仝瑞兵徐勇董樂樂

維生素E對皮瓣缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

仝瑞兵①徐勇①董樂樂①

目的：觀察維生素E對大鼠腹壁淺血管皮瓣缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。方法：利用雌性Wistar大鼠制作腹壁淺血管為蒂的缺血再灌注皮瓣模型并進(jìn)行試驗，將30只Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、生理鹽水組和維生素E組，每組10只。假手術(shù)組不做缺血再灌注處理，維生素E組術(shù)前1 h腹腔注射維生素E 100 mg/kg，生理鹽水組術(shù)前1 h腹腔注射等體積生理鹽水。生理鹽水組和維生素E組于皮瓣缺血2 h再灌注1 h后、假手術(shù)組于術(shù)后3 h，均取皮瓣中段邊緣全層皮瓣組織1 cm×1 cm，檢測丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性，光鏡下觀察病理組織變化。結(jié)果：生理鹽水組MDA含量明顯高于假手術(shù)組和維生素E組，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；生理鹽水組SOD活性明顯低于假手術(shù)組和維生素E，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；假手術(shù)組未見明顯組織創(chuàng)傷改變，生理鹽水組皮瓣組織損傷較明顯，而維生素E組明顯好于生理鹽水組。結(jié)論：維生素E具有抗氧自由基，減輕自由基的脂質(zhì)過氧化作用，對緩解大鼠皮瓣的缺血再灌注損傷起著一定的保護(hù)作用。

維生素E； 皮瓣； 缺血再灌注損傷

First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Baotou Medical College with Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014010，China

隨著現(xiàn)代化工業(yè)和交通運(yùn)輸業(yè)的快速發(fā)展，開放性創(chuàng)傷導(dǎo)致肢體大面積缺損的患者越來越多，對這類創(chuàng)面的治療多采用游離皮瓣移植修復(fù)術(shù)，均取得一定的療效，但術(shù)后皮瓣壞死時有發(fā)生，影響皮瓣成活率。研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注損傷是造成游離皮瓣移植術(shù)后壞死和慢性排異反應(yīng)增加的主要原因之一［1］。因此，探討皮瓣缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制，尋找更加安全有效的治療方法是目前皮瓣外科領(lǐng)域研究的熱點［2-4］。多數(shù)學(xué)者對維生素E治療心、肝、腎及腸道等器官缺血再灌注損傷的研究較多，發(fā)現(xiàn)維生素E對缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用［5-7］；但維生素E是否對皮瓣缺血再灌注損傷也具有保護(hù)作用，尚未見相關(guān)報道。本實驗通過將維生素E腹腔注射的方式作用于大鼠，觀察其對大鼠腹部皮瓣缺血再灌注損傷的影響，為維生素E的臨床應(yīng)用提供實驗和理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1材料與試劑 選用健康成年雌性Wistar大鼠30只，體重200～250 g，購自內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物中心。統(tǒng)一編號后采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組、生理鹽水組和維生素E組，每組10只。主要試劑：維生素E（購自Sigma公司，產(chǎn)品貨號：47783，上海超研生物科技有限公司代理），超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒、丙二醛（MDA）檢測試劑盒、考馬斯亮藍(lán)蛋白檢測試劑盒（購自南京建成生物工程研究所）。

1.2皮瓣設(shè)計與模型制備 根據(jù)Wistar大鼠腹壁淺動脈的解剖關(guān)系，在其右下腹部設(shè)計一個長方形皮瓣，大小為5 cm×3 cm，以腹壁淺血管為蒂。用10%的水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔內(nèi)注射麻醉成功后將大鼠仰臥位固定在鼠臺上，充分暴露腹部，備皮，用標(biāo)記筆在大鼠右下腹皮膚上標(biāo)記5 cm×3 cm大小矩形皮瓣標(biāo)記線，按照Petry等［8］描述的方法進(jìn)行皮瓣手術(shù)操作。沿標(biāo)記線切開皮膚、皮下組織和肌膜層，在肌膜下層與肌肉層之間將皮瓣游離，仔細(xì)分離腹壁淺動靜脈，在腹壁淺血管從股血管發(fā)出處用顯微血管夾夾閉腹壁淺血管，形成皮瓣缺血再灌注模型。

1.3實驗方法 假手術(shù)組：皮瓣造模后，不夾閉腹壁淺血管，皮瓣不做缺血再灌注處理；維生素E組：皮瓣造模后，用15 g顯微血管夾在腹壁淺血管從股血管發(fā)出處夾閉腹壁淺血管，在術(shù)前1 h給予腹腔注射維生素E 100 mg/kg［9］；生理鹽水組：皮瓣造模后，用15 g顯微血管夾阻斷腹壁淺血管，于術(shù)前1 h腹腔注射等體積生理鹽水。假手術(shù)組于皮瓣造模3 h后取皮瓣中段邊緣全層皮瓣組織1 cm×1 cm；生理鹽水組和維生素E組在形成皮瓣缺血模型后，此時開始計時，2 h后將血管夾移除，制造再灌注模型，再灌注1 h后取皮瓣中段邊緣全層皮瓣組織1 cm×1 cm，按照試劑盒的說明步驟測定所取組織中MDA含量，SOD活性及病理組織切片觀察。最后將皮瓣原位縫合，碘伏消毒，術(shù)后石膏繃帶固定大鼠腹部。

1.4觀察指標(biāo) 將取下的皮瓣組織平均分成2份，大小為0.5 cm×1 cm，一份用于MDA含量和SOD活力的測定，另一份放入10%的甲醛液中固定24 h，經(jīng)脫水透明石蠟包埋切片后行HE染色，100倍光鏡下觀察病理組織學(xué)變化。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（）表示，使用單因素方差分析各組間MDA值和SOD值，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組術(shù)后3 h皮瓣組織MDA含量 生理鹽水組術(shù)后3 h皮瓣組織MDA值為（29.2201±1.0036）nmol/g，高于假手術(shù)組的（10.6545±0.7957）nmol/g和維生素E組的（15.6379±0.8037）nmol/g，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2各組術(shù)后3 h皮瓣組織SOD活性 生理鹽水組術(shù)后3 h皮瓣組織活性為（32.4182±0.8428）U/mgprot，低于假手術(shù)組的（59.6048±1.0241）U/mgprot和維生素E組的（57.9427±1.1803）U/mgprot，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3各組皮瓣病理組織學(xué)觀察 假手術(shù)組未見明顯組織創(chuàng)傷改變，結(jié)構(gòu)排列正常；生理鹽水組標(biāo)本中可見皮下有大量出血，組織內(nèi)毛細(xì)血管輕度瘀血，膠原纖維斷裂明顯，組織間有炎性細(xì)胞侵潤，部分肌纖維變性，組織水腫；維生素E組僅可見組織間少量炎性細(xì)胞侵潤，未見組織的明顯破壞。

3　討論

維生素E是生育酚類化合物的總稱，是苯并二氫呋喃的衍生物，它能把自己氧化成生育醌，能使脂質(zhì)過氧化自由基生成化學(xué)性質(zhì)不活潑的脂質(zhì)過氧化物，使脂類過氧化的連鎖反應(yīng)中斷，從而有效抑制過氧化作用，保護(hù)細(xì)胞免受多不飽和脂肪酸（PUFA）氧化所產(chǎn)生的毒性物質(zhì)的傷害［10］。維生素E能產(chǎn)生酚氧基，后者能夠猝滅并能同單線態(tài)氧反應(yīng)，這樣就保護(hù)了PUFA不受單線態(tài)氧的氧化損傷，同時陰離子自由基和羥自由基還可以氧化酚氧基，使PUFA免受自由基攻擊，從而有效地抑制脂肪酸的自動氧化。

目前，關(guān)于維生素E在多種組織器官缺血再灌注損傷中清除自由基保護(hù)組織細(xì)胞的研究有很多。Canbaz等［11］研究發(fā)現(xiàn)，維生素E對心臟缺血再灌注損傷有保護(hù)作用；翟健華等［12］通過動物實驗研究證實心肌在缺血再灌注損傷時，自由基代謝異常，給予維生素E治療后，通過提高超氧化物歧化酶（SOD）水平，降低丙二醛（MDA）含量，可減輕氧自由基對心肌組織的損傷和脂質(zhì)過氧化作用，保護(hù)心肌組織；趙文波等［13］制作大鼠左半肝缺血再灌注模型，研究認(rèn)為，維生素E對肝臟缺血再灌注損傷起保護(hù)作用；張偉等［14］通過對維生素E在青年和老年大鼠腎臟缺血再灌注損傷中的作用研究，認(rèn)為維生素E可通過增加SOD水平，提高自由基清除能力，對大鼠腎臟缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用?？傊?，維生素E是通過清除自由基和限制超氧化物及活性氧的生成水平而發(fā)揮其抗氧化作用的。皮瓣移植后局部組織缺血、缺氧，微循環(huán)障礙進(jìn)而形成微血栓、白細(xì)胞介導(dǎo)的感染、氧自由基釋放導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷等因素，導(dǎo)致皮瓣部分或全部壞死。血液循環(huán)障礙是皮瓣缺血壞死和缺血再灌注損傷的始動因素［15-16］。因此，血液循環(huán)的重建是皮瓣成活的基礎(chǔ)，值得關(guān)注的是近年來的研究表明，皮瓣移植后的缺血、缺氧導(dǎo)致局部組織內(nèi)環(huán)境紊亂、氧自由基產(chǎn)生增多及細(xì)胞內(nèi)鈣超載對皮瓣的損傷，也是影響皮瓣成活的重要因素［17-18］。

在本研究中，生理鹽水組大鼠皮瓣缺血再灌注后MDA值為（29.2201±1.0036）nmol/g，明顯高于假手術(shù)組，表明大鼠皮瓣缺血再灌注時組織中產(chǎn)生大量的氧自由基，它的化學(xué)性質(zhì)非常活潑，氧化作用極強(qiáng)，能攻擊脂質(zhì)和生物膜與膜結(jié)構(gòu)中的PUFA，引起強(qiáng)烈的毒性反應(yīng)，從而損傷皮瓣組織，這種毒性反應(yīng)的最大特點是以連鎖反應(yīng)的形式進(jìn)行，維生素E可以進(jìn)入組織細(xì)胞，具有抗自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的作用［19-20］。同時大量氧自由基可引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，形成脂性自由基和脂質(zhì)過氧化物（LPO），LPO的含量可反映組織中自由基的含量和脂質(zhì)過氧化的程度，MDA是LPO的終產(chǎn)物，所以測定MDA含量可以間接反映皮瓣缺血再灌注后自由基對組織的損傷程度［21］。正常機(jī)體內(nèi)有自由基不斷產(chǎn)生，同時又有正常清除機(jī)制發(fā)揮作用，所以不會形成自由基的大量堆積而造成機(jī)體損害，但是在再灌注損傷時，機(jī)體消耗了大量的抗自由基的酶類及抗氧化劑，這樣就使它們清除自由基的能力顯得捉襟見肘，最終可導(dǎo)致自由基生成增多損傷組織細(xì)胞［22-23］。維生素E組MDA值為（15.6379±0.8037）nmol/g，明顯低于生理鹽水組，表明維生素E可以減輕缺血再灌注時氧自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用，降低皮瓣組織再灌注時MDA的活性，對皮瓣缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。這與維生素E可以減少氧自由基生成及清除氧自由基的抗氧化作用機(jī)制有關(guān)。李暉等［24］通過對家兔肢體缺血再灌注損傷的研究，證實維生素E可以顯著減低再灌注后MDA的含量，對肢體缺血再灌注損傷具有明顯的保護(hù)作用，這與本實驗中維生素E可以降低大鼠皮瓣組織中MDA的量研究結(jié)果一致。

生理鹽水組大鼠皮瓣缺血再灌注后SOD值為（32.4182±0.8428）U/mgprot，明顯低于假手術(shù)組，說明皮瓣缺血再灌注后SOD逐漸失活，喪失了其清除氧自由基的能力，失去其保護(hù)作用。SOD是體內(nèi)一種最主要的氧自由基清除劑，是天然抗氧化酶。SOD對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基（O2-·），保護(hù)細(xì)胞免受損傷。SOD活性的高低可間接反映出機(jī)體清除自由基的能力，抗氧化劑的缺乏可使氧自由基的水平升高，故測量SOD的活性可反映組織內(nèi)自由基水平和脂質(zhì)過氧化作用的程度［25-29］。維生素E組SOD值為（57.9427±1.1803）U/mgprot，明顯高于生理鹽水組，表明維生素E可明顯提高SOD活性，對氧自由基的產(chǎn)生起了明顯的抑制作用，對皮瓣缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用，這與SOD能特異性地清除超氧陰離子自由基的抗氧化作用機(jī)制有關(guān)。蔡虹靜等［9］利用大鼠腎臟缺血再灌注模型研究證實，維生素E能減輕腎臟的缺血再灌注損傷，并通過增強(qiáng)SOD活性，清除氧自由基，減輕脂質(zhì)過氧化作用，對腎臟缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，這與本實驗中維生素E可以提高大鼠皮瓣組織中SOD活性水平研究結(jié)果一致。

綜上所述，筆者認(rèn)為維生素E可降低MDA含量，提高SOD活性，有效抑制氧自由基的產(chǎn)生，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和自由基對生物膜的損傷，對皮瓣缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。在皮瓣移植術(shù)前，預(yù)先給予腹腔注射維生素E可以明顯減輕術(shù)后皮瓣的壞死程度。

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Protective Effect of Vitamin E on Rat Flaps with Ischemia-reperfusion Injury/

TONG Rui-bing，XU Yong，DONG Le-le.//Medical Innovation of China，2016，13（26）：020-023

Objective：To investigate the protective effect of vitamin E on rat flaps with ischemiareperfusion injury.Method：A total of 30 healthy female Wistar rats were used to establish ischemia-reperfusion injured skin flap along superficial epigastricartery，all rats were randomly divided into the sham-surgery group，vitamin E group and the saline group，each group had 10 rats.The ischemia-reperfusion injury was not induced in the sham-surgery group，an intraperitioneal injection of vitamin E（100 mg/kg） was given in the vitamin E group one hour before operation，saline（the same volume） was given in the saline group one hour before operation. Distal tissue was selected from skin flap（middle edge flap full-thickness flap tissue 1 cm×1 cm） in both vitamin E group and saline group 2 hour after ischemia 1 hour after reperfusion，as well as in the sham-surgery group 3 hours after operation to measure superoxide dismutase（SOD） and malonaldehyde（MDA） contents，pathological tissue changes were observed under light microscope.Result：The MDA content in the saline group were significantly higher than those of the sham-surgery group and vitamin E group，the differences were statistically significant （P＜0.05）.The SOD activity in the saline group were significantly lower than those of the sham-surgery group and vitamin E group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.The sham-surgery group had no obvious change of tissue trauma，the saline group flap tissue had more obvious damage，the vitamin E group was significantly better than that of the saline group.Conclusion：Vitamin E can resist lipid peroxidation of free radicals，and play an important protective role in alleviating skin flap ischemia-reperfusion injury.

Vitamin E； Flap； Ischemia-reperfusion injury

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.26.006

2016-05-12） （本文編輯：李穎）

①內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 內(nèi)蒙古 包頭014010

仝瑞兵