宋雅蕓,羅倉(cāng)學(xué),邵明亮

(陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,陜西西安 710021)

馬鈴薯渣發(fā)酵生產(chǎn)活性蛋白飼料的研究

宋雅蕓,羅倉(cāng)學(xué)*,邵明亮

(陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,陜西西安 710021)

以馬鈴薯渣為原料,選用啤酒酵母、面包酵母和黑曲霉為出發(fā)菌種,探究原料滅菌與不滅菌、菌種配伍及其比例對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品中真蛋白含量、酸性蛋白酶活和纖維素酶活的影響。結(jié)果表明:發(fā)酵原料不滅菌處理?xiàng)l件下,菌種配伍以黑曲霉和啤酒酵母組合最佳,且比例為1∶1時(shí),發(fā)酵完成后發(fā)酵產(chǎn)品中真蛋白含量最高,可達(dá)17.87%,較未發(fā)酵前提高171.17%;酸性蛋白酶活和纖維素酶活可達(dá)1187.93 U/g和61.77 U/g,可見利用馬鈴薯渣制備一定生物活性的蛋白飼料是可行的。

馬鈴薯渣,固態(tài)發(fā)酵,蛋白飼料,活性蛋白

馬鈴薯在加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量的下腳料,據(jù)統(tǒng)計(jì),2009年我國(guó)馬鈴薯產(chǎn)量超過8×107t,其中約10%用于淀粉加工,產(chǎn)生5×106t左右的薯渣[1]。新鮮薯渣含水量高達(dá)90%以上,其主要成分包括纖維素、半纖維素、淀粉、果膠、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽等[2-3],且自帶菌種繁多,若得不到及時(shí)有效地處理,微生物極易滋生導(dǎo)致腐敗酸臭,既影響原料利用率,又造成環(huán)境污染[4-5]。全國(guó)五成以上馬鈴薯淀粉生產(chǎn)廠家因此被環(huán)保部門強(qiáng)制停產(chǎn)整改,故資源化利用馬鈴薯薯渣已成為馬鈴薯淀粉加工業(yè)亟待解決的問題。目前,馬鈴薯渣已被研究人員用來(lái)生產(chǎn)燃料酒精、提取果膠、制備酶制劑等[1,6-8]。其中利用微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)蛋白飼料是實(shí)現(xiàn)馬鈴薯渣資源有效利用的重要途徑之一。

近年來(lái),利用馬鈴薯渣發(fā)酵生產(chǎn)菌體蛋白飼料已多被報(bào)道,大部分研究多集中在原料滅菌處理后如何提高蛋白質(zhì)含量上[9-11],而對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中酶等活性成分[12]和發(fā)酵過程中發(fā)酵產(chǎn)物間相互作用的研究卻不多。因此本實(shí)驗(yàn)以馬鈴薯渣為原料,麩皮為輔料,在適當(dāng)添加氮源的條件下,探究原料滅菌與不滅菌、菌種配伍及其比例對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品真蛋白含量、酸性蛋白酶活和纖維素酶活的影響,為資源化利用馬鈴薯渣、工業(yè)化生產(chǎn)蛋白飼料提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鈴薯干渣 由陜西省定邊縣源澤農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司提供;麩皮 市售;黑曲霉C27、啤酒酵母B186、面包酵母B11 均由陜西省微生物研究所提供;福林酚試劑 購(gòu)自Sigma公司;干酪素、L-酪氨酸 均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;尿素、硫酸銨、硼酸、硫酸銅、硫酸鉀、3,5-二硝基水楊酸等 均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純。

MA35快速水分測(cè)定儀 上海賽多利斯貿(mào)易有限公司;DK-98馬弗爐 天津市泰斯特儀器有限公司;K9840半自動(dòng)凱氏定氮儀 濟(jì)南海能儀器股份有限公司;LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ-2F超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;XSY-1散落熒光顯微鏡 重慶光學(xué)儀器廠;ZWY-100H恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;GH-420ASB隔水式培養(yǎng)箱、101-2HSB電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京科偉永興儀器有限公司;755B紫外可見光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司。

表1 馬鈴薯干渣主要成分

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 測(cè)定方法 水分:水分測(cè)定儀測(cè)定;真蛋白:硫酸銅沉淀法[13]和凱氏定氮法(GB5009.5-2010);淀粉:酶水解法(GB/T 5009.9-2008);粗纖維:過濾法(GB/T 6434-2006);果膠:氯化鈣沉淀法(GB/T 10742-2008);灰分:(GB5009.4-2010);脂肪:索式抽提法(GB/T 5009.6-2003);還原糖:DNS比色法[14];酸性蛋白酶活:福林法(GB/T 28715-2012);纖維素酶活:DNS比色法(NY/T 912-2004)。

1.2.2 發(fā)酵種子液的制備 挑取一環(huán)經(jīng)傳代活化的斜面菌種于麥芽汁液體培養(yǎng)基中,在28 ℃、150 r/min搖床中動(dòng)態(tài)培養(yǎng),(黑曲霉24 h,酵母菌12 h),培養(yǎng)結(jié)束后得種子液,用無(wú)菌生理鹽水10倍梯度稀釋種子液,經(jīng)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),測(cè)得面包酵母和啤酒酵母孢子數(shù)為106個(gè)/mL,黑曲霉為108CFU/mL。

1.2.3 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備 馬鈴薯渣粉碎過40目篩,馬鈴薯渣∶麩皮=80∶20[15],尿素2%,硫酸銨1.5%[16],加入發(fā)酵原料質(zhì)量1.5倍[10-11]的水混合,攪拌至使分散均勻且無(wú)塊狀,分裝備用。

1.2.4 原料滅菌與不滅菌處理對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響 在經(jīng)滅菌處理(121 ℃,20 min)和未滅菌處理的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別接種黑曲霉、啤酒酵母和面包酵母種子液,接種量為10%[16-17](v/w),以自然發(fā)酵的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照,各實(shí)驗(yàn)平行三組,28 ℃培養(yǎng)120 h,每8～10 h進(jìn)行翻料,發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵產(chǎn)物于45 ℃下烘干,粉碎過60目篩,測(cè)定真蛋白含量、酸性蛋白酶活和纖維素酶活。

1.2.5 菌種配伍實(shí)驗(yàn) 參照1.2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果,對(duì)薯渣進(jìn)行處理后,采用黑曲霉∶啤酒酵母=1∶1、黑曲霉∶面包酵母=1∶1和黑曲霉∶啤酒酵母∶面包酵母=1∶1∶1三種不同的菌種配伍方式接種發(fā)酵。接種順序采用1.2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果,總接種量為10%(v/w),以自然發(fā)酵的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照,28 ℃培養(yǎng)120 h,每8～10 h進(jìn)行翻料。發(fā)酵過程中每隔24 h取一次樣,樣品于45 ℃條件下烘干,粉碎后過60目篩,分別測(cè)定還原糖含量、真蛋白含量、酸性蛋白酶活以及纖維素酶活。

1.2.6 菌種比例實(shí)驗(yàn) 分別設(shè)定黑曲霉與啤酒酵母比例為1∶4、2∶3、1∶1、3∶2、4∶1,接種于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上。接種順序采用1.2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果,總接種量為10%(v/w),以自然發(fā)酵的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照,在28 ℃培養(yǎng)120 h,每8～10 h進(jìn)行翻料。發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵產(chǎn)物于45 ℃下烘干,粉碎過60目篩,分別測(cè)定真蛋白含量、酸性蛋白酶活和纖維素酶活。

1.2.7 結(jié)果計(jì)算 酸性蛋白酶活和纖維素酶活的發(fā)酵增率、接菌增率以及不滅菌增率參照真蛋白各增率計(jì)算方法。

發(fā)酵增率Δf(%)=發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量-未發(fā)酵原料中真蛋白含量/未發(fā)酵原料中真蛋白含量×100

接菌增率Δi(%)=發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量-自然發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量/自然發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量×100

不滅菌增率Δs(%)=不滅菌處理發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量-滅菌處理發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量/滅菌處理發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品同時(shí)做三次平行實(shí)驗(yàn),采用Origin8.0和SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用ANOVA進(jìn)行LSD、S-N-K和Duncan差異分析,以p<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯干渣主要成分分析

表1測(cè)定結(jié)果顯示,馬鈴薯干渣中淀粉、粗纖維、果膠、脂肪含量較高,分別為27.27%、18.36%、17.42%和12.99%,而真蛋白含量較低,僅為4.67%,由此可見薯渣的可利用價(jià)值高,但營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較低。

2.2 原料滅菌與不滅菌處理對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

2.2.1 原料滅菌與不滅菌處理對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量的影響 發(fā)酵原料經(jīng)滅菌和不滅菌兩種方式處理后,結(jié)果見表2。經(jīng)滅菌和不滅菌處理的原料自然發(fā)酵后,發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量較未發(fā)酵前分別提高15.17%和67.22%。原料經(jīng)滅菌處理,接種啤酒酵母、面包酵母、黑曲霉后,發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量較未發(fā)酵原料提高19.73%～166.06%,接種引起的真蛋白增率在3.95%～130.96%;原料經(jīng)不滅菌處理,接種啤酒酵母、面包酵母、黑曲霉后,發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量較未發(fā)酵原料提高135.36%～145.98%,接種引起的真蛋白增率在31.03%～47.10%。

表2 原料滅菌與原料不滅菌發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量及其增率

注:未發(fā)酵原料真蛋白含量為6.59%。

表3 原料滅菌與不滅菌發(fā)酵產(chǎn)物中酸性蛋白酶活及其增率

注:未發(fā)酵原料酸性蛋白酶活為32.98 U·g-1。

表4 原料滅菌與不滅菌發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素酶活及其增率

注:未發(fā)酵原料纖維素酶活為12.56 U·g-1。不滅菌比滅菌處理的發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量增加-7.53%～96.58%,其中不滅菌處理的原料接種啤酒酵母和面包酵母后發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量高于滅菌處理,其原因可能是啤酒酵母和面包酵母不能直接利用薯渣中的高分子糖類[18],而薯渣自身所攜帶和翻料階段混入的雜菌部分可以直接利用薯渣原料,因此不滅菌處理的薯渣真蛋白含量相對(duì)較高;而滅菌處理的原料接種黑曲霉后發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量高于不滅菌處理,其原因可能是黑曲霉可以直接利用薯渣進(jìn)行生長(zhǎng)代謝[19],不滅菌處理的薯渣原料自身所攜帶和翻料階段混入的雜菌可能會(huì)抑制黑曲霉的生長(zhǎng),從而導(dǎo)致真蛋白含量降低。

2.2.2 原料滅菌與不滅菌對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物酸性蛋白酶活的影響 由表3可知,經(jīng)滅菌和不滅菌處理的原料自然發(fā)酵后,發(fā)酵產(chǎn)物中酸性蛋白酶活較未發(fā)酵原料分別提高27.41%和90.35%。原料經(jīng)滅菌處理接種啤酒酵母、面包酵母、黑曲霉后,發(fā)酵產(chǎn)物中酸性蛋白酶活較未發(fā)酵原料提高41.51%～144.46%,接種引起的酸性蛋白酶活增率在11.07%～111.23%;原料經(jīng)不滅菌處理,接種啤酒酵母、面包酵母、黑曲霉后,發(fā)酵產(chǎn)物中酸性蛋白酶活較未發(fā)酵原料提高888.53%～1381.17%,接種引起的酸性蛋白酶活增率在349.36%～678.09%。不滅菌處理的原料接種啤酒酵母和面包酵母后發(fā)酵產(chǎn)物中酸性蛋白酶活高于滅菌處理,而滅菌處理的原料接種黑曲霉后發(fā)酵產(chǎn)物酸性蛋白酶活高于不滅菌處理,造成以上不同的原因可能與2.2.1發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白變化的原因相似。

2.2.3 原料滅菌與不滅菌對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素酶活的影響 表4顯示,在自然發(fā)酵條件下原料經(jīng)滅菌和不滅菌處理后發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素酶活較未發(fā)酵原料分別提高42.51%和95.38%。原料經(jīng)滅菌處理,接種啤酒酵母、面包酵母、黑曲霉后,發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素酶活較未發(fā)酵原料提高37.81%～435.99%,接種引起的纖維素酶活增率在-3.29%～276.09%;原料經(jīng)不滅菌處理,接種啤酒酵母、面包酵母、黑曲霉后,發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素酶活較未發(fā)酵原料提高337.89%～340.76%,接種引起的纖維素酶活增率在32.93%～125.59%。原料不滅菌接種啤酒酵母和面包酵母后發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素酶活高于滅菌原料,原料滅菌處理接種黑曲霉后發(fā)酵產(chǎn)物纖維素酶活高于不滅菌處理,造成以上差異的原因可能是發(fā)酵原料自身攜帶的雜菌產(chǎn)纖維素酶能力強(qiáng)于啤酒酵母和面包酵母,導(dǎo)致不滅菌薯渣中纖維素酶活較高,而黑曲霉可代謝纖維素酶,發(fā)酵原料自身攜帶和翻料階段混入的雜菌可能抑制黑曲霉生長(zhǎng)代謝,從而纖維素酶活降低。

綜合考慮單菌發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量、酸性蛋白酶活和纖維素酶活,接種啤酒酵母和面包酵母的發(fā)酵原料,不滅菌均優(yōu)于滅菌處理,而對(duì)于黑曲霉,發(fā)酵原料經(jīng)滅菌處理稍高于不滅菌處理。根據(jù)微生物種群效應(yīng)理論,當(dāng)優(yōu)勢(shì)菌群達(dá)到一定比例時(shí)會(huì)抑制其它雜菌生長(zhǎng),結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)中不滅菌處理可以簡(jiǎn)化整個(gè)工藝流程、減少設(shè)備投資、降低能耗,最終選擇不滅菌處理原料。

就單菌利用馬鈴薯渣能力而言,黑曲霉直接利用馬鈴薯渣的能力遠(yuǎn)高于啤酒酵母和面包酵母,因此要進(jìn)一步提高蛋白飼料的品質(zhì)需要對(duì)菌種進(jìn)行配伍,且接種順序?yàn)?先接種黑曲霉后接種啤酒酵母和面包酵母。

2.3 不同菌種配伍發(fā)酵產(chǎn)物隨發(fā)酵時(shí)間動(dòng)態(tài)變化規(guī)律

不同菌種配伍中各菌間相互作用存在差異,組合之間協(xié)同共生會(huì)促進(jìn)微生物生長(zhǎng)代謝,反之抑制微生物生長(zhǎng),因此研究不同菌種配伍發(fā)酵過程中還原糖含量、真蛋白含量、酸性蛋白酶活和纖維素酶活以確定最優(yōu)菌種組合。

2.3.1 不同菌種配伍還原糖含量隨發(fā)酵時(shí)間動(dòng)態(tài)變化 還原糖作為黑曲霉和酵母菌生長(zhǎng)代謝不可或缺的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),其含量的高低會(huì)直接影響菌體產(chǎn)物的合成[20]。由圖1可知,接種黑曲霉∶啤酒酵母=1∶1和黑曲霉∶面包酵母=1∶1的發(fā)酵原料在發(fā)酵過程中還原糖含量變化基本同步,發(fā)酵24～48 h內(nèi)還原糖含量迅速增加,48～96 h之間還原糖含量不斷下降,96 h后還原糖逐漸累積。上述變化可能與菌體的生長(zhǎng)周期有關(guān),發(fā)酵24～48 h黑曲霉處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,菌體增殖最快,代謝產(chǎn)生大量淀粉酶、纖維素酶、果膠酶等多種酶系[21-22],薯渣中淀粉、纖維素、果膠等大分子糖被分解,還原糖含量因此增加;48 h后黑曲霉和酵母分別進(jìn)入穩(wěn)定期,菌體量均達(dá)到最大,發(fā)酵原料中還原糖大量被利用,消耗量大于生成量,還原糖含量降低;96 h后黑曲霉和酵母均進(jìn)入衰亡期,還原糖生成量漸漸高于消耗量,還原糖開始積累。三菌配伍與雙菌配伍所得發(fā)酵產(chǎn)物中還原糖變化趨勢(shì)基本相同,不同的是前者72 h前還原糖含量始終在增加,究其原因可能是同時(shí)接入的啤酒酵母和面包酵母之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系使得二者適應(yīng)期延長(zhǎng)。相對(duì)于雙菌和三菌發(fā)酵,自然發(fā)酵在發(fā)酵過程中還原糖含量變化較小,表明空氣和發(fā)酵原料中所攜帶的雜菌在發(fā)酵周期內(nèi)直接利用馬鈴薯渣中高分子糖能力較弱。

圖1 不同菌種配伍還原糖隨發(fā)酵時(shí)間動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic change of reducing sugar content in fermentation products by inoculating different strains combination with the fermentation time

2.3.2 不同菌種配伍真蛋白含量隨發(fā)酵時(shí)間動(dòng)態(tài)變化 由圖2可知,按三種不同菌種配伍接種,整個(gè)發(fā)酵過程中發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量變化規(guī)律基本相同,整體上隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)真蛋白不斷累積,表現(xiàn)為24～72 h之間真蛋白含量增加較快,72～96 h增加較平緩,96 h后又明顯增加。分析其原因可能是黑曲霉在24～48 h處于對(duì)數(shù)期,該階段發(fā)酵原料中還原糖含量迅速增加(見2.3.1),從而促進(jìn)黑曲霉和酵母的生長(zhǎng)增殖,導(dǎo)致此階段真蛋白含量增加;在發(fā)酵48～96 h,黑曲霉和酵母分別進(jìn)入穩(wěn)定期,此時(shí)發(fā)酵原料中菌體量達(dá)到最大,原料中還原糖被大量利用,合成大量菌體蛋白,同時(shí)原料中部分蛋白被降解成氨基酸,在48～72 h蛋白生成量可能稍高于消耗量,而72～96 h蛋白增長(zhǎng)量基本和消耗量持衡,使發(fā)酵產(chǎn)品中真蛋白含量在此階段先緩慢上升后基本不變;96 h后,黑曲霉和酵母菌均進(jìn)入衰亡期,活菌數(shù)量銳減,蛋白消耗量隨之降低,從而菌體蛋白得到大量積累。相對(duì)于接種發(fā)酵,自然發(fā)酵在整個(gè)發(fā)酵過程中真蛋白含量始終較低,表明空氣和發(fā)酵原料中所攜帶的雜菌利用薯渣生產(chǎn)蛋白效率不高。

圖2 不同菌種配伍真蛋白含量隨發(fā)酵時(shí)間動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamic change of true protein content in fermentation products by inoculating different strains combination with the fermentation time

發(fā)酵結(jié)束后以黑曲霉∶啤酒酵母=1∶1配伍發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量最高,可達(dá)17.40%±0.31%,其次為黑曲霉∶面包酵母=1∶1和黑曲霉∶啤酒酵母∶面包酵母=1∶1∶1,分別為16.71%±0.38%和15.9%±0.26%,自然發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量最低,僅為12.02%±0.19%。

2.3.3 不同菌種配伍酸性蛋白酶活隨發(fā)酵時(shí)間動(dòng)態(tài)變化 圖3顯示,在整個(gè)發(fā)酵過程中,接種發(fā)酵產(chǎn)物中酸性蛋白酶活總體高于自然發(fā)酵,表現(xiàn)為隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),酸性蛋白酶活均逐漸上升,變化趨勢(shì)相近,分析原因可能是隨著黑曲霉和酵母生長(zhǎng)代謝,酸性蛋白酶逐漸積累,使得酶活不斷增強(qiáng)。而自然發(fā)酵過程中發(fā)酵產(chǎn)物中酸性蛋白酶活呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),且增加幅度較小,這說(shuō)明自然發(fā)酵中薯渣被利用率低。

圖3 不同菌種配伍酸性蛋白酶活隨發(fā)酵時(shí)間動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic change of acid protease activity in fermentation products by inoculating different strains combination with the fermentation time

發(fā)酵結(jié)束后以黑曲霉∶啤酒酵母=1∶1配伍發(fā)酵產(chǎn)物中酸性蛋白酶活最高,高達(dá)(1046.79±30.11) U/g,其次為黑曲霉∶面包酵母=1∶1和黑曲霉∶啤酒酵母∶面包酵母=1∶1∶1,分別為(897.29±7.57) U/g和(816.38±23.15) U/g,自然發(fā)酵產(chǎn)物最低,僅為(62.39±18.66) U/g。

2.3.4 不同菌種配伍纖維素酶活隨發(fā)酵時(shí)間動(dòng)態(tài)變化 由圖4可知,三組不同菌種配伍在發(fā)酵過程中發(fā)酵產(chǎn)物中的纖維素酶活變化趨勢(shì)相近,均表現(xiàn)為逐漸增加,且與2.3.3酸性蛋白酶活變化規(guī)律相似。其原因可能是酸性蛋白酶酶解產(chǎn)生菌體必需的氨基酸,纖維素酶酶解得到低分子量的碳源,它們含量的適度增加可能會(huì)促進(jìn)菌體生長(zhǎng)代謝,從而正反饋調(diào)節(jié)菌體分泌更多的酶。但在整個(gè)過程中雙菌配伍產(chǎn)纖維素酶活能力均要高于三菌配伍,引起的原因可能是黑曲霉代謝纖維素酶將原料中的纖維素降解為低分量糖,這些糖部分被酵母利用,從而一定程度上解除黑曲霉的底物反饋抑制,促進(jìn)纖維素酶產(chǎn)生,而對(duì)于三菌配伍,啤酒酵母和面包酵母可能存在競(jìng)爭(zhēng)作用減弱了與黑曲霉的協(xié)同生長(zhǎng),導(dǎo)致三菌配伍發(fā)酵產(chǎn)品中纖維素酶活較低。相對(duì)于接種發(fā)酵,自然發(fā)酵過程中纖維素酶活變化較小,前后僅提高12.99 U/g,這說(shuō)明自然發(fā)酵中薯渣被利用率低。

圖4 不同菌種配伍纖維素酶活隨發(fā)酵時(shí)間動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic change of cellulose activity in fermentation products by inoculating different strains combination with the fermentation time

發(fā)酵結(jié)束后,以接種黑曲霉∶面包酵母=1∶1的發(fā)酵產(chǎn)品中纖維素酶活力最高,達(dá)(63.05±0.20)U/g,其次為黑曲霉∶啤酒酵母=1∶1,黑曲霉∶啤酒酵母∶面包酵母=1∶1∶1,分別為(61.75±0.41)、(56.85±0.31) U/g,自然發(fā)酵產(chǎn)物纖維素酶活最小,僅有(25.55±0.06) U/g。

在整個(gè)發(fā)酵過程中,以發(fā)酵產(chǎn)品中真蛋白含量、酸性蛋白酶活、纖維素酶活為評(píng)價(jià)指標(biāo),黑曲霉和啤酒酵母協(xié)同作用最為顯著,因此需要對(duì)兩菌比例進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

2.4 不同菌種比例對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

2.4.1 不同菌種比例對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量的影響 由圖5可知,發(fā)酵120 h后,黑曲霉與啤酒酵母接種比例不同對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量影響差異顯著(p<0.05)。其中接種黑曲霉∶啤酒酵母=1∶1的發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量最高,高達(dá)17.87%±0.22%,較自然發(fā)酵產(chǎn)物提高40.38%;其次為黑曲霉∶啤酒酵母=2∶3和黑曲霉∶啤酒酵母=3∶2,真蛋白含量分別為16.77%±0.05%和15.14%±0.19%,較自然發(fā)酵產(chǎn)物分別提高了31.74%和18.93%;而自然發(fā)酵產(chǎn)物中僅為12.73%±0.11%,明顯低于其它接種發(fā)酵組(p<0.05),表明黑曲霉和啤酒酵母的接種比例在一定范圍內(nèi)與發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量存在一定聯(lián)系:當(dāng)黑曲霉接種比例較小時(shí),黑曲霉代謝產(chǎn)生的纖維素酶、淀粉酶、糖化酶等分解高分子糖類[23-24]的酶量相應(yīng)減少,導(dǎo)致發(fā)酵基質(zhì)中的可直接利用碳源不足,從而限制菌體蛋白的合成;當(dāng)黑曲霉的接種比例較大時(shí),發(fā)酵基質(zhì)中可直接利用碳源產(chǎn)生量增大,但當(dāng)存在于薯渣培養(yǎng)基中的還原糖含量過高時(shí)會(huì)過分加速菌體的呼吸,導(dǎo)致培養(yǎng)基中通氣量不足,反而抑制微生物的生長(zhǎng)[25]。

圖5 不同雙菌比例對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量的影響Fig.5 Effect of different proportions of two strains on the protein content of fermentation products注:不同小寫字母代表差異顯著(p<0.05);圖6、圖7同。

2.4.2 不同菌種比例對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物酸性蛋白酶活的影響 由圖6可以看出,當(dāng)接種黑曲霉∶啤酒酵母=3∶2時(shí),產(chǎn)物中酸性蛋白酶活最高,其次為黑曲霉∶啤酒酵母=2∶3和黑曲霉∶啤酒酵母=1∶1,分別達(dá)到(1263.16±8.42)、(1204.21±42.11)、(1187.93±15.32) U/g,三者差異不顯著(p>0.05)。當(dāng)黑曲霉∶啤酒酵母=1∶4和黑曲霉∶啤酒酵母=4∶1時(shí),酸性蛋白酶活與其它三組接種發(fā)酵產(chǎn)物相比均差異顯著(p<0.05)。發(fā)酵結(jié)束后,以自然發(fā)酵產(chǎn)物中酸性蛋白酶活最低,僅為(67.37±50.53) U/g,明顯低于接種發(fā)酵產(chǎn)物(p<0.05)。表明當(dāng)黑曲霉與啤酒酵母比例相當(dāng)或相近時(shí),二者可能具有良好的協(xié)同共生長(zhǎng)關(guān)系,更有利于酸性蛋白酶的產(chǎn)生。

圖6 不同雙菌比例對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物酸性蛋白酶活的影響Fig.6 Effect of different proportions of two strains on acid protease activity of fermentation products

2.4.3 不同菌種比例對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物纖維素酶活的影響 由圖7可知,經(jīng)發(fā)酵120 h后,不同菌種比例發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素酶活明顯高于自然發(fā)酵產(chǎn)物(p<0.05),自然發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素酶活僅為(25.82±1.09) U/g。以接種黑曲霉∶啤酒酵母=2∶3發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素酶活最高,可達(dá)(62.25±0.69) U/g,其次為黑曲霉∶啤酒酵母=1∶1,纖維素酶活為(61.77±0.2) U/g,二者差異不顯著(p>0.05)。當(dāng)黑曲霉∶啤酒酵母=1∶4時(shí),發(fā)酵產(chǎn)品中纖維素酶活明顯低于其它接種發(fā)酵組(p<0.05),僅為(46.12±0.2) U/g。造成以上差異的原因可能是黑曲霉比例過低或過高都會(huì)影響發(fā)酵過程中纖維素酶的產(chǎn)生。當(dāng)黑曲霉接種比例較小時(shí)纖維素酶活相應(yīng)較低;當(dāng)黑曲霉接種比例較大時(shí),底物又會(huì)反饋抑制纖維素酶的合成[17],從而酶活降低,因此只有接種適當(dāng)?shù)暮谇贡壤艜?huì)有利于纖維素酶的產(chǎn)生。

圖7 不同雙菌比例對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物纖維素酶活的影響Fig.7 Effect of different proportions of two strains on cellulose activity of fermentation products

3 結(jié)論

以發(fā)酵產(chǎn)品中真蛋白含量、酸性蛋白酶活、纖維素酶活為評(píng)價(jià)指標(biāo),結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)中簡(jiǎn)化生產(chǎn)流程、降低經(jīng)濟(jì)成本問題,選擇原料進(jìn)行不滅菌處理。黑曲霉和酵母(啤酒酵母、面包酵母)雙菌配伍時(shí)存在協(xié)同共生作用,而三菌配伍時(shí)啤酒酵母和面包酵母存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,雙菌配伍協(xié)同作用優(yōu)于三菌配伍,且雙菌發(fā)酵以黑曲霉和啤酒酵母配伍較優(yōu)。菌種最佳比例為黑曲霉∶啤酒酵母=1∶1,發(fā)酵完成后發(fā)酵產(chǎn)品中真蛋白含量高達(dá)17.87%,較未發(fā)酵前提高171.17%,酸性蛋白酶活和纖維素酶活可達(dá)1187.93 U/g和61.77 U/g,可見利用馬鈴薯渣制備一定生物活性的蛋白飼料是可行的。

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Research on production of active protein feed by fermenting potato residue

SONG Ya-yun,LUO Cang-xue*,SHAO Ming-liang

(School of Food and Bioengineering,Shaanxi University of Science and Technology,Xi’an 710021,China)

Potato residue was employed as raw material,and Brewer’s yeast,Baker’s yeast andAspergillusnigerwere chosen to be the starting strains. The aim of this paper was to study the effect of raw material sterilized or not,strain compatibility and proportion on the true protein content,acid protease activity and cellulose activity of fermentation products by solid-state fermentation. The results showed that under raw material without sterilization condition,the compatibility ofAspergillusnigerand Brewer’s yeast with ratio of 1∶1 was the optimal strain combination. The true protein content of fermentation product can reached 17.87%,which was increased by 171.17% compared with that before fermentation. Acid protease activity and cellulose activity reached 1187.93 U/g and 61.77 U/g,respectively. So it is feasible to use the potato residue to produce protein feed with a certain biological activity.

potato residue;solid-state fermentation;protein feed;active protein

2016-06-15

宋雅蕓(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品資源綜合開發(fā)利用，E-mail:444366140@qq.com。

*通訊作者:羅倉(cāng)學(xué)(1959-)，男，教授，研究方向：食品加工及資源綜合開發(fā)利用，E-mail:3577180@163.com。

TS239

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000