王勇 曹艷杰 張文革

摘要：為了提高放線菌BOS-018代謝產(chǎn)物中有效代謝物質(zhì)濃度，得到更多的活性成分，并提高其抑菌活性，采用響應(yīng)面法來(lái)優(yōu)化放線菌BOS-018的液體發(fā)酵條件。先通過(guò)單因素試驗(yàn)確定最佳單因素，再運(yùn)用Plackett-Burman試驗(yàn)對(duì)影響發(fā)酵的幾個(gè)因素進(jìn)行評(píng)價(jià)并篩選出3個(gè)最主要因素，即溫度、接種量和裝液量。經(jīng)最陡爬坡試驗(yàn)，最后運(yùn)用Box-Behnken設(shè)計(jì)得到這3個(gè)因素的最佳值為：溫度27.74 ℃，接種量13.26 mL，裝液量102.07 mL。優(yōu)化后，抑菌圈直徑達(dá)到22.12 mm，相對(duì)于優(yōu)化前提高36.7%。

關(guān)鍵詞：放線菌；發(fā)酵優(yōu)化；響應(yīng)面法；Plackett-Buman試驗(yàn)；最快爬坡試驗(yàn)；Box-Behnken試驗(yàn)

中圖分類號(hào)： TQ920.6文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0458-03

放線菌具有非常高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，能產(chǎn)生多種多樣的抗菌物質(zhì)。到目前為止，食品、工業(yè)、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)上有許多成功的抗生素的使用實(shí)例[1]。從放線菌中提取有效的抗菌物質(zhì)來(lái)抑制黃瓜枯萎病成為一條安全、有效的途徑，放線菌BOS-018的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)黃瓜枯萎菌有較明顯的抑制作用。放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化是工業(yè)生產(chǎn)中非常重要的，是從實(shí)驗(yàn)室到工業(yè)生產(chǎn)中不可缺少的環(huán)節(jié)[2]。響應(yīng)面法在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中是一種常用方法，準(zhǔn)確、高效且分析性強(qiáng)[3-4]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用響應(yīng)面法中的Plackett-Burman設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)、Box-Behnken設(shè)計(jì)來(lái)對(duì)BOS-018菌株的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，應(yīng)用Design-Expert.V.8.0.6軟件對(duì)條件進(jìn)行二階數(shù)值模型分析，獲得回歸方程，效果顯著[5]。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株供試菌株：放線菌菌株BOS-018 （從長(zhǎng)白山針葉林土壤中分離、篩選并保存）。指示菌株：黃瓜枯萎病菌，由遼寧科技大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2培養(yǎng)基固體保存培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；液體發(fā)酵培養(yǎng)基：高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1菌株的活化和抑菌物質(zhì)的測(cè)定將實(shí)驗(yàn)室保存的BOS-018菌種接種于高氏一號(hào)斜面固體培養(yǎng)基上，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，進(jìn)行菌株活化。然后用接種環(huán)將菌種從斜面培養(yǎng)基接到250 mL三角瓶中，三角瓶中放入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，然后放置在恒溫振蕩器上振蕩培養(yǎng)，振蕩器溫度為28 ℃，轉(zhuǎn)速為140 r/min。將放線菌菌株BOS-018接種于高氏一號(hào)液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，根據(jù)不同的發(fā)酵培養(yǎng)條件培養(yǎng)后，將菌液在無(wú)菌條件下離心15 min，離心條件為4 000 r/min。然后把無(wú)菌濾紙片在離心所得的上清液中浸泡3 min后置于已接種黃瓜枯萎病菌的PDA培養(yǎng)基平板中央，于28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)7 d后，再分別測(cè)量抑菌圈直徑，確定最佳發(fā)酵條件[6]。

1.2.2響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件

1.2.2.1單因素試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)依次對(duì)培養(yǎng)基、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、裝液量、接種量、pH值等液體發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行逐一優(yōu)化。每個(gè)處理重復(fù)3次，平均3次試驗(yàn)的值。然后按照上面的方法對(duì)致病真菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，找到能產(chǎn)生最大抑菌圈的單因素發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。

1.2.2.2Placket-Burman（P-B）設(shè)計(jì)試驗(yàn)[7]在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取N=9的P-B試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，將影響 BOS-018 發(fā)酵的9個(gè)因素作為P-B設(shè)計(jì)的主要成分。將高水平（1）設(shè)定為低水平（-1）的1.25～1.50倍，抑菌圈直徑作為響應(yīng)值Y。表1為P-B設(shè)計(jì)試驗(yàn)。數(shù)據(jù)采用 SPSS 17. 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，分別對(duì)數(shù)據(jù)作單因子方差分析，以P<0.05 表示差異顯著。選出影響抑菌圈直徑的3個(gè)顯著因子。

1.2.2.3Box-Behnken（B-B）試驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素試驗(yàn)及P-B試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)整個(gè)發(fā)酵模型影響最大的3個(gè)顯著因子進(jìn)行響應(yīng)面分析，利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)因素3個(gè)水平，5個(gè)重復(fù)的中心點(diǎn)。響應(yīng)面分析試驗(yàn)以顯著因素為自變量，以抑菌圈直徑為響應(yīng)值，來(lái)確定各因素對(duì)致病真菌的影響。

1.2.3[JP3]模型的驗(yàn)證試驗(yàn)為了進(jìn)一步驗(yàn)證響應(yīng)面法所得預(yù)測(cè)值，將優(yōu)化后所得最佳預(yù)測(cè)值進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)均設(shè)3個(gè)重復(fù)，取平均值。比較試驗(yàn)所得值和預(yù)測(cè)值，來(lái)確定采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的發(fā)酵條件是否準(zhǔn)確可靠、是否具有實(shí)用價(jià)值。

2結(jié)果與分析

2.1Placket-Burman試驗(yàn)結(jié)果與分析

Placket-Burman試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表2，表中數(shù)據(jù)采用SPSS 17. 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理后，得到各因素的主要效應(yīng)和顯著性，結(jié)果見表3。由表3可知，影響液體發(fā)酵的3個(gè)最顯著因素分別是溫度、接種量和裝液量，它們的Pr值均小于005，說(shuō)明這個(gè)回歸模型是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的，這3個(gè)因素的影響都是顯著的。

2.2最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果與分析

由Plackett-Burman試驗(yàn)?zāi)軌蚩闯?，放線菌BOS-018液體發(fā)酵條件優(yōu)化中溫度、接種量、裝液量3個(gè)因素對(duì)抗生素的產(chǎn)量有顯著影響，其中溫度和接種量有顯著的正效應(yīng)，應(yīng)增加，裝液量有顯著的負(fù)效應(yīng)，應(yīng)減少。根據(jù)3個(gè)因素效應(yīng)大小比例以及方程中各變量的系數(shù)關(guān)系設(shè)定它們的變化方向及步長(zhǎng)進(jìn)行試驗(yàn)[8]

2.3Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)來(lái)確定試驗(yàn)因素和水平。試驗(yàn)與結(jié)果如表5。

通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)出17組試驗(yàn)，見表6。按照試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，預(yù)測(cè)出抑菌圈直徑最大值所對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵因子范圍[9]。

3結(jié)論

發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化在微生物發(fā)酵產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化過(guò)程當(dāng)中非常重要。Plackett-Burman （P-B） 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法在微生物發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化和發(fā)酵工藝關(guān)鍵參數(shù)的篩選中被廣泛應(yīng)用，可以快速有效地篩選出對(duì)目標(biāo)值影響最大的關(guān)鍵因子[10-11]。

本試驗(yàn)運(yùn)用響應(yīng)面法中的Plackett-Burman設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)、Box-Behnken設(shè)計(jì)來(lái)優(yōu)化放線菌BOS-018的液體發(fā)酵條件。利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)來(lái)確定顯著效應(yīng)因素為培養(yǎng)溫度、接種量和裝液量。利用最陡爬坡試驗(yàn)來(lái)確定3個(gè)顯著效應(yīng)因子的變化方向和步長(zhǎng)，Box-Behnken試驗(yàn)確定最優(yōu)值為培養(yǎng)溫度27.74 ℃，接種量13.26 mL，裝液量102.07 mL。模型預(yù)測(cè)的抑菌圈Y值為22.12 mm，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果為23 mm，相對(duì)誤差為3.82%。試驗(yàn)結(jié)果表明模型預(yù)測(cè)與驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果基本一致，用該模型可以合理、有效地預(yù)測(cè)Y值，為進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

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