丁 磊，劉 鵬，葉 辛，鄧安梅，任永亞，吳天勤，錢 琤

(1.蘇州市吳中區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇蘇州 215200；2.第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院，上海 200433；3.解放軍100醫(yī)院，江蘇蘇州 215007)

miRNA也稱microRN A，是真核生物中廣泛存在的一種長度為21～23nt的RNA分子，可以通過誘發(fā)mRNA降解或抑制蛋白翻譯的方式負調(diào)控靶基因[1]。研究表明miRNA參與生物干細胞分化、信息傳遞、器官生長發(fā)育、腫瘤等多個過程，因此miRNA的異常表達通常會導(dǎo)致疾病的發(fā)生[2，3]。

免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)，舊稱為特發(fā)性血小板減少性紫癜，是一種自身免疫介導(dǎo)的以血小板下降為特征的出血性疾病[4，5]。其發(fā)病原因尚不清楚，T細胞、B細胞、巨核細胞、抗原遞呈細胞等在ITP的發(fā)病過程均發(fā)揮作用，有文獻報道m(xù)iRNA與ITP之間存在著一定的聯(lián)系[6～8]，本實驗研究通過實時定量PCR的方法檢測患者外周血單個核細胞中miR-491-5p的表達水平，分析其與患者血小板計數(shù)之間的相關(guān)性，為后續(xù)研究提供新線索。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集解放軍第100醫(yī)院血液科2014年9月～2015年9月收治的ITP初發(fā)患者外周抗凝全血40例，均未接受過相關(guān)治療，診斷符合國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)[9]，其中男性22例，女性18例，年齡25～65歲。其中經(jīng)治療后完全緩解者22例，男性12例，女性10例，年齡26～51歲；同期健康體檢者40例作為對照組，其中男性21例，女性19例，年齡23～67歲。每例標(biāo)本大約2 ml，所有標(biāo)本在2 h內(nèi)處理完畢并保存在-80℃冰箱待檢。此項研究通過醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，受試者均已簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購自Takara公司；Trizo試劑(Invitrogen life technologies)、淋巴細胞分離液、100 ml/dl乙醇、氯仿、異丙醇均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；DEPC水，紅細胞裂解液，雙蒸水，200 μl EP管，2 ml EP管，純水儀，Centrifuge 5417 R低溫高速離心機；紫外分光光度計(ND-1000，Nanodrop Technologies)、梯度PCR儀(ABI)、PCR儀(ABI7500)均產(chǎn)自美國。

1.3 方法

1.3.1 ITP患者治療方案和療效標(biāo)準(zhǔn)：①糖皮質(zhì)激素(40 mg/天×4天)。②潑尼松(30 mg/kg/天)。③ITP的緊急治療、不耐受腎上腺糖皮質(zhì)激素、妊娠等患者可加用丙種球蛋白(400 mg/kg/天×5天)。ITP診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)參照國內(nèi)專家共識[9]。

1.3.2 初診組ITP患者分組標(biāo)準(zhǔn)：將初診組ITP患者按上述方案治療后，血小板>100×109/L且病情穩(wěn)定的患者歸完全緩解組，共22例；血小板<100×109/L的患者或治療有效但復(fù)發(fā)的患者歸未完全緩解組，共18例。

1.3.3 外周血單個核細胞(PBMC)分離和總RNA提?。核谢颊咴谥委熐坝肊DTA-K2抗凝管采集空腹靜脈血2 ml，對照組同樣用EDTA-K2抗凝管采集空腹靜脈血2 ml。用淋巴細胞分離液從2 ml靜脈血中分離PBMC，用Trizol法提取細胞的總RNA，用紫外分光光度計(ND-1000，Nanodrop Technologies)檢測所提取RNA 的濃度和純度。

1.3.4 cDNA的合成以及real-timePCR反應(yīng)：miR-491-5P和U6的特異引物由上海賽百勝公司設(shè)計和合成，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，用定量PCR試劑盒(Tkara公司)進行核酸擴增，反轉(zhuǎn)錄和PCR條件及實驗過程嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism 5進行統(tǒng)計分析，組間均值比較采用獨立樣本t檢驗(studentttests)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ITP患者各組外周血單個核細胞miR-491-5P的表達 初診組(5.07±1.70)與對照組(1.92±0.95)外周血單個核細胞miR-491-5P的表達相比上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.36，P<0.01)；治療后完全緩解組(2.32±1.07)與其初診時(4.95±0.83)外周血單個核細胞miR-491-5P的表達相比下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.94，P<0.01)。

2.2 相關(guān)性分析 40例ITP初發(fā)患者外周血單個核細胞miR-491-5P與血小板計數(shù)呈負相關(guān)(r=-0.769 7，P<0.01)。

3討論miRNA是作為一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，人體中存在大量的miRNA，20%～30%的mRNA是miRNA的作用靶點，但目前對miRNA在免疫性疾病中發(fā)揮的功能還有待進一步深入研究，如miRNA與ITP的發(fā)病與發(fā)展情況。

miR-491-5p屬于miR-491家族，位于9p21.3脆性位點，近年來國內(nèi)外學(xué)者對其研究也逐漸增多。Gong等[10]研究表明miR-491-5p通過作用IGF2BP1來抑制非小細胞肺癌細胞的遷移和侵襲，與相應(yīng)癌旁正常組織比較，miR-491-5p在非小細胞肺癌組織中的表達顯著下調(diào)；Zhao等[11]研究表明miR-491-5p抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細胞凋亡，抑制腫瘤生長，這些功能是通過作用于靶基因人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)來發(fā)揮的。與相應(yīng)的癌旁正常組織相比，miR-491-5p在宮頸癌組織中表達顯著下調(diào)。Yuan等[12]研究表明：miR-491-5p通過對MMP-9基因3'-UTRrsl056629A→C多態(tài)位點的結(jié)合，導(dǎo)致MMP-9蛋白表達的增高，從而增加了中國人動脈粥樣硬化性腦梗死發(fā)病風(fēng)險。Sheinerman等[13]研究表明miR-491-5p可作為輕度認知障礙的生物標(biāo)志物之一。Yu等[14]研究數(shù)據(jù)表明了miR-491的過表達能抑制CD8+和CD4+T細胞增殖，促進細胞凋亡，抑制CD8+T細胞產(chǎn)生IFN-γ。

本實驗通過實時定量PCR的方法檢測ITP初發(fā)患者外周血單個核細胞中miR-491-5p的表達水平，與健康體檢對照組相比，在ITP初發(fā)患者中顯著上調(diào)(P<0.01)；并且miR-491-5p的表達水平與ITP初發(fā)患者外周血血小板計數(shù)呈現(xiàn)負相關(guān)。這些均提示miR-491-5p可能參與ITP的發(fā)病過程，并且與其嚴重程度相關(guān)。另外我們對ITP初發(fā)患者治療后跟蹤調(diào)查還發(fā)現(xiàn)，完全緩解組經(jīng)治療后miR-491-5p的表達水平顯著低于其初診時miR-491-5p的表達水平，而未完全緩解組miR-491-5p的表達水平則基本未改變，這也提示miR-491-5p參與了ITP免疫功能的恢復(fù)及病情緩解。miRNA-491-5p是如何參與ITP的發(fā)病機制，通過作用于哪個靶基因及作用的具體通路有待于我們進一步研究。

我們的研究顯示miRNA-491-5p在ITP初發(fā)病人中表達增高，可作為ITP早期的診斷標(biāo)志物，并為后期ITP的診斷、治療和預(yù)后提供新的突破口。

[1] Bartel DP．MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function[J]．Cell，2004，116(2)：281-297．

[2] Zhang B，Wang Q，Pan X．MicroRNAs and their regulatory roles in animals and plants[J]．J Cell Physiol，2007，210(2)：279-289．

[3] Gommans WM，Berezikov E．Controlling miRNA regulation in disease[J]．Methods Mol Biol，2012(822)：1-18．

[4] Rodeghiero F，Stasi R，Gernsheimer T，et al．Standardization of terminology，definitions and outcome criteria in immune thrombocytopenic purpura of adults and children：report from an international working group[J]．Blood，2009，113(11)：2386-2393．

[5] 葉 辛，石 磊，谷明莉，等．原發(fā)性免疫性血小板減少癥患者顆粒溶素、顆粒酶B、穿孔素的表達及臨床意義[J]．現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2014，29(1)：20-23．

Ye X，Shi L，Gu ML，et al．Expression of granzyme B，granulysin and perforin form patients with primary immune thrombocytopenia[J]．Journal of Modern Laboratory Medicine，2014，29(1)：20-23．

[6] Qian BH，Ye X，Zhang L，et al．Increased miR-155 expression in peripheral blood mononuclear cells of primary immune thrombocytopenia patients was correlated with serum cytokine profiles[J]．Acta Haematol，2015，133(3)：257-263．

[7] Sui T，Ma L，Li X，et al．Plasma microRNA profile in immune thrombocytopenia：screening and verification[J]．National Medical Journal of China，2014，94(14)：1083-1086．

[8] Bay A，Coskun E，Oztuzcu S，et al．Plasma microRNA profiling of pediatric patients with immune thrombocytopenic purpura[J]．Blood Coagul Fibrinolysis，2014，25(4)：379-383．

[9] 中華醫(yī)學(xué)會血液學(xué)分會止血與血栓學(xué)組．成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識 (2016年版)[J]．中華血液學(xué)雜志，2016，37(2)：89-93．

Thrombosis and Hemostasis Group，Hematology Society,Chinese Medical Association．Consensus of Chinese experts on diagonsis and treatment of adult primary immune thrombocytopenia(version 2016)[J]．Chinese Journal of Hematology，2016，37(2)：89-93．

[10] Gong F，Ren P，Zhang Y，et al．MicroRNAs-491-5p suppresses cell proliferation and invasion by inhibiting IGF2BP1 in non-small cell lung cancer[J]．Am J Transl Res，2016，8(2)：485-495．

[11] Zhao Q，Zhai YX，Liu HQ，et al．MicroRNA-491-5p suppresses cervical cancer cell growth by targeting hTERT[J]．Oncol Rep，2015，34(2)：979-986．

[12] Yuan M，Zhan Q，Duan X，et al．A functional polymorphism at miR-491-5p binding site in the 3'-UTR of MMP-9 gene confers increased risk for atherosclerotic cerebral infarction in a Chinese population[J]．Atherosclerosis，2013，226(2)：447-452．

[13] Sheinerman KS，Tsivinsky VG，Abdullah L，et al．Plasma microRNA biomarkers for detection of mild cognitive impairment：biomarker validation study[J]．Aging,2013，5(12)：925-938．

[14] Yu T，Zuo QF，Gong L，et al．MicroRNA-491 regulates the proliferation and apoptosis of CD8(+) T cells[J]．Sci Rep，2016(6)：30923．