經(jīng)過30多年的蓬勃發(fā)展，尤其是在高通量測序技術(shù)廣泛應(yīng)用的歷史背景下，在研究動植物的起源、馴化、進(jìn)化以及系統(tǒng)發(fā)育重建等方面起到了重要作用。主要就近年來高通量測序技術(shù)在古DNA上的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，對古DNA研究存在的問題進(jìn)行了歸納，并對其未來的發(fā)展進(jìn)行了展望。

高通量測序；古DNA；宏基因組

古DNA（ancient DNA，aDNA）是古代生物遺骸中保留下來的遺傳物質(zhì)，包括古代動植物、古人類等的DNA，是現(xiàn)代科學(xué)研究中的一項(xiàng)重要的遺傳資源，其獲取途徑主要是考古挖掘或博物館收藏的古代動植物或人類的遺體或者殘存遺跡，以及須經(jīng)過打磨、液氮裂解和脫鈣等預(yù)處理后才能提取出DNA片段的古代動植物化石［1］。自1984年，Higuchi等對保存在博物館的Quagga（斑驢，1883年滅絕）樣本進(jìn)行了DNA提取，并利用獲得的DNA片段成功地構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹以來，關(guān)于古DNA分析在動物研究中的重要作用逐漸被人們所重視，隨后掀起了研究古DNA的熱潮，為在分子水平上構(gòu)建滅絕物種與其近親的親緣關(guān)系研究提供了有價(jià)值的參考［2］。對古DNA的研究，有助于了解動植物的起源、進(jìn)化和馴化過程，為進(jìn)一步深入研究人類和動植物的遷徙路線、系統(tǒng)進(jìn)化重建提供了一把鑰匙，也有效地填補(bǔ)了現(xiàn)代DNA研究在時(shí)間跨度上的不足。此外，古DNA研究還提供了某些已經(jīng)滅絕生物的形態(tài)學(xué)和分子遺傳資料，為從序列上確定古代材料的系統(tǒng)位置以及為僅用現(xiàn)代DNA建立起來的譜系提供了來自古生物的依據(jù)。

近10年來，隨著分子生物學(xué)和大規(guī)模測序技術(shù)的快速發(fā)展，古DNA研究已經(jīng)形成了以分子生物學(xué)理論和技術(shù)為基礎(chǔ)，與考古學(xué)、人類學(xué)及古生物等學(xué)科交叉產(chǎn)生的一個(gè)新的研究領(lǐng)域。在前人工作的基礎(chǔ)上，結(jié)合高通量測序技術(shù)的優(yōu)勢，研究古DNA也能夠突破現(xiàn)有研究資料的束縛，更深一步地研究動植物各種特征形成的遺傳基礎(chǔ)和遺傳變異。該文就高通量測序技術(shù)廣泛應(yīng)用于古DNA測序研究方面研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，并對古DNA的研究歷史進(jìn)行了簡單的回顧，對古DNA研究存在的問題歸納和未來發(fā)展進(jìn)行了展望。

1 古DNA研究簡史

在高通量測序技術(shù)廣泛運(yùn)用之前，科學(xué)家們就已經(jīng)對古DNA進(jìn)行了20多年的探索研究。我國科學(xué)家王貴海、陸傳宗早在1981年就對馬王堆漢代古墓出土的古尸進(jìn)行了核酸的分離、鑒定［3］。但古DNA這個(gè)名詞的首次出現(xiàn)是在《Nature》雜志上關(guān)于已經(jīng)滅絕的Quagga（斑驢）的研究報(bào)道［2］。幾乎同時(shí)，P??bo也在《Nature》上發(fā)表關(guān)于埃及木乃伊的研究［4］。這兩項(xiàng)研究成果的公布，引起了更多科學(xué)家們的關(guān)于古DNA研究的熱情。

在PCR技術(shù)應(yīng)用之前，參與古DNA研究的科學(xué)家主要利用克隆測序技術(shù)進(jìn)行序列測定的研究。生物機(jī)體死亡后，因氧化、水解及微生物降解等共同作用導(dǎo)致受損傷DNA克隆效率低下及宿主對克隆過程中的DNA分子進(jìn)行某些修補(bǔ)或修復(fù)作用導(dǎo)致無法完全真實(shí)反映古代生物遺傳信息。因此，在這段時(shí)間內(nèi)關(guān)于古DNA研究報(bào)道較少，主要成果有Higuchi等對保存在博物館的Quagga（斑驢，1883年滅絕）的研究和P??bo對距今2 400多年的埃及木乃伊的研究，雖然后者在以后的研究中受到了質(zhì)疑。

隨著PCR體外擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)用和化石DNA提取技術(shù)的逐漸成熟，極大地彌補(bǔ)了克隆測序中存在問題和豐富了古DNA研究資源，極大地促進(jìn)了有關(guān)古DNA的研究進(jìn)程，掀起了古DNA研究熱潮［5］。這段時(shí)期內(nèi)的重要研究成果有關(guān)于琥珀中的白蟻線粒體DNA、象鼻蟲DNA的研究、孢子中古細(xì)菌DNA以及木蘭屬化石葉綠體DNA的研究［6-9］。

在PCR反應(yīng)中，易受到污染的現(xiàn)代DNA優(yōu)先擴(kuò)增的影響以及在一次擴(kuò)增中片段大小限制等原因，在一定程度上也影響了古DNA研究的發(fā)展。2005年以后，高通量測序技術(shù)的成熟，使得科學(xué)家可以對樣本中特定區(qū)域以外的所有DNA分子的測序研究成為可能。高通量測序技術(shù)的應(yīng)用不僅可以對較小的DNA片段進(jìn)行測序組裝，也擴(kuò)寬了古DNA的研究內(nèi)容，如在DNA甲基化完整圖譜、蛋白質(zhì)的分析、核小體圖譜和胞嘧啶甲基化水平等方面的研究［10-12］。此外，測序技術(shù)的發(fā)展也使科學(xué)家們可以對更古老的樣本進(jìn)行研究，如對加拿大育空地區(qū)凍土層中的70萬年前的古馬化石進(jìn)行了測序研究［13］。

關(guān)于古DNA的研究并非一帆風(fēng)順，因?yàn)楣臘NA的降解作用，在PCR擴(kuò)增時(shí)，會優(yōu)先選擇現(xiàn)代DNA為模板，導(dǎo)致研究過程極易受到現(xiàn)代DNA的污染，因此科學(xué)家曾經(jīng)就古DNA的真實(shí)性問題提出了質(zhì)疑，甚至有科學(xué)家認(rèn)為所有得到的古DNA都有可能是一些污染的PCR產(chǎn)物［14］。如從8 000萬年前恐龍骨骼碎片中得到的“古DNA”序列經(jīng)證實(shí)不過是現(xiàn)代人類祖先的DNA，而從2 000萬年前木蘭葉化石中提取的葉綠體古DNA，經(jīng)PCR測試后證實(shí)是葉片發(fā)生感染后的細(xì)菌DNA［15-16］。然而這些古DNA研究并非一無是處，DNA被污染的問題也促使他們在挖掘、分類、保管和測序時(shí)更加小心和科學(xué)處理。隨著后來Poinar和Green等科學(xué)家分別對Neandertal人的不同片段大小的線粒體DNA研究比對分析，證明了古DNA存在的可靠性，古DNA的研究也迎來了發(fā)展的黃金時(shí)期［17-18］。因此為了保證古 DNA研究結(jié)果的可靠性，Handt和P??bo等呼吁并建立嚴(yán)格的研究和實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，為以后的古DNA提取、實(shí)驗(yàn)處理、數(shù)據(jù)分析等方面提供了學(xué)術(shù)研究標(biāo)準(zhǔn)［19-20］。 為了最大限度降低DNA受污染的風(fēng)險(xiǎn)以及評估DNA含量，研究人員通過不同分子模式的差異來區(qū)分現(xiàn)代、古代的DNA和使用PCR評估環(huán)境與內(nèi)源性DNA的相對豐富度［18-19］。

2 古DNA的測序研究進(jìn)展

高通量測序技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用為進(jìn)一步深入研究古基因組學(xué)提供了可能，使得科研人員可以通過對核DNA的測序分析更精確地研究不同物種的基因組受選擇作用的遺傳基礎(chǔ)、物種的復(fù)雜進(jìn)化關(guān)系及為分子系統(tǒng)進(jìn)化分析提供時(shí)間標(biāo)尺，揭示推斷物種過去與現(xiàn)在隱藏的復(fù)雜關(guān)系。2005年，美國科學(xué)家首次利用高通量測序方法對一頭4萬年前洞熊的牙齒進(jìn)行基因組提取、測序研究，測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，大約僅有6%的DNA是來自洞熊，但研究中獲得的27 kb大小核基因組為以后古生物基因組的測序組裝研究提供了參考［19］。

高通量測序技術(shù)在古基因組學(xué)首次研究是關(guān)于猛犸象化石的和尼安德特人化石的研究。2006年，Richard等對距今 38 000年已經(jīng)滅絕的尼安德特人的化石進(jìn)行測序研究，比對分析發(fā)現(xiàn)現(xiàn)代人與尼安德特人分化時(shí)間約為50萬年前［21］。

2011年，科學(xué)家們對木乃伊宏基因組首次利用高通量測序技術(shù)進(jìn)行測序，隨后，科學(xué)家們利用宏基因組學(xué)研究方法對有 215年歷史的木乃伊進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)了肺結(jié)核基因組，表明宏基因組技術(shù)可以不經(jīng)過細(xì)菌的培養(yǎng)而非常有效的追蹤傳染病演變和傳播，可以進(jìn)一步了解古代的疾病，有助于預(yù)防新型疾病或者過去曾經(jīng)出現(xiàn)的疾?。?8］。

2010年，Kyle等完成了約63%的安德特人基因組草圖；隨后在2012年，Meyer等利用3萬～8萬年前的西伯利亞丹尼索亞人（一種滅絕的尼安德上特人近親）的指骨上提取的長度僅有35個(gè)堿基對的DNA碎片進(jìn)行整合、拼接，在《science》上發(fā)表了一個(gè)高質(zhì)量的基因組序列，為進(jìn)一步研究人類起源進(jìn)化提供了參考［22-23］。2015年，Qiaomei等通過目的性的大區(qū)域區(qū)域核DNA富集測序，發(fā)現(xiàn)距今約4萬年前的歐洲現(xiàn)代人含有6%～9%左右的尼安德特人基因，超出早期關(guān)于現(xiàn)代人和現(xiàn)存歐亞大陸人基因組含量（1%～4%）的研究；推測現(xiàn)代人祖先與尼安德特人的基因交流可能不僅僅局限于中東，很可能在之后的歐洲也同樣發(fā)生過［22，24］。

2013年，Ludovic等利用馬腿骨中DNA進(jìn)行短基因序列組裝，獲得了70萬年前中更新世時(shí)期北美洲的凍土地區(qū)馬的基因圖譜，是迄今所測繪的最古老的基因組序列。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，馬可能是在400萬年前由驢演化而來，而普氏野馬（przewalski′s horse）約在5萬年前由家馬中分支出來。比較基因組研究還發(fā)現(xiàn)古代馬基因組中不含有現(xiàn)代馬基因組中與血細(xì)胞、繁殖、毛色和肌肉等相關(guān)的基因，說明現(xiàn)代馬經(jīng)歷了強(qiáng)烈的馴化過程［10］。 2015年Eleftheria等分別對來自44 800年前晚更新世的西伯利亞東北地區(qū)和43 000年前弗蘭格爾島地區(qū)的猛犸象進(jìn)行測序研究，群體遺傳分析發(fā)現(xiàn)在中、晚更新世時(shí)猛犸象群體出現(xiàn)瓶頸現(xiàn)象，而弗蘭格爾島猛犸象在末次冰期群體顯著下降。比較基因組分析發(fā)現(xiàn)，弗蘭格爾島地區(qū)猛犸象的遺傳多樣性較低且有近親交配現(xiàn)象［25］。

古DNA的研究也可幫助解決一些無頭公案和人口失蹤案件的偵破，如Parabon納米實(shí)驗(yàn)室和I-dentitas 2家公司目前正在為犯罪調(diào)查提供現(xiàn)代基因測序技術(shù)，即利用微陣列基因分型技術(shù)確定的數(shù)十萬個(gè)單核苷酸多態(tài)（SNPs），可以提供眼球、頭發(fā)顏色和雀斑等各種表型特征信息，該技術(shù)的成熟應(yīng)用將極大促進(jìn)現(xiàn)場受到嚴(yán)重破壞的刑事案件偵破［26］。

3 研究展望

經(jīng)過了30多年的歷史積累，尤其是在分子生物學(xué)、測序技術(shù)和生物信息學(xué)快速發(fā)展的當(dāng)今社會，古DNA在人類和動植物起源、馴化、系統(tǒng)發(fā)育重建等研究方面日顯重要。尤其在近10年，測序技術(shù)的快速發(fā)展極大地促進(jìn)了古DNA在各領(lǐng)域的研究應(yīng)用。納米孔測序法等第3代技術(shù)在古DNA的研究運(yùn)用促使了研究人員可以進(jìn)行更深入、更廣泛的研究探索。如對有70萬年歷史馬的DNA序列的成功測定，對4.3萬年前猛犸象化石蛋白質(zhì)組研究，對尼安德特人和丹尼索亞人的DNA甲基化圖譜研究等。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，對古DNA的研究內(nèi)容將更加廣泛，也使對古DNA的研究越來越受到重視。對古生物的測序研究限于技術(shù)等原因，更古老的DNA測序研究依然是科學(xué)領(lǐng)域面對的一個(gè)極大的挑戰(zhàn)。DNA除雜和測序技術(shù)若能得到更進(jìn)一步的創(chuàng)新，追溯到更久遠(yuǎn)年代的遺傳信息也將成為可能。目前，在古DNA的研究上因片段太小和死后基因組序列的變化等都導(dǎo)致在基因組組裝上出現(xiàn)了很大的困難；另外，DNA受到外界的各種污染一直是研究中的主要問題。不同物種基因組測序工作的完成以及不斷積累的古DNA測序數(shù)據(jù)，將進(jìn)一步解決基因組組裝方面的問題。不斷完善的挖掘、保存手段、DNA除雜和DNA提取方法、測序手段，也使古DNA研究的可靠性越來越受到肯定，追溯到更久遠(yuǎn)年代的遺傳信息也將成為可能。

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（責(zé)任編輯：錢英紅）

Research Progress on Application of High Throughput Sequencing Technology in Study of Ancient DNA

LI Xiao-kai1*，QIAO Xian1*，LI Chun2，F(xiàn)AN Yi-xing1，SU Rui1
（1.College of Animal Science,Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China；2.Inner Mongolia University for the Nationalities，Tongliao 028000，China）

In the past 30 years,the investigation of ancient DNA has been vigorously developed.Under the background that highthroughput sequencing technology is widely employed,the ancient DNA plays an important role in clarifying the mechanism of origin,domestication,evolution and phylogenetic reconstruction of plants and animals.In this paper,the research progress on application of high throughput sequencing technology in investigation of ancient DNA was reviewed,the existing problems in study of ancient DNA were summarized,and the development of ancient DNA study in future was prospected.

high-throughput sequencing；ancient DNA；metagenome

Q91-3；Q78

A文章順序編號：1672-5190（2016）02-0098-04

2016－01－20

項(xiàng)目來源：國家絨毛用羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（nycytx-40-8）；國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（31402052）；內(nèi)蒙古自然科學(xué)博士基金項(xiàng)目（2014BS0313）；內(nèi)蒙古民族大學(xué)科學(xué)研究項(xiàng)目（BS308）。

李曉凱（1990—），男，碩士研究生，主要研究方向?yàn)閯游镞z傳育種。喬賢（1991—），女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)閯游镞z傳育種。

*李曉凱、喬賢為并列第一作者。

蘇蕊（1980—），女，副教授，博士，主要研究方向?yàn)閯游镞z傳育種。