張容宇，郝 玉，尹 俊

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

紅腹錦雞胚胎期羽毛芽發(fā)育的研究

張容宇，郝 玉，尹 俊

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

旨在了解紅腹錦雞胚胎期羽毛毛囊的組織結(jié)構(gòu)及毛囊形態(tài)發(fā)生的變化過(guò)程，為研究紅腹錦雞羽毛毛囊發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理奠定組織學(xué)基礎(chǔ)。分別對(duì)5、7、8、9、10、11、13、16、18日胚齡的紅腹錦雞胚胎發(fā)育情況進(jìn)行實(shí)體觀察；采集上述胚齡的紅腹錦雞背部皮膚，制作石蠟切片并進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下觀察毛囊形態(tài)結(jié)構(gòu)并拍照記錄。紅腹錦雞胚胎于9日胚齡時(shí)羽毛芽開(kāi)始發(fā)育，可以觀察到色素在毛囊內(nèi)的沉積，16日胚齡時(shí)毛囊發(fā)育基本完成，體表覆蓋羽毛。該研究為進(jìn)一步闡明紅腹錦雞羽毛發(fā)育的分子機(jī)制奠定了組織學(xué)基礎(chǔ)。

紅腹錦雞；胚胎；羽毛芽；發(fā)育

紅腹錦雞（Chrysolophus pictus）又名金雞，屬鳥綱、雞形目、雉科、錦雞屬。在我國(guó)紅腹錦雞主要分布于青海東南部、寧夏南部、湖南、西藏東部、河南、云南、廣西、陜西南部、湖北西部、甘肅東部和南部、四川等地，是我國(guó)二級(jí)保護(hù)動(dòng)物。國(guó)外常分布于緬甸東北部。紅腹錦雞羽毛色彩鮮艷，光彩奪目，且不同顏色的羽毛在身體上生長(zhǎng)的位置也不相同，是聞名中外的觀賞鳥種［1-4］。

軀體被附羽毛是禽類的典型特征，雖然羽毛的形態(tài)功能各異，但它們都是由單個(gè)的毛囊發(fā)育而來(lái)。毛囊是一種皮膚附屬器官，它的發(fā)育控制著羽毛的生長(zhǎng)發(fā)育和再生，其形態(tài)發(fā)生過(guò)程比較復(fù)雜，包括一系列精細(xì)的調(diào)控過(guò)程，如表皮角質(zhì)化過(guò)程中特異性分化的表皮細(xì)胞和形成毛乳頭的間充質(zhì)細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用等［5-6］。

迄今為止，有關(guān)紅腹錦雞羽毛毛囊形態(tài)學(xué)規(guī)律尚缺乏研究。目前，有國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道了雞的羽毛發(fā)育過(guò)程［7］，同時(shí)也對(duì)胚胎期鵝和鴨的羽毛毛囊發(fā)育、毛囊形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行了研究［8-10］。相關(guān)研究闡明了β-catenin基因調(diào)控羽毛毛囊發(fā)育的分子機(jī)制［11］，而Widelitz等［5］已證實(shí)雞的羽毛原基起源于扁平表皮。該研究通過(guò)對(duì)紅腹錦雞胚胎期皮膚組織的顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，了解其羽毛毛囊的組織結(jié)構(gòu)及毛囊形態(tài)發(fā)生的變化過(guò)程，以期為研究紅腹錦雞羽毛毛囊發(fā)育及羽毛顏色的形成機(jī)制奠定組織學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 組織材料 5～18日胚齡的紅腹錦雞胚胎。

1.2 主要試劑和儀器 4%多聚甲醛（America，Sigma，pH值=7.4），100%乙醇；培養(yǎng)皿，組織防脫載玻片，蓋玻片，剪刀，手術(shù)刀片，鑷子；解剖鏡，照相機(jī)，石蠟切片機(jī)（Leica 2035，德國(guó)），顯微鏡（Nikon80i），等等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 胚胎期皮膚的采集：用剪刀、鑷子等硬物，在超凈工作臺(tái)上輕輕敲打種蛋外殼的鈍端，并去掉氣室部位的蛋殼，然后把蛋殼內(nèi)的物體倒入潔凈的培養(yǎng)皿內(nèi)，用處理好的鑷子分別剝離出5、7、8、9、10、11、13、16、18日胚齡的紅腹錦雞胚胎，并用手術(shù)刀片固定，取背部皮膚約2 cm2，隨后將紅腹錦雞胚胎浸泡到4%多聚甲醛中，4℃過(guò)夜保存，固定24 h左右。

1.3.2 石蠟包埋及組織切片的制作：選擇8、9、11、16日胚齡紅腹錦雞胚胎背部皮膚制作石蠟切片，步驟如下。

①固定：將紅腹錦雞胚胎浸泡到4%多聚甲醛中，4℃過(guò)夜保存，固定24 h左右。

②脫水：70%乙醇漂洗2 h；80%乙醇漂洗2 h；95%乙醇漂洗2 h；100%乙醇漂洗過(guò)夜，第2天再換1次100%乙醇；在-20℃可長(zhǎng)期保存。梯度酒精均用DEPC水配制。

③石蠟包埋：二甲苯透明2次，每次30 min，50%二甲苯和50%石蠟混合1 h，抽氣過(guò)夜，換全蠟。

④組織切片：修整石蠟塊，并將石蠟塊粘在大小合適的固定物上，根據(jù)組織的方向隨時(shí)調(diào)整切片刀口與石蠟塊的方向，并用解剖鏡隨時(shí)觀察調(diào)整切片角度，切片厚度為6 μm；撈片。

⑤HE染色：將石蠟切片放入55℃烘箱內(nèi)20 min，取出切片置于室溫晾20 min；二甲苯，5 min；二甲苯，5 min；100%乙醇，5 min；100%乙醇，5 min；95%乙醇，2 min；80%乙醇，2 min；70%乙醇，2 min；蒸餾水，3 min；蘇木素，1 min；自來(lái)水，3 min；鹽酸酒精分化，2 s；自來(lái)水，3 min；飽和碳酸鋰返藍(lán)，30 s；自來(lái)水，3 min；伊紅，5 min；95%乙醇，5 min；95%乙醇，5 min；100%乙醇，5 min；100%乙醇，5 min；二甲苯，3 min；二甲苯，3 min；用中性樹(shù)膠封片，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 胚胎實(shí)體及羽毛毛囊結(jié)構(gòu)觀察 觀察不同胚齡紅腹錦雞的實(shí)體胚胎，使用顯微鏡觀察不同胚齡紅腹錦雞的羽毛毛囊結(jié)構(gòu)，首先在4倍鏡下找到視野，然后在10倍鏡、20倍鏡、40倍鏡下觀察縱切切片。

2 結(jié)果與分析

圖1 不同胚齡紅腹錦雞的胚胎發(fā)育

2.1 紅腹錦雞實(shí)體胚胎觀察結(jié)果 通過(guò)解剖鏡及微距相機(jī)拍照可見(jiàn)，5日胚齡的紅腹錦雞胚胎體長(zhǎng)僅1 cm左右，體表光滑，且外部由一層透明黏膜包裹（圖1A）；8日胚齡時(shí)體長(zhǎng)約2.5 cm，眼睛發(fā)育明顯，體表仍未觀察到明顯的羽毛芽（圖1C）；9日胚齡時(shí)胚胎長(zhǎng)度約3 cm，頭部和眼睛繼續(xù)發(fā)育，頭部、背部、大腿及尾部皮膚均有突起的羽毛芽出現(xiàn)，并且隨著胚齡的增加突起數(shù)量逐漸增多且明顯 （圖1D）；10日胚齡時(shí)體長(zhǎng)約4 cm，翅膀表面也出現(xiàn)突起的羽毛芽 （圖1E）；11日胚齡時(shí)體長(zhǎng)約5 cm，沿中軸線兩側(cè)的胸部及腹部也出現(xiàn)少量突起的羽毛芽（圖1F）；13日胚齡時(shí)體長(zhǎng)約7 cm，可以觀察到有羽毛芽從頭部皮膚生長(zhǎng)出來(lái)，并一直伸長(zhǎng)形成頭部羽毛，背部的羽毛芽從中軸兩側(cè)生長(zhǎng)出來(lái)，胸部及腹部也有羽毛芽長(zhǎng)出，同時(shí)翅膀、腿部、尾部均發(fā)現(xiàn)有羽毛芽長(zhǎng)出，隨著發(fā)育的不斷進(jìn)行羽毛芽不斷伸長(zhǎng)，并且數(shù)量不斷增加直至將翅膀、腿部、尾部完全覆蓋（圖1G）；16日胚齡時(shí)，羽毛已經(jīng)覆蓋全身，背部羽毛長(zhǎng)約2～3 cm（圖1H）；至18日胚齡時(shí)，體長(zhǎng)達(dá)到10 cm，羽毛覆蓋整個(gè)頭部、背部、頸部以及胸腹部，背部羽毛超過(guò)3 cm（圖1I）。在紅腹錦雞的胚胎期，背腹軸相比，背部羽毛顏色較腹部更深，呈現(xiàn)黑棕色，腹部羽毛顏色較淺，呈現(xiàn)亮棕色，單根羽毛的前端呈現(xiàn)淡黃色，后半段呈現(xiàn)黑色。

圖2 不同胚齡紅腹錦雞的背部皮膚組織結(jié)構(gòu)

紅腹錦雞胚胎發(fā)育周期為20～21 d，9日胚齡之前體表未觀察到羽毛芽凸起，從9日胚齡開(kāi)始，頭部和背部可觀察到羽毛芽。翅膀部位羽毛發(fā)育較為遲緩，胸腹部皮膚發(fā)育最為緩慢，胚胎發(fā)育到第11天時(shí)，才能從中軸線兩側(cè)觀察到少量突起的羽毛芽。與鵝胚胎發(fā)育不同的是紅腹錦雞大部分羽毛呈黑棕色，這是由于大量黑色素和少量真黃素在羽毛中沉積而造成的；紅腹錦雞胚胎只有胸腹部羽毛呈黃色，這是由于羽毛中真黃素的量大于真黑素所致。

2.2 顯微鏡下紅腹錦雞胚胎切片觀察結(jié)果 從紅腹錦雞胚胎切片的HE染色圖可以看出，8日胚齡時(shí)背部皮膚呈多層結(jié)構(gòu)，未見(jiàn)羽毛芽發(fā)育（圖2A，2a）；9日胚齡時(shí)，真皮細(xì)胞在表皮囊泡的下方聚集，并形成羽毛芽表皮基板 （圖2B，2b）；11日胚齡時(shí)，羽毛芽不斷伸長(zhǎng)，羽毛毛囊發(fā)育進(jìn)入長(zhǎng)芽階段，此時(shí)可以觀察到黑色素已在羽毛的遠(yuǎn)端形成（圖2C，2c）；至16日胚齡時(shí)，由于背部羽毛的毛囊腔被羽毛芽填充，使其開(kāi)始逐漸消失，此時(shí)羽毛鞘和毛囊壁已緊貼在一起，并成為一個(gè)單層，同時(shí)羽毛纖維上有黑色素沉積，使毛囊顏色開(kāi)始變深 （圖2D，2d）。

3 討論

羽毛的生長(zhǎng)發(fā)育源于毛囊。毛囊由真皮和表皮組成，毛囊形態(tài)發(fā)生的信號(hào)起源于真皮，兩者之間的信號(hào)傳遞過(guò)程對(duì)毛囊發(fā)育起著重要作用。Widelitz等［5］將禽類胚胎期毛囊發(fā)育分為4個(gè)連續(xù)的階段，即宏觀排列、微觀排列、毛囊形態(tài)發(fā)生和芽?jī)?nèi)形態(tài)發(fā)生。在雞羽毛研究方面，已有研究指出雞羽毛毛囊發(fā)育大體可分為早期變化和晚期變化2個(gè)方面［12］，這與該試驗(yàn)結(jié)果大致相符。在該研究中，紅腹錦雞羽毛毛囊發(fā)育也大致分為2個(gè)階段，9～11日胚齡即為早期毛囊形態(tài)發(fā)生階段。

從紅腹錦雞胚胎的HE染色圖中可以看出，在8日胚齡時(shí)，位于表皮下方的細(xì)胞開(kāi)始增殖并聚集。Noramly等［11］認(rèn)為該類細(xì)胞為間充質(zhì)細(xì)胞，其在羽區(qū)下方增殖并形成了一層致密的真皮組織。9日胚齡時(shí)，羽芽原基開(kāi)始形成；隨著表皮的不斷隆起，羽芽開(kāi)始形成；在該階段，羽芽發(fā)育的前期是對(duì)稱的，隨后建立起前—后軸，由于前端細(xì)胞分裂速度快于后端，從而導(dǎo)致羽芽向一側(cè)傾斜，并與皮膚表面呈一定的角度。Chen等［13］研究表明，前—后軸的建立與Notch/Delta的信號(hào)調(diào)節(jié)有關(guān)。該研究中，紅腹錦雞在11日胚齡時(shí)，長(zhǎng)芽基部周圍的表皮開(kāi)始內(nèi)陷，并形成了毛囊原型，羽毛發(fā)育進(jìn)入短芽階段；此時(shí)，短芽大部分在羽區(qū)內(nèi)以對(duì)稱的形式呈現(xiàn)，只有少部分形成了前后不對(duì)稱的羽芽；隨著發(fā)育的不斷進(jìn)行，羽芽不斷伸長(zhǎng)，最后形成了長(zhǎng)芽；16日胚齡時(shí)，大部分的羽毛毛囊發(fā)育完全，可以明顯地觀察到羽毛中有色素沉積。

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（責(zé)任編輯：趙俊利）

Development Characteristics of Feather Bud of Chrysolophus pictus in Embryonic Period

ZHANG Rong-yu，HAO Yu，YIN Jun
（College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot010018，China）

The aims of the present study were to observe the histological structure of feather follicles of Chrysolophus pictus in embryonic period and its morphological changes,and to provide a histological base for the investigation of molecular regulation mechanism of Chrysolophus pictus feather follicles development.The development characteristics of Chrysolophus pictus embryos with 5,7,8,9,10,11,13,16,18-day embryonic ages were observed,respectively.The back skin of Chrysolophus pictus embryos with above-mentioned embryonic ages were collected respectively and were used to prepare paraffin sections which were subsequently stained using a standard HE staining method.The morphological structure of feather follicles was observed using an optical microscope.The feather buds development of Chrysolophus pictus embryo with 9-day embryonic age was initially observed,and the pigment deposition in feather follicles was found.In 16-day embryonic age,the development of feather follicles was basically completed,and the body surface of Chrysolophus pictus embryo was covered with feather.The results of the study may provide a histological base for clarifying the molecular regulation mechanism of feather development of Chrysolophus pictus.

Chrysolophus pictus；embryo；feather bud；development

S831.891

A文章順序編號(hào)：1672-5190（2016）02-0001-04

2016－01－10

項(xiàng)目來(lái)源：內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目（2013ZD06）；國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目（2013GA640014）。

張容宇（1989—），女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物分子遺傳學(xué)。

尹?。?967—），男，教授，博士，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物分子遺傳學(xué)。