林 墾，馬 靜，王美蘭，李正才，婁 凡，毛志勇，張鐵松，阮 標(biāo)

(1.昆明市兒童醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科，昆明 650228；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，昆明 650000)

SLC26A4基因位于人類染色體7q31，其mRNA全長(zhǎng)4 930 bp，含21個(gè)外顯子，開放閱讀框架2 343 bp，編碼780個(gè)氨基酸Pendrin。SLC26A4基因突變可導(dǎo)致常染色體隱性耳聾和Pendred綜合征。非綜合征型耳聾占所有遺傳性耳聾的70%，這其中80%為常染色體隱性遺傳。大前庭導(dǎo)水管綜合征(enlarge vestibular aqueduct syndrome，EVAS)是常染色體隱性遺傳性耳聾的常見類型。EVAS的發(fā)生與SLC26A4基因突變關(guān)系密切。云南目前少數(shù)民族聾病的分子遺傳學(xué)的病因研究報(bào)道相對(duì)較少。本文針對(duì)云南地區(qū)白族、彝族非綜合征型耳聾患者檢測(cè)SLC26A4基因編碼區(qū)的核苷酸序列變化，探索聾病的分子病因，為少數(shù)民族聾病的遺傳咨詢和預(yù)防提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象：采集2010年1月～2016年5月昆明市兒童醫(yī)院耳鼻喉科門診散發(fā)的234例白族、彝族中度、重度以上的非綜合征型耳聾患者外周血，提取DNA。所有患兒經(jīng)過(guò)臨床檢查均確診為非綜合征性中度、重度以上的感音神經(jīng)性聾。包括132例白族，女性46例，男性86例，年齡10月～18歲；102例彝族，男性63例，女性39例，平均年齡8月～18歲。該研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)決議通過(guò)，家屬簽署知情同意書。

1.1.2 主要儀器和試劑：ABI 3730XL測(cè)序儀，美國(guó)ABI9700 PCR儀，Mass ARRAY微量點(diǎn)樣系統(tǒng)以及試劑盒，美國(guó)Sequenom公司的Mass ARRAY DNA質(zhì)譜陣列基因分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料采集：通過(guò)監(jiān)護(hù)人及本人掌握被檢測(cè)者的病史及家族史資料，其內(nèi)容包括耳聾病史、家族史、聾兒出生史、個(gè)人史(耳毒性藥物應(yīng)用情況、頭部外傷史)等。對(duì)所有耳聾患者進(jìn)行全面的臨床檢查(顳骨CT和頭顱MRI檢查)和聽力學(xué)評(píng)估(耳聲發(fā)射、聽性腦干誘發(fā)電位)，并抽取外周靜脈血5ml以進(jìn)行基因組DNA的制備及基因突變篩查。

1.2.2 飛行時(shí)間質(zhì)譜(time of flight mass spectrometry，TOF-MS)技術(shù)檢測(cè)：采集患者5 ml外周靜脈血液樣本行備用檢測(cè)，對(duì)樣本提取DNA后行定量和純度檢測(cè)，引物擴(kuò)增和延伸，利用蝦堿式磷酸酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行處理，以去除擴(kuò)增反應(yīng)中剩余的dNTP，產(chǎn)物純化，去除鹽離子。實(shí)驗(yàn)過(guò)程及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)由華大基因公司協(xié)助完成。

2 結(jié)果

2.1 TOF-MS檢測(cè) 云南地區(qū)白族、彝族非綜合征型耳聾人群中SLC26A4基因突變頻率最高的位點(diǎn)為IVS7-2A>G，突變峰圖見圖1。

IVs7-2A→G純合突變 IVs7-2A→G雜合突變

2.2 基因突變情況 132例白族、102例彝族非綜合征型耳聾患者SLC26A4基因總突變率分別為9.09%和11.76%，其突變位點(diǎn)和突變方式見表1。281C→T，589G→A，1226G→A，1975G →C，2162C→T，2168A→G位點(diǎn)在白族、彝族被檢人群中未發(fā)現(xiàn)有突變。

2.3 影像學(xué)檢查 顳骨薄層高分辨率CT及頭顱MRI檢查，針對(duì)篩查出SLC26A4基因突變的患者進(jìn)行影像學(xué)結(jié)果分析，對(duì)應(yīng)其CT及MRI結(jié)果顯示約42%的患者有前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大及內(nèi)淋巴囊擴(kuò)大(見圖2)，24例SLC26A4基因突變患者中有10例顳骨CT顯示雙側(cè)前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大及內(nèi)淋巴囊擴(kuò)大。

3 討論

大量研究表明前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大性耳聾與SLC26A4基因突變有密切相關(guān)。71.9%的大前庭導(dǎo)水管綜合征患者中可以發(fā)現(xiàn)SLC26A4基因突變，2%的正常人可攜帶SLC26A4基因突變，其影像學(xué)檢查結(jié)果多顯示前庭導(dǎo)水管或內(nèi)淋巴囊擴(kuò)大[1]。但耳聾基因突變?cè)诓煌N族、不同地域有很大的差異[2]。因此研究云南地區(qū)少數(shù)民族耳聾患者易感基因的突變有重要意義。居住相對(duì)集中的白族和彝族人口基數(shù)大，取材相對(duì)其他少數(shù)民族較易，故針對(duì)白族和彝族耳聾人群基因進(jìn)行調(diào)查分析。

表1 132例白族、102例彝族非綜合征型耳聾患者SLC26A4基因突變情況(例)

注：突變率是IVs7-2A→G與1229C→T的和/132而來(lái)。

圖2 A圖為CT示左側(cè)前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大明顯；B圖為MRI顯示左側(cè)內(nèi)淋巴囊擴(kuò)大

SLC26A4基因在中國(guó)突變頻率最高的類型是IVS7-2A>G(純合)[3]，IVS7-2A>G(雜合)[4](也稱作c.919-ZA>G)位于外顯子8剪切位點(diǎn)的位置，即內(nèi)含子7的3’末端，其突變使前體mRNA不能正常剪接，外顯子8整個(gè)丟失，外顯子7和外顯子9直接相連，從而導(dǎo)致Pendrin的翻譯發(fā)生移框或提前終止，影響Pendrin的結(jié)構(gòu)和功能。袁永一等[5]在對(duì)263例大前庭導(dǎo)水管患者進(jìn)行SLC26A4基因熱點(diǎn)突變區(qū)域篩查方案探討時(shí)發(fā)現(xiàn)，除了已知的IVS7-2A>G外，中國(guó)人群中SLC26A4基因熱點(diǎn)突變還包括IVSl5+5G→A，281C→T，2027T→A，589G→A，1174A→T，2168A→G，1226G→A，1229C→T，1975G→C，2162C→T。SLC26A4基因突變可導(dǎo)致前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大或伴其它內(nèi)耳畸形。前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大綜合征患者其SLC26A4基因在不同地區(qū)和國(guó)家突變類型也不盡相同。該研究應(yīng)用飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)云南地區(qū)白族、彝族非綜合征型耳聾人群SLC26A4基因的11個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行篩查，與其它基因檢測(cè)方法比較，具有高通量、準(zhǔn)確、覆蓋率高、低成本等特點(diǎn)[7]。發(fā)現(xiàn)白族、彝族非綜合征型耳聾人群SLC26A4基因突變的主要位點(diǎn)是IVS7-2A>G。其SLC26A4基因純合突變的患者在聽力障礙方面發(fā)病時(shí)間不一，聽力損失水平也有極大的個(gè)體差異[8]，并且部分患者顳骨CT及MRI顯示前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大及內(nèi)淋巴囊擴(kuò)大，這在前庭導(dǎo)水管綜合征的分子病因及影像學(xué)診斷有高度一致性，對(duì)篩查出SLC26A4基因純合突變、復(fù)合雜合突變的患者進(jìn)行聽力指導(dǎo)有重要意義。陳鑫蘋等[8]報(bào)道的IVS7-2A>G突變其顳骨CT前庭導(dǎo)水管的影像學(xué)表現(xiàn)并不一致，可能在致聾病因中，存在其他基因突變可能。針對(duì)此種情況，本研究就影像確診為前庭導(dǎo)水管綜合征，而未明確SLC26A4分子病因的患者，需進(jìn)一步行直接測(cè)序，篩查是否存在新的突變位點(diǎn)，以待發(fā)現(xiàn)少數(shù)民族SLC26A4基因新的突變特征。本研究采用的是對(duì)常見的目的基因進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)發(fā)現(xiàn)少數(shù)民族耳聾基因新的突變位點(diǎn)存在缺陷，但是通過(guò)收集的病例檢測(cè)證實(shí)IVS7-2A>G也是白族、彝族的主要突變位點(diǎn)。王艷莉等[9]在寧夏336例非綜合征型聾學(xué)生中檢測(cè)到IVS7-2A>G和2168A>G(H723R)等位基因頻率分別為 9.08%和2.98%；賈婧杰等[10]在山東省濱州特教學(xué)校78名重度聾學(xué)生中檢測(cè)到SLC26A4 IVS7-2A>G的攜帶率為5.13%。本次研究白族SLC26A4基因IVS7-2A>G突變率6.06%，彝族SLC26A4基因IVS7-2A>G突變率5.88%，未檢出2168A>G(H723R)突變，IVS7-2A>G其突變率接近國(guó)內(nèi)報(bào)道水平。由于耳聾病因?qū)W非常復(fù)雜，涉及的相關(guān)基因也非常之多，需要更多的臨床數(shù)據(jù)歸類總結(jié)。本次數(shù)據(jù)結(jié)果是針對(duì)昆明市兒童醫(yī)院耳鼻喉科門診就診的散發(fā)白族、彝族耳聾患者，在今后的研究中需進(jìn)一步補(bǔ)充數(shù)據(jù)。在臨床中針對(duì)篩查出攜帶致聾基因突變的人群，對(duì)其婚配、用藥和聽力損失防護(hù)等方面可進(jìn)行很好的干預(yù)和指導(dǎo)[11]。

[1] 戴 樸，韓東一，馮 勃，等．大前庭水管綜合征的基因診斷和SLC26A4基因突變分析[J]．中國(guó)耳鼻咽喉頭頸外科，2006，13(5)：303-307．

Dai P，Han DY，F(xiàn)eng B，et al．Genetic testing for the enlarged vestibular aqueduct syndrome and mutation analysis of the SLC26A4 gene[J]．Chinese Archives of Otolaryngology-Head and Neck Surgery，2006，13(5)：303-307．

[3] 戴 樸，朱秀輝，袁永一，等．Pendred綜合征基因熱點(diǎn)突變篩查赤峰市聾啞學(xué)校大前庭水管綜合征患者[J]．中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2006，41(7)：497-500．

Dai P，Zhu XH，Yuan YY，et al．Patients suffered from enlarged vestibular aqueduct syndrome in Chi-feng deaf and dumb school detected by Pendred’s syndrome gene hot spot mutation screening[J]．Chinese Journal of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery，2006，41(7)：497-500．

[4] Yang JJ，Tsai CC，Hsu HM，et al．Hearing loss associated with enlarged vestibular aqueduct and Mondini dysplasia is caused by splice-site mutation in the PDS gene[J]．Hear Res，2005，199(1-2)：22-30．

[5] 袁永一，王國(guó)建，黃德亮，等．大前庭水管相關(guān)SL-C26A4基因熱點(diǎn)突變區(qū)域篩查方案探討[J]．中華耳科學(xué)雜志，2010，8(3)：292-295．

Yuan YY，Wang GJ，Huang DL，et al．Screening stra-tegies for SLC26A4 gene hot spot mutation regions in patients with enlarged vestibular aqueduct in China[J]．Chinese Journal of Otology，2010，8(3)：292-295．

[6] 曾 云，姜 丹，馮大飛，等．飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)在非綜合征型耳聾基因檢測(cè)中的應(yīng)用[J]．中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2013，48(12)：985-990．

Zeng Y，Jiang D，F(xiàn)eng DF，et al．Application of MALDI-TOF-MS in gene testing for non-syndromic hearing loss[J]．Chinese Journal of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery，2013，48(12)：985-990．

[7] 王翠翠，戴 樸，韓東一．微創(chuàng)人工耳蝸植入術(shù)后殘余聽力保留的效果觀察[J]．中華耳科學(xué)雜志，2013，11(3)：375-379．

Wang CC，Dai P，Han DY．Preservation of residual hearing after minimally invasive cochlear implantation[J]．Chinese Journal of Otology，2013，11(3)：375-379．

[8] 陳鑫蘋，符 征，符生苗，等．海南地區(qū)非綜合征遺傳性耳聾四個(gè)常見基因突變的分析[J]．現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014．29(5)：34-37．

Chen XP，F(xiàn)u Z，F(xiàn)u SM，et al．Study the mutation screening of GJB3，GJB2，mtDNA，SLC26A4，gene in hainan population with non-syndromic hearing impairment[J]．Journal of Modern Laboratory Medicine，2014，29(5)：34-37．

[9] 王艷莉，朱一鳴，劉曉雯，等．寧夏回族自治區(qū)336例非綜合征型耳聾患者分子遺傳病因?qū)W分析[J]．中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2012，47(9)：760-763．

Wang YL，Zhu YM，Liu XW，et al．Analysis of the hereditary etiology of 336 patients with non-syndromic sensorineural hearing loss from Ningxia Hui Autonomous Region of China[J]．Chinese Journal of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery，2012，47(9)：760-763．

[10] 賈婧杰，袁永一，戴 樸，等．山東省濱州市特教學(xué)校耳聾學(xué)生分子病因?qū)W分析[J]．中華耳科學(xué)雜志，2010，8(4)：407-410．

Jia JJ，Yuan YY，Dai P，et al．Molecular etiology analysis among students with profound hearing loss in a special education school in Shandong[J]．Chinese Journal of Otology，2010，8(4)：407-410．

[11] Schimmenti LA，Warman B，Schleiss MR，et al．Evaluation of newborn screening bloodspot-based genetic testing as second tier screen for bedside newborn hearing screening[J]．Genet Med，2011，13(12)：1006-1010．